CC BY
56
О Коллектив авторов, 1994 УДК 616.155.392-092.4:578.828
Л. С. Яковлева, К. В. Ильин, И. В. Раковская,
А. Ф. Быковский, П. О. Ильинский, В. Э. Гурцевич
НЕФЕРМЕНТИРУЮЩАЯ МИКОПЛАЗМА КАК ПРИЧИНА НЕОЖИДАННОГО ЦИТО-ПАТИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА, ВЫЯВЛЕННОГО ПРИ ИЗУЧЕНИИ IN VITRO ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ РЕТРОВИРУСОВ ТИПА С И D
НИИ канцерогенеза, Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН (Москва)
Т-клеточный лейкоз взрослых (ATL), ассоциированный с ретровирусом типа С — HTLV-1, имеет длительный инкубационный период и возникает у незначительного числа вирусоносителей. Т. Okamoto и соавт. [20] на основании статистического анализа и математического моделирования пришли к выводу, что хотя HTLV-1 и играет первичную роль в патогенезе ATL, особенности развития заболевания указывают на участие и других факторов. Эти факторы неизвестны, но одним из них может быть дополнительная вирусная инфекция. Особый интерес вызывают представители семейства ретровирусов, так как в многочисленных исследованиях на мышах показано, что в результате рекомбинации между различными по патогенности вариантами ретровирусов могут возникнуть de novo варианты с повышенной патогенностью и активностью [6, 8, 10].
Ретровирус типа D впервые выделен от человека в 1991 г. [7]. Однако возможность такой инфекции предполагалась 20 лет назад, когда вирус был обнаружен в стабильных линиях опухолевых клеток человека [2, 12, 14]. Позднее антигены вируса были выявлены в образцах фиброаденом молочных желез человека [3]. Описаны как единичные случаи серологической реактивности к ним сывороток человека [11, 17, 21], так и эндемичные очаги [18]. Роль ретровируса D в патологии человека неизвестна, но подобный вирус обезьяньего происхождения вызывает у обезьян иммунодефицитный синдром [9, 16].
Целью настоящего исследования являлось выяснение влияния вируса типа D на HTLV-1, а именно на продукцию белков in vitro и на эффективность синцитиоб-разования.
Материалы и методы. К лето ч н ы е культуры и вирусы. Лимфобластоидные Т-клеточные линии, хронически продуцирующие HTLV-1: C91/pl, HUT-102h МТ-2ине инфицированная HTLV-1 линия Jurkat, а также В-клеточная линия Jijoye получены из международного агентства по изучению рака (МАИР, Лион, Франция). В-клеточные линии ЛЛУ и 13 получены Л. С. Яковлевой. Первая — из лимфатических узлов больной лимфоаденопатией, вторая — из клеток периферической крови донора крови. Все перечисленные выше культуры суспензионные и росли в среде RPMI-1640 с добавлением 10—15% сыворотки эмбрионов коров и 200 мг/мл гентамицина при температуре 37° С в атмосфере 5% СОг. Монослойная клеточная линия карциномы гортани человека Нер-2, спонтанно продуцирующая ретровирус типа D, названный Hep-2v [2, 12, 13, 17]. Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки.
Инфицирование лимфобластоидных культур вирусом Hep-2v. В качестве источника вируса использовали пропущенную через фильтр Millipor 0,22 мМ вирусосодержащую культуральную жидкость (КЖ) 3-дневной культуры Нер-2, в которой суспендировали осажденные центрифугированием (10 мин при 1000 об/мин) клетки из расчета 10 клеток на 5 мл КЖ. После контакта в течение часа при комнатной температуре клетки осаждали и затем ресуспен-дировали в среде роста. Присутствие Hep-2v в инокуляте определяли одним из перечисленных ниже методов. Количество живых и мертвых клеток подсчитывали с интервалом 1 —3 дня в присутствии трипанового синего, который окрашивает мертвые клетки.
