Ндотелиальная дисфункция и маркеры сосудисто-тромбоцитарного гемостаза при метаболическом синдроме Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Физико-химическая биология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2012, № 2 (3), с. 216-221

УДК 611.018.74

ЭНДОТЕЛИАЛЬНАЯ ДИСФУНКЦИЯ И МАРКЕРЫ СОСУДИСТО-ТРОМБОЦИТАРНОГО ГЕМОСТАЗА ПРИ МЕТАБОЛИЧЕСКОМ СИНДРОМЕ

© 2012 г. И.Е. Окрут1, Д.А. Шакерова2, Т.А. Веселова2

1 Нижегородская государственная медицинская академия

2 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского

dinara.shakerova@mail.ru

Поступила в редакцию 05.03.2012

В последнее время большой интерес вызывает роль оксида азота в протекании патологий с хроническим или острым воспалением. Недостаточная или избыточная продукция оксида азота характеризует наличие дисфункции эндотелия, ассоциированной с состоянием тромбоцитарного гемостаза, и является главным фактором риска различных заболеваний, в том числе и метаболического синдрома.

Ключевые слова: оксид азота, дисфункция эндотелия, тромбоцитарный гемостаз, метаболический синдром.

Введение

В последнее время диагноз метаболический синдром (МС) все чаще звучит в кабинетах вра-чей-кардиологов и эндокринологов, при этом риск возникновения различных заболеваний сердечно-сосудистой системы возрастает в несколько раз. Актуален поиск эффективных методов диагностики данной патологии. В 1988 г. профессор Джеральд Равен на основании собственных наблюдений и обобщения исследований других авторов выдвинул гипотезу, в соответствии с которой резистентность к инсулину, абдоминальное ожирение, артериальная гипертензия (АГ), атерогенная дислипидемия и ишемическая болезнь сердца (ИБС) служат проявлением патологического состояния, которое он предложил назвать «метаболическим синдромом» [1]. В индустриальных странах распространенность МС среди населения старше 30 лет составляет 10-20%. Ранее считалось, что МС - это удел людей среднего возраста, преимущественно женщин. Однако проведенное под эгидой Американской ассоциации диабета обследование свидетельствует о том, что МС демонстрирует устойчивый рост среди подростков и молодежи.

Эндотелий - внутренняя выстилка сосудов -принимает активное участие в регуляции сосудистого тонуса, вырабатывая различные биологически активные вещества [2]. По своему действию вазоактивные вещества делятся на вазоконстрикторы и вазодилататоры.

Образование вазоактивных веществ в эндотелии регулируется преимущественно двумя

основными механизмами: действием биологически активных веществ (БАВ) и напряжением сдвига.

БАВ, которые действуют на эндотелий, вырабатываются тромбоцитами, лейкоцитами, тучными клетками или активируются в плазме крови, часть веществ синтезируется в самом эндотелии и действует на эндотелиоциты либо после выведения их в кровеносное русло, либо паракринно. Действие на эндотелиоциты БАВ связано с наличием на эндотелиоцитах специфических рецепторов, стимуляция которых вызывает вазодилатацию или вазокострикцию. Воздействие на рецепторы приводит к образованию вторичных медиаторов, которые непосредственно влияют на гладкомышечные клетки сосудов.

МС сопровождается эндотелиальной дисфункцией (ЭД) - нарушением состояния и работы внутренней выстилки сосудов. При ЭД эндотелий вырабатывает завышенное количество оксида азота (NO). Большие количества NO в крови могут образовывать пероксинитрит, который активирует процесс свободнорадикального окисления белков и липидов.