L. S. Yakovleva, K. V. Ilyin, I. V. Rakovskaya,
A. F. Bykovsky, P. O. Ilyinsky, V. E. Gurtsevich
NON-FERMENTATIVE MYCOPLASMA AS A SOURCE OF UNEXPECTED CYTOPATHIC ACTION DISCOVERED IN IN VITRO STUDY OF INTERACTION OF RETROVIRUSES C AND D
Research Institute of Cracinogenesis, CRC RAMS, N.F.Gamaleya Institute of Epidemiology and Microbiology, RA MS, Moscow
Adult T-cell leukemia (ATL) associated with type C retrovirus HTLV-1 has a long latency and occurs in an inconsiderable number of virus carriers. Basing on statistical analysis and mathematical simulation T.Okamoto et al. [20] came to the conclusion that although HTLV-1 plaid a significant part in ATL pathogenesis, some features of the disease development suggested contribution of other factors. These factors are not known, but an additional viral infection might participate in the process. Of much interest in this respect may be the family of retroviruses, because numerous studies on mice show that recombination of retroviral variants different in pathogenicity may result in de novo variants with increased pathogenicity and activity [6,8,10].
Type D retrovirus was first isolated from humans in 1991 [7]. But the possibility of infection caused by this virus was predicted 20 years ago, when the virus was found in stable human tumor cell lines [2,12,14]. Later virus antigens were discovered in specimens of human breast fibrous adenoma [3]. There are reports both about single cases of serological reactivity of human serum with the virus [11,17,21] and about endemic foci [18]. The role of type D retrovirus in human pathology is not known, but a similar simian virus causes the immmunodeficiency syndrome in monkeys [9,16].
The purpose of this investigation was to reveal the effect of type D virus on HTLV-1, particularly on in vitro protein production and on efficiency of syncytium formation.
Materials and Methods. Cell cultures and viruses Lym-phoblastoid T-cell lines chronically producing HTLV-1, i.e. C91/pl, HUT-102 and MT-2, and HTLV-1-free line Jurkat, B-cell line Jijoye supplied by the International Agency for Research of Cancer (IARC, Lyon, France). B-cell lines LLU and 13 derived by L.S.Yakovleva from lymph nodes of patients with lymphadenopathy and from donors’ peripheral blood cells, respectively. All the cultures were of suspended cell type grown in RPMI-1640 medium with 10-15% fetal calf serum and 200 mg/ml gentamycin at 37°C in 5% CO2 air. Human laryngeal carcinoma monolayer cell line Hep-2, producing spontaneously type D retrovirus, referred to as Hep-2v [1,12,13,17]. The cells were cultured in DMEM with 10% serum.
Infection of 1 y mp hobl as t o i d cultures with H e p - 2 v virus. The source of the virus was virus-containing culture liquid (CL) taken from 3-day Hep-2 culture precipitated by centrifugation (10 min at 1000 rpm) and filtered through a Millipor 0.22 mM filter. The recepient cells were infected at 10 cells per 5 ml of Hep-2v-containing CL. After 1 -hour contact at room temperature the cells were precipitated by centrifugation to be further resuspended in the growth culture. The presence of Hep-2v in the inoculate was determined by one of the techniques listed below. Live and dead cells were counted at a 1-3 day interval in the presence of trypan blue that stains dead cells.
I mmun ob 1 o11 ing and radioimm unoprecipi ta-tion assay (RIPA). Hep-2 virus protein synthesis in the infected Iymphoblastoid cells was detected by immunoblotting and reactivity in RIPA using serum against p27, a principal structural protein of type D retrovirus. The anti-p27 serum was supplied by the Pfizer Institute (USA). The immunoblotting and RIPA set-up was described elsewhere [17,18]. Hep-2 cells were used as positive control.
Non-Hep-2v infected and Hep-2 infected cells were studied by electron microscopy as described previously [4].
Иммуноблот и радиоиммунопреципитация
(RIPA). Синтез белков вируса Нер-2 в инфицированных им лимфобластоидных клетках определяли в иммуноблотгинге и в реакции RIPA с сывороткой к главному структурному белку ретровируса типа D—р27. Сыворотка анти-р27 получена из Института Pfizer (США). Иммуноблот и RIPA ставили по методике, описанной ранее [17, 18]. В качестве положительного контроля использовали клетки Нер-2.