Одной из причин нарушения регионального кровообращения и микроциркуляции является дисфункция эндотелия, которая может приводить к спазму сосудов, усиленному тромбооб-разованию и усиленной адгезии лейкоцитов к эндотелию. Причинами эндотелиальной дисфункции могут быть различные факторы: гипоксия тканей, возрастные изменения, свободнорадикальное повреждение, гипертензия, эндогенные и экзогенные интоксикации. В ши-

роком смысле эндотелиальная дисфункция может быть определена как неадекватное (увеличенное или сниженное) образование в эндотелии различных биологически активных веществ [3]. В последнее время сложилось более узкое представление об эндотелиальной дисфункции как о состоянии эндотелия, при котором имеется недостаточная или избыточная продукция оксида азота. Поскольку оксид азота принимает участие в регуляции практически всех функций эндотелия (регуляция сосудистого тонуса, тромборезистентность сосудов), а кроме того, является фактором, наиболее чувствительным к повреждению, такое представление о дисфункции эндотелия вполне корректно [4]. Но дисфункция эндотелия имеет и другой, не менее важный аспект - нарушения гемостаза.

Пока эндотелий цел, не поврежден, он синтезирует, главным образом, факторы противо-свертывания, являющиеся также вазодилатато-рами [5]. Эти биологически активные вещества препятствуют росту гладких мышц - стенки сосуда не утолщаются, диаметр его не меняется. Кроме того, эндотелий адсорбирует из плазмы крови многочисленные противосвертывающие вещества. Сочетание на эндотелии антикоагулянтов и вазодилататоров в физиологических условиях является основой для адекватного кровотока, особенно в сосудах микроциркуляции [6].

При продолжительном повреждении эндотелия, по мнению многих исследователей, он начинает играть ключевую роль в патогенезе ряда системных патологий (атеросклероз, гипертония, инсульты, инфаркты и др.). Это объясняется переключением активности эндотелия на синтез оксидантов, вазоконстрикторов, агрегатов и тромбогенных факторов. И именно тромбоциты являются основными клетками, обеспечивающими нормальное протекание гемостаза, основной функцией тромбоцитов является их участие в процессах свертывания крови. При повреждении сосуда происходят адгезия и агрегация тромбоцитов (формирование пробки), активация свертывающего каскада крови с образованием фибрина, который делает тромбо-цитарную пробку устойчивой.

Таким образом, в физиологических условиях целостный эндотелий - основной антикоагу-лянтный фактор [7]. Это достигается с помощью синтеза биологически активных веществ, одним из которых является NO. Однако к негативным последствиям приводит как избыточная, так и недостаточная продукция NO.

Материалы и методы исследования

В представленной работе в качестве объекта исследования была использована плазма крови больных с метаболическим синдромом - 50 человек. Нами были оценены около 50 проб на NO, спонтананную и индуцированнную агрегацию тромбоцитов, контролем служила плазма практически здоровых людей - 20 образцов.

Для оценки функционирования эндотелия использовалось определение концентраций оксида азота и уровня спонтанной и индуцированной агрегации тромбоцитов. Для изучения состояния свободнорадикального окисления использовались спектроскопия молекулярных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и биохемилюминесцентный метод определения активности антиоксидантной системы.

Для оценки концентрации N0 по содержанию его конечных метаболитов - нитратов и нитритов - использовали методику П.П. Голикова [8].

Метод основан на получении красной окраски раствора, содержащего нитрит, при добавлении к нему реагентов: сульфаниламида (белого стрептоцида ) и ^(1-нафтил)-этилендиамина дигидрохлорида (НЭДА) - реакция Грисса. Нитраты определяют косвенным путем, для чего их восстанавливают до нитритов, пропуская через подготовленный субстрат - губчатый кадмий. Уровень нитратов и нитритов оценивали в безбелковом экстрате спектрофотометрическим методом. Измерение абсорбции растворов проводили на спектрофотометре Apel PD 303 (Япония) при длине волны 546 нм, в кювете 10 мм, против контроля. В качестве стандарта использовали эталонный раствор с концентрацией нитритов 50 мкмоль/л. Расчет производили по формуле

-

С= х50, —

(1)

где С - концентрация нитритов или нитратов в пробе, Е0 - экстинция опыта, Еk - экстинция эталона, 50 - концентрация нитритов в эталонном растворе.

Для изучения состояния свободнорадикального окисления использовалась спектроскопия молекулярных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и биохемилюминесцентный метод. Содержание продуктов ПОЛ (ДК - диеновые конъюгаты, ТК - триеновые конъюгаты, ОШ - основания Шиффа) определяли методом И.А. Волчегорского. Их значения определяли в гептан-изопропанольных фракциях, так как в гептане экстрагируются, в основном, нейтральные липиды, а в изопропаноле - фосфолипиды.

Таким образом, гептановая фракция свидетельствует об активности ПОЛ в нейтральных липидах, а изопропанольная - в фосфолипидах. Замер оптических плотностей (Е) производили на спектрофотометре СФ-46 при толщине кюветы 1 см. Оценивалась каждая фаза против соответствующего контроля при длинах волн 220 нм (поглощение изолированных двойных связей), 232 нм (поглощение ДК), 278 нм (поглощение ТК), 400 нм (поглощение ОШ). Содержание ДК, ТК, ОШ высчитывали по формулам ДК = (232в.ф./220в.ф.+232н.ф./220н.ф.)х0.14 (2) ТК = (278в.ф./220в.ф.+278н.ф./220н.ф.)х0.16 (з) ОШ = (400в.ф./220в.ф.+400н.ф./220н.ф.)х52, (4) где 220, 232, 278, 400 - длины волн; в.ф. - верхняя фаза; н.ф. - нижняя фаза; 0.14; 0.16; 52 -поправочные коэффициенты.

Биохемилюминесцентный анализ не является прямым количественным методом определения концентрации свободных радикалов, а регистрирует кванты света, образующиеся в реакциях с активными формами кислорода. На интенсивность процесса свечения оказывает влияние полный комплекс соединений, обладающих анти- и прооксидантным действием. Принцип метода заключается в том, что при введении в биологическую систему (0.4 мл плазмы крови) пероксида водорода (0.2 мл) и сульфата железа (0.4 мл) происходит каталитическое разложение пероксида ионами металлов переменной валентности. Образующиеся при этом свободные радикалы инициируют свободнорадикальное окисление. Рекомбинация радикалов приводит к образованию неустойчивого тетраоксида, распадающегося с выделением квантов света. Для регистрации индуцированной хемилюминес-ценции использовался прибор биохемилюми-нометр (БХЛ-07, Н. Новгород), сопряженный с компьютером IBM PC/AT в диалоговом режиме. Результат распечатывался в унифицированной форме в виде хемилюминограммы с расчетом следующих параметров:

- индекс 7max, где Imax (mv) - максимальная интенсивность свечения, показывающая потенциальную способность биологического объекта к перекисному окислению липидов;

- индекс S, где S (mv) - светосумма хеми-люминесценции за 30 секунд, отражающая содержание в плазме радикалов. Это величина, соответствующая обрыву цепи свободнорадикального окисления, поэтому обратно пропорциональна антиоксидантной активности пробы крови.

Протекающий процесс регистрируется в течение 30-60 секунд - время наибольшей информации об интенсивности развивающегося в

ходе инициирования ПОЛ. Об активности анти-оксидантной активности судили по показателю светосуммы хемилюминесценции также в импульсах в секунду [9].

Активность тромбоцитов оценивали по их агрегации под действием различных индукторов. Свертывание крови предупреждали 3.8%-ным раствором цитрата натрия, добавляемым в соотношении 1:9; для исключения контактной активации тромбоцитов использовалась только пластиковая посуда. Кровь центрифугировали на малых оборотах (15 минут при 1000 §), при этом отделялась богатая тромбоцитами плазма. Оставшуюся кровь снова центрифугировали (15 минут при 3000 §); верхний слой являлся бестромбоцитарной плазмой. Богатую тромбоцитами плазму в дальнейшем использовали для исследования функциональной активности тромбоцитов, бестромбоцитарную -для калибровки шкалы оптической плотности прибора. Все исследования проводились в течение трех часов с момента забора крови.