Электронное микроскопирование неинфицированных и инфицированных вирусом Hep-2v клеток проводили методом, описанным ранее [4]
Выделение микоплазм из клеточных культур на искусственных питательных средах, их культивирование и типирование проводили по методике, описанной ранее [5, 19].
Результаты и обсуждение. При адаптации вируса Hep-2v к размножению в HTLV-1 продуцирующей культуре МТ-2 столкнулись с фактом массовой гибели клеток, которая начиналась на 6—7-й день после инфицирования. В течение последующих 2 дней погибло 85—100% клеток (рис.). При пассажах фильтрованной КЖ из инфицированных культур на клетках МТ-2 цитопатическое действие (ЦПД) регулярно повторялось в те же фоки. Это было неожиданным, так как вирус Hep-2v не оказывал ЦПД на клетки исходной культуры, а также на клетки культур эмбриона человека и почек кролика. К тому же другие исследованные штаммы ретровируса D, вызывая иммунодефицит у обезьян, не приводили к гибели лимфоцитов, и инфицирование ими лимфобластоидных линий человеческого происхождения не сопровождалось ЦПД [9, 16]. Однако нельзя исключить, что штамм Hep-2v в отличие от других изолятов был цитопатогенен для Т-лим-фоцитов или что наблюдаемый эффект мог быть вызван сочетанным действием двух ретровирусов. Поэтому было исследовано действие вируса Hep-2v на клетки других лимфобластоидных культур: Т-клеточных инфицированных (С91/р1, HUT-102) и неинфицированных (Jurkat) вирусом HTLV-1, а также В-клеточных — ЛЛУ, 13 и Jijoye. Эффект был аналогичным с небольшими вариациями в продолжительности гибели клеток, скорее всего связанными с разным темпом их размножения, и неизменно наблюдался при неоднократных повторах (см. рис.). Известно, что такая динамика гибели клеток, если она связана с ЦПД вируса, является следствием его бурного размножения в этих клетках. Однако при исследовании в иммуноблотгинге и в более чувствительной реакции RIPA лимфобластоидных клеток на 4—7-й день после инфицирования вирусом Hep-2v не было выявлено присутствия р27 — главного структурного белка ретровируса THnaD. При электронно-микроскопическом исследовании трех культур на 5-й день после инфицирования в двух из них (HUT-102 и 13) не обнаружено вирусных частиц типа D, в 3-й культуре (МТ-2) они встречались, но крайне редко.
Таким образом, результаты RIPA и иммуноблоттин-га, не выявившие экспрессии белка р27 Hep-2v в инфицированных лимфобластоидных культурах,и результаты электронно-микроскопического исследования, показавшие присутствие единичных, редко встречающихся частиц типа D только в культуре МТ-2, не свидетельствуют об активном размножении вируса и, следовательно, о его причастности к ЦПД.
При многолетних исследованиях вируса Hep-2v и культуры, его продуцирующей, с привлечением различных методов не обнаружена контаминация другими вирусами [2, 12, 13, 17]. В связи с этим была проверена версия о причастности к ЦПД микоплазм. Микоплазмами контаминировано большинство стабильных клеточных линий. Этому способствуют частая контаминация микоплазмами сывороток крупного рогатого скота, используемых при культивировании клеток, широко распространенное микоплазмоносительство среди работников лабораторий, стойкость микоплазм в окружающей среде
Цитопатическое действие культуральной жидкости из культуры Нер-2 на клетки различных лимфобластоидных линий.
По оси абсцисс — дни после инфицирования; по оси ординат — процентное соотношение мертвых клеток.
МТ-2, C91/pl, Jurkat — Т-клеточные культуры; Jijoye, 13, ЛЛУ — В-клеточные культуры.
а — инфицированные инокулятом из культуры Нер-2, Ь — контрольные неинфицированные культуры.
Cytopathic action of culture liquid from Hep-2 culture on cells of various lymphoblastoid lines.
Numbers on the x axis show days following infection; numbers on the у axis show percentage of dead cells.
МТ-2, C91 /pi, Jurkat are T-cell cultures, Jijoye, 13, LLU are В-cell cultures, a, infected with inoculate from Hep-2 culture, b, control intact cultures.
Isolation of mycoplasmas from cell culture on artificial media, their cultivation and typing were carried out according to techniques described elsewhere [5,19].
Results and Discussion. During adaptation of Hep-2v virus to multiplication in HTLV-1 producing culture MT-2 we observed death of a great number of cells starting on day 6-7 following infection. 85 to 100% cells died within the following 2 days (see the figure). The cytopathic action (CPA) was observed repeatedly at the same intervals in passage of the filtered CL from infected culture on cells MT-2. This was unexpected as the virus Hep-2v did not exert CPA either on parental or on human empbryonic and rabbit kidney cell cultures. Besides, other strains of retrovirus D induced immunodeficiency in monkeys without killing lymphocytes, and infection of human lymphoblastoid lines with the strains was not accompanied with CPA [9,16]. However, it is also possible that the strain Hep-2v unlike other isolates was cytopathogenic for T-lymphocytes or that the effect observed could be a result of combined action of the two retroviruses. Therefore we
и аэробный путь передачи инфекции. Микоплазмы, не имея клеточной стенки, очень пластичны, легко меняют форму и проходят через фильтры с диаметром пор 0,22 мМ, к тому же часть популяции имеет меньшие размеры [5,19]. Как правило, микоплазменная контаминация клеточных культур протекает латентно, но они могут также оказывать пролиферативное и литическое действие, иногда оба процесса циклически сменяются. Литическое действие микоплазм может быть следствием конкуренции за источник питания и свойственно в основном ферментирующим видам. Факторы, способствующие переходу латентной инфекции в литическую, часто неясны [5, 15, 19].
Три использованные в данной работе культуры (Нер-2, МТ-2 и Jurkat) были исследованы на инфицированность микоплазмами. Из культур МТ-2 и Нер-2 микоплазмы выделены как из клеток, так и из КЖ. В культуре Jurkat они обнаружены только при микроскопировании клеток, окрашенных краской Hoerst, но выделить их не удалось. В культуре Нер-2 отмечена высокая степень контаминации. Во всех трех культурах микоплазменная инфекция носила латентный характер. Известно, что характер взаимодействия микоплазм с клетками может определяться как видом микоплазм, так и типом клеток. В связи с этим была изучена причастность обнаруженных в культуре Нер-2 микоплазм к ЦПД, наблюдаемому в лимфоблас-тоидных культурах после инфицирования их КЖ из культуры Нер-2. Исследования проводили в 2 направлениях.
1. Выделение микоплазм из клеток Нер-2 на искусственных питательных средах и инфицирование ими лим-фобластоидных культур. Выделенный из культуры Нер-2 изолят микоплазмы (Mycoplasma sp.) скудно рос на искусственных питательных средах, отличаясь при этом однородным типом роста, и не обладал ферментирующими свойствами. По данным серологических исследований, он не относился к широко распространенным видам микоплазм. Однако дальнейшее его типирование ограничивалось возможностью набора диагностических сывороток, имеющихся в нашей стране. После культивирования изолята на искусственной питательной среде им были инфицированы клетки МТ-2 и Jurkat (0,2 мл неразведенной культуры микоплазм на 10 клеток). В культуре Jurkat в 1 из 3 флаконов на 14-й день развилось ЦПД. Доля мертвых клеток при этом составила 48,6% и приблизительно на этом уровне сохранялась до 20-го дня исследования. Фильтьрованной КЖ, взятой из этого флакона на 4-й и 12-й дни, были инфицированы свежие клетки Jurkat. В обоих случаях ЦПД развилось на 12-й день, при этом мертвые клетки составляли 40 и 95% соответственно. Количество мертвых клеток в контрольных культурах не превышало 11%, что свойственно всем хорошо растущим лимфобластоидным культурам. В клетках МТ-2 изолят не вызвал ЦПД, вероятнее всего, из-за недостаточной дозы инокулята ввиду скудного роста изолята на искусственной питательной среде.