Работа проводилась на анализаторе агрегации тромбоцитов АР 2110 (ЗАО Солар, Республика Беларусь), предназначенном для исследования агрегации тромбоцитов и других видов клеток, турбидиметрическим методом путем непрерывного измерения изменений коэффициента светопропускания, происходящих в перемешиваемой и термостатируемой суспензии клеток, с выводом результатов измерений на встроенный индикатор. Измерения проводятся при длине волны 400-1100 нм. Анализатор агрегации измеряет изменение коэффициента пропускания исследуемого раствора. Происходящее в процессе агрегации тромбоцитов изменение коэффициента светопропускания раствора характеризует физиологическую активность тромбоцитов.

Был выбран режим работы с нормировкой результатов измерений по начальному уровню светопропускания плазмы, богатой тромбоцитами. За 0% светопропускания принималось начальное светопропускание плазмы, богатой тромбоцитами. За 100% светопропускания принималось светопропускание бестромбоцитарной плазмы. Тромбоциты находились в условиях, приближенных к физиологическим, в собственном микромире, при стандартной температуре 37°С и постоянной скорости перемешивания, моделирующей кровообращение, в интактной среде (одноразовые пластиковые кюветы). В качестве индуктора служили адено-зин-дифосфат (АДФ), адреналин (10 мкг/л) и коллаген - как наиболее информационные и адекватные индукторы агрегации.

Таблица 1

Уровень спонтанной и индуцированной агрегации у больных с МС по сравнению с контролем

Показатель Спонтанная агрегация Адреналин- индуцированная агрегация АДФ- индуцированная агрегация ^^лаген- индуцированная агрегация

Kонтроль 5.3 ± O.O1 4.3O ± O.1O 6.64 ± O.1O 2.5 ± O.1O

МС 23.8 ± O.O1* 6.8 ± O.95* 1O.15 ± O.93* 1O.9 ± O.87*

* Различия достоверны по сравнению с контролем (р < 0.05).

Результаты исследования и их обсуждение

Измерение агрегациии тромбоцитов проводили оптическим методом на анализаторе агрегации АР 211O, при этом использовали индукторы агрегации (АДФ, адреналин, коллаген). Результаты занесены в табл. 1.

При ряде воспалительных заболеваний наблюдается активация свертывания крови, а именно - сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза [10].

В результате агрегации образуется белый тромбоцитарный тромб. В физиологических условиях главная роль в инициации первых этапов активации тромбоцитов принадлежит АДФ, которая стимулирует изменение формы и адгезию тромбоцитов. Эта реакция обратима. Индукция тромбоцитов с помощью АДФ опосредована активацией кальциевых каналов цитоплазматической мембраны. В образовании белого тромбоцитарного тромба различают несколько этапов [11].

Начальная стадия активации - взаимодействие индуктора с рецепторами, стимуляция фосфолипазы А2, продукция в тромбоцитах активных метаболитов арахидоновой кислоты -тромбоксана А2 и фактора активации тромбоцитов. Происходит набухание тромбоцитов. Эта стадия агрегации является обратимой как в условиях целостного организма, так и in vitro. С ней сопряжено первое увеличение степени све-топропускания, отражаемое прибором.

Вторая стадия - активация под действием тромбоксана и фактора активации тромбоцитов фосфолипаз А2 и С, которые, расщепляя мембранные фосфолипиды, снова приводят к высвобождению арахидоновой кислоты. Далее арахидоновая кислота под влиянием циклоокси-геназы и тромбоксансинтетазы превращается через промежуточную стадию эндопероксидов в тромбоксан А2. Также в эту стадию происходит повышение внутриклеточного уровня свободного кальция, высвобождение из гранул

биологически активных веществ (АДФ, серотонина, тромбоксанов).

Следующий этап является конечным. На мембранах тромбоцитов происходят конформа-ционные изменения ПЬ/Ша рецепторов. Молекулы фибриногена и фактора Виллебранда, являясь мультивалентными, способны взаимодействовать одновременно с большим количеством тромбоцитов, что приводит к образованию многочисленных межклеточных «мостиков» [12]. Образуются необратимые агрегационные комплексы. Этот этап называют второй фазой агрегации, или второй волной.