2. Деконтаминация культуры Нер-2 от микоплазм с последующей проверкой КЖ на способность вызывать в лимфобластоидных культурах ЦПД. Культура Нер-2 была обработана Mycoplasma removal agent (Dainippon Pharmacental Co LTD in cooperation with CN Biomedical inc. USA) согласно инструкции, рекомендованной фирмой, т. е. 0,1 мл препарата на 10 мл среды в течение 7 дней. КЖ, взятой на 3-й и 8-й дни от начала обработки, были инфицированы клетки Jurkat и МТ-2. ЦПД вызвала только КЖ, собранная на 3-й день обработки. ЦПД развилось на 6-й день после инфицирования, количество
studied Hep-2v activity in cells of other lymphoblastoid cultures, i.e. HTLV-1-infected (C91/pl, HUT-102) and non-HTLV-1-infected (Jurkat) T-cells, as well as in B-cells such as LLU, 13 and Jijoye. The effect was similar with a slight variation in duration of the cell death period most likely associated with different rates of cell proliferation and was observed without fail in repeated assays (see the figure). As is known this mode of cell death, if associated with viral CPA, results from rapid multiplication of the virus in the cells. But neither immunoblotting nor more sensitive RIPA of lymphoblastoid cells on day 4-7 following Hep-2v infection discovered p27 which is a principal structural protein of type D retroviruses. Electron microscopy of the three cultures on day 5 following infection failed to discover type D virions in two (HUT-102 and 13) cultures, in the third culture (MT-2) they were encountered, but just rarely.
Thus, RIPA and immunoblotting failed to find expression of p27 of Hep-2v in the infected lymphoblastoid cultures, while electron microscopy discovered but single type D particles in culture MT-2 only. This does not suggest active multiplication of the virus and, therefore, its contributing to the CPA.
Many year study of Hep-2v and Hep-2v-producing culture by various methods failed to find contamination with other viruses [2,12,13,17]. Therefore we verified the hypothesis of mycoplasma contributing to the CPA. Most stable cell lines are contaminated with mycoplasmas. This is mainly due to frequent mycoplasmic contamination of cattle serum used to culture cells, large number of mycoplasma carriers among laboratory workers, mycoplasma stability in the environment and aerobic route of infection. Mycoplasmas do not have cell walls, and threfore are very flexible, can easily change their shape and penetrate 0.22 mM filters, besides, a part of the population has smaller size [5,19]. The mycoplasmic contamination is as a rule latent, but mycoplasmas are also able of proliferative and lytic activities, sometimes the two processes alternate. The mycoplasmic lytic activity may be due to competition for alimentation sources and is mainly characteristic of fermentative species. Factors fostering transformation of the latent infection into the lytic one are sometimes not clear [5,15,19].
Three cultures used in our investigation (Hep-2v, MT-2 and Jurkat) were tested for mycoplasmic contamination. Mycoplasma was isolated both from cells and CL of MT-2 and Hep-2. In the Jurkat culture it was found by microscopy in cells stained with Hoerst, but we failed to isolate the mycoplasma. Hep-2 was characterized by high degree of contamination. The mycoplasmic infection was latent in all the three cultures. The manner of interaction of mycoplasma and cells is known to be determined both by type of the mycoplasma and type of the cells. Therefore, we studied contribution of mycoplasmas present in the Hep-2 culture to CPA on lymphoblastoid cultures after their infection with CL from Hep-2 culture. The investigation was carried out in two directions.
1. Mycoplasma isolation from Hep-2 cells on artificial media and infection of lymphoblastoid culture with the mycoplasma. The mycoplasma (Mycoplasma sp.) isolate from Hep-2 culture was growing poorly and uniformly on artificial media and did not demonstrate fermentative activity. By serological study it could not be attributed to common mycoplasmic types. But its further typing was limited by diagnostic sera available in this country. After the isolate was cultured on artificial medium we infected with it cells MT-2 and Jurkat (0.2 ml undiluted mycoplasma culture per 10
мертвых клеток составило 51% и в течение последующих нескольких дней увеличилось до 77%. КЖ, собранная после окончания курса деконтаминации, не вызывала ЦПД ни при первичном инфицировании, ни в последующих пассажах, сделанных в интервале в 3 нед.
Таким образом, полученные результаты с достаточно высокой долей вероятности позволяют заключить, что гибель лимфобластоидных культур при внесении в них вируса Нер-2у связана с контаминацией штамма неферментирующим видом микоплазмы. Необычность описанной нами ситуации заключается в том, что неферментирующий вид микоплазмы, выделенный из хронически инфицированных им клеток Нер-2, в лимфобластоидных культурах начинал действовать как высокоактивный цитопатогенный агент, вызывая гибель до 100% клеточной популяции в течение 7—9 дней. Механизм, активирующий действие микоплазм, остается неясным, но сам обнаруженный феномен представляет бесспорный теоретический и практический интерес и требует дальнейшего исследования. Одним из направлений таких исследований может быть изучение сочетанного действия микоплазм, контаминирующих культуру Нер-2 и лимфобластоидные линии.
Интерес придставляет и отмеченное при электронном микроскопировании повышение количества внутри- и внеклеточных, а также почкующихся частиц типа С в НТЬУ-1 продуцирующих клетках МТ-2 и НиТ-102 после инфицирования их микоплазмами из культуры Нер-2. Эти данные согласуются с ранее полученными [1, 4] результатами, которые показали увеличение продукции НТЬУ-1, вирусов лейкоза коров и мышей при некоторых формах микоплаз-мо-ретровирусассоциированных инфекциях.
Наши исследования, принявшие столь неожиданный оборот, предупреждают о том, что при работе с вирусами в стабильных клеточных культурах ЦПД может быть обусловлено микоплазменной контаминацией инокуля-та, которая распознается, к сожалению, только при специальных исследованиях.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Алымбаева Д. В., Миллер Г. Г., Раковская И. В., Быковский А. Ф. И
Вопр. вирусол. — 1985. — № 1. —С. 71—75.
2. Ильин К. В., Быковский А. Ф., Спуре Ж. Ж. II Бюл. экспер. биол. —
1972. — № 2. — С. 86—89.
3. Ильин К. В. И Там же. — 1976. — № 10. — С. 1240—1241.
4. Миллер Г. Г., Раковская И. В. Березин В. Э. // Веста. АМН СССР. —
1991, —№ 5.— С. 36—43.
5. Смирнова Т. Д., Миллер Г. Г., Неустроева В. В., Раковская И. В. II Рекомендации по предупреждению внугрилабораторной контаминации клеточных культур на контаминацию микоплазмами. Ин-т цитологии АН СССР. Науч. техн. совет по проблемам физ.-тех. биол. и биотехн. ГКНТ СССР и АН СССР. — Л., 1987. — С. 9—19.
6. Яковлева Л. С., Ceiuoma Н. Б., Щербак Л. Н. и др. // Вопр. вирусол. — 1988, —№ 5.— С. 614—617.
7. Bohannon R. С., Donehower L. A., Tord R. J. II J. Virol. — 1991. — Vol. 65, № П. —P. 5663—5679.
8. Cloyd М. II Cell. — 1983. — Vol. 32, № 1. — P. 217—225.
9. Daniel M. D., King N. W., Letvin N. L. et al. // Science. — 1984. — Vol. 223. — P. 602—605.
10. Haas V. R.. Patch V. Hi. Virol. — 1980. — Vol. 35, № 3. — P. 583—591.
11. Hunsmarm G., Flugel R. М., Walder R. II Nature (Lond.).— 1990.— Vol. 345.— P. 120.
12. Ilyin К. V., Bykovsky A. F., Zhdanov V. М. II Cancer (Philad.).—
1973. — Vol. 32. — P. 89—96.