Выявлено достоверное повышение спонтанной агрегации тромбоцитов в 4.5 раза у пациентов с МС, в условиях эндотелиальной дисфункции. Также наблюдается значительное (в 5 раз) повышение коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов в крови больных с МС, по сравнению с контролем. Изменение коллаген-индуцированной агрегации говорит об активации фосфолипазы С, в тромбоцитах происходят процессы, приводящие к секреции тромбоци-тарных гранул, и синтез тромбоксана А2, что сопровождается резким усилением межтромбо-цитарного взаимодействия.

В нашей работе для исследования функциональной активности тромбоцитов мы использовали малые дозы АДФ, как наиболее информационного и адекватного индуктора агрегации. Под действием малой дозы АДФ происходит только первичная (обратимая) агрегация. Такая концентрация пригодна при исследовании повышенной агрегационной склонности тромбоцитов. В результате выявили, что при патологии значения АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов превышают значения контроля почти на 40%.

Повышение адреналин-индуцированной агрегации тромбоцитов по сравнению с контролем на 20% говорит о наличии гипоксического состояния, то есть имеет место нарушение снабжения тканей кислородом. Оценка данных совпадает с вышеописанными результатами,

С, мкмоль/л

250т 200 150 100 50 0

/

□ Контроль

□ МС

Концентрация Концентрация нитритов нитратов

Рис. 1. Содержание нитритов и нитратов у больных МС:

* различия достоверны по сравнению с контролем (р < 0.05)

полученными при исследовании агрегации, вызванной АДФ.

Гиперактивность тромбоцитов опосредованно свидетельствует о патологических явлениях в эндотелии. В норме тромбоциты не подвержены агрегации, адгезии к неповрежденному эндотелию также не происходит. Образование гемостатической пробки начинается с контакта тромбоцитов с тромбогенной поверхностю (адгезия), а последующий рост пробки зависит от взаимодействия тромбоцитов между собой (агрегация).

В ранней стадии воспалительного ответа на поверхности эндотелия экспонируются адгезивные молекулы, активируются тромбоциты. В итоге формируются стабильные агрегаты тромбоцитов, возникают серьезные нарушения кровоснабжения и трофики тканей, что только усугубляет воспаление, а в нашем случае системный патологический процесс [13].

Таким образом, установлено, что уровень спонтанной и индуцированной агрегации тромбоцитов превышает контрольные значения - в среднем на 30%. Это связано, вероятно, с наличием накопившегося пероксинитри-та, обладающего токсическим эффектом, что, в свою очередь, усугубляет патологические процессы из-за снижения микроциркуляции тканей.

Метаболический синдром сопровождается тромбоцитарным нарушением функционирования эндотелия, что связано с аномальным синтезом вазодилататоров. Оксид азота при этом может синтезироваться как в высоких концентрациях, так и в низких. Для оценки концентрации N0 по содержанию его конечных метаболитов - нитратов и нитритов - использовали методику Голикова.

Из представленных на рис. 1 данных отчетливо видно, что у больных МС наблюдается повышенная концентрация метаболитов N0 на 30%, по сравнению с данными контроля.

При МС повышенное образование N0 в организме приводит к его взаимодействию с супер -оксид-анион-радикалом и выходом к перокси-нитрит-аниону [14].

Пероксинитрит повреждает сосудистый эндотелий, способствует увеличению агрегации тромбоцитов, окисляет липиды мембран клетки. В присутствии пероксинитрита или продуктов его распада образуются тиильные радикалы глутатиона, в результате чего последний из антиоксиданта превращается в прооксидант, тем самым инициируя перекисное окисление липидов. Данные, подтверждающие этот факт, представлены в табл. 2.

Исходя из данных табл. 3 обнаруживается, что у больных МС наблюдается повышенное количество диеновых конъюгатов и оснований Шиффа.

Показатели биохемилюминесценции (БХЛ), занесенные в табл. 3, свидетельствуют об ингибировании антиоксидантных комплексов и накоплении свободных радикалов в крови пациентов с МС.