13. Ilyin К. V., Morozov V. A., Ilynsky P. O. et al. II J. Tumor. — Marker Oncol. — 1990. — Vol. 5, № 3. — P. 261.
14. Gelderblom II., Bauer II., Ogura H. et al. // Int. J. Cancer. — 1974. — Vol. 13. — P. 246—253.
15. Krause D. C., Chen Yi.-Y. II Infect, and Immun. — 1988. — Vol. 56, № 8. — P. 2054—2059.
16. Maul D. H., Zaiss C. P., Mackenzie M. R. et al. // J. Virol. — 1988. — Vol. 62, № 3. — P. 1768—1773.
cells). In 1 of 3 vials with Jurkat culture CPA was detected on day 14. Percentage of dead cells was 48.6, the level remaining about the same till day 20. We took CL from this vial on days 4 and 12, filtered it and infected fresh Jurkat cells. In both cases CPA developed by day 12, the fraction of dead cells being 40 and 95%, respectively. Percentage of dead cells in control cultures was 11% or lower, which is characteristic of alllymphoblastoid cultures with good growth. The isolate failed to induce CPA in MT-2 cells most likely because inoculation dose was insufficient due to poor growth of the isolate on artificial nutritional medium.
2. Mycoplasma removal from Hep-2 culture with further CL test for ability to induce CPA in lymphoblastoid cultures.
The Hep-2 culture was treated with a Mycoplasma Removal Agent (Dainippon Pharmacental Co Ltd. in cooperation with CN Biomedical Inc., USA) according to the recomendations of the firm, i.e. 0.1 ml agent per 10 ml medium for 7 days. CL taken on days 3 and 8 from treatment was introduced into the Jurkat and MT-2 cells. CPA was induced by the CL harvested on day 3 of treatment only. The CPA was detected on day 6 following infection, the percentage of dead cells being 51% and increasing upto 77% during the following several days. The CL harvested after the decontamination cycle did not induce CPA either after the first infection or during the following passages repeated at 3 week intervals.
Thus, our findings most likely suggest that the death of lymphoblastoid cultures after infection with Hep-2v is associated with contamination of the strain with a non-fermentative mycoplasma species. The situation is unusual because the non-fermentative mycoplasma species isolated from Hep-2 cells chronically infected with the virus started to act as a highly aggressive cytopathic agent that caused up to 100% cellular population death within 7-9 days. The mechanism triggering the mycoplasma activity is unknown, but the phenomenon discovered is undoubtedly of theoretical and practical interest and needs to be studied further. Study of combined effect of mycoplasmas contaminating Hep-2 culture and lymphoblastoid lines may be a subject of further research.
Of interest is also the increase in the number of intra-, extracellular and budding type C fragments in HTLV-1 producing cells MT-2 and HUT-102 after their infection with mycoplasmas from Hep-2 culture discovered by electron microscopy. These findings are in agreement with previous data of G.G.Miller et al. [1,4] who showed augmentation of production of HTLV-1, viruses of cow and mouse leukemias in some mycoplasma-retrovirus-associated infections.
Our study that took such an unexpected turn warns that the CPA detected during manipulations with viruses in stable cellular cultures may be due to contamination of the inoculate with mycoplasma which can unfortunately be recognized by special investigations only.
17. Morozov V. A., Ilyntky P. O., Uckert W. A. et al. // Int. J. Tissue
React. — 1989. — Vol. 11, № 1. — P. 1—5.
18. Morozov V. A., Saal F., Gessain A. et al. // Intervirology. — 1991.
— Vol. 32. — P. 253—257.
19. The Mycoplasmas. Vol. 2 / Eds J. G. Tully, R. F. Whitcomb. — London, 1979. — P. 425—475.
20. Okamoto Т., Ohno Yu., Taugane Sh. et al. // Jap. J. Cancer Res.
— 1989. — Vol. 80, № 3. — P. 191—195.
21. Thiry L., Specher-Goldberger S., Bassens M. et al. // J. gen. Virol.
— 1978. — Vol. 41. — P. 587—597.
Поступила 30.06.92 / Submitted 30.06.92