Заключение

1. Изменения содержания нитратов и нитритов в крови пациентов с метаболическим синдромом свидетельствуют о накоплении оксида азота и преобразовании его в конечные продукты метаболизма.

2. При наличии патологии было отмечено повышение уровня свободнорадикального окисления. Показатели свидетельствуют об ингибировании антиоксидантных комплексов и

*

*

Таблица 2

Активность ПОЛ в крови больных с МС

Показатель Контроль МС

ДК, отн. ед. 0.110 ± 0.002 0.200 ± 0.010*

ТК, отн. ед. 0.210 ± 0.006 0.080 ± 0.010*

ОШ, отн. ед. 2.320 ± 0.910 11.420 ± 0.660*

Таблица 3

Показатели БХЛ в крови больных МС

Показатель Контроль МС

! max 1.87 ± 0.06 2.27 ± 0.03*

S 21.2 ± 0.18 22.41 ± 0.21*

накоплении свободных радикалов в крови пациентов с МС.

3. Гиперактивность тромбоцитов, отмеченная нами при наличии патологии, служит маркером патологического сдвига в эндотелии. В норме тромбоциты не подвержены агрегации, адгезии к неповрежденному эндотелию также не происходит.

Список литературы

1. Ванин А.Ф. // Биохимия. 1998. Вып. 7. С. 867-869.

2. Спиридонов Е.В. // Маркеры дисфункции эндотелия в организме. www.laboratory.rusmedserv. сот^огт^^пс1юп_2003

3. Шестакова М.В. // Русский медицинский журн. 2007. № 2. С. 88-91.

4. Петрищев Н.И., Власов Т.Д. Дисфункция эндотелия: причины, механизмы, фармакологическая коррекция. СПб.: Изд-во СПбГМУ, 2003. 184 с.

5. Воробьев С.В., Мишина Е.В. // Вестник Ростовского государственного университета. 2000. № 3. С. 384-397.

6. Поливода С.Н., Черепок А.А., Рекалов Д.Г. // Функциональное состояние сосудистого эндотелия у

больных с гипертонической болезнью. rgl.net.ua/ cardio j/2006/3/polivoda.htm/

7. Балуда В.П., Балуда М.В. Физиология системы гемостаза. М.: Медицинское изд-во, 1995. 238 с.

8. Голиков П.П. Оксид азота в клинике неотложных заболеваний. М.: Медпрактика-М, 2004. 180 с.

9. Конторщикова К.Н. Перекисное окисление липидов в норме и патологии. Н. Новгород: Б.и., 2000. 24 с.

10. Баркаган З.С., Момот А.П. Основы диагностики нарушений гемостаза. М.: Ньюдиамед-АО, 1999. 224 с.

11. Сергеев П.В., Духанин А.С., Губаева Ф.Р. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1997. Т. 123. № 1. С. 54-57.

12. Козулин В.Ю. // Современное состояние проблемы лечения острого коронарного синдрома. www.rusmedserv.com./cardio/sindrom.2001 .htm

13. Струкова С.М. // Биохимия. 2001. Т. 66. Вып. 1. С. 14-27.

14. Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота. Новый путь к поиску лекарств. М.: Вузовская книга, 2004. 360 с.

15. Калер Г.В., Мельникова А.М., Матус В.К. // Биологические мембраны. 1989. Т. 6. С. 1164-1169.

ENDOTHELIAL DYSFUNCTION AND MARKERS OF VASCULAR-PLATELET HEMOSTASIS

IN THE METABOLIC SYNDROME

I.E. Okrut, D.A. Shakerova, T.A. Veselova

Recently, there has been considerable interest concerning the role of nitric oxide in the course of pathologies with chronic or acute inflammation. Insufficient or excessive production of nitric oxide characterizes the presence of endothelial dysfunction associated with the state of platelet hemostasis and is a major risk factor for various diseases, including metabolic syndrome.

Keywords: nitric oxide, endothelial dysfunction, platelet hemostasis, metabolic syndrome.