CC BY
72
НАУЧНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ОПТИМИЗАЦИИ МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ, ПЕРЕДАВАЕМЫХ ПОЛОВЫМ ПУТЕМ
Е. В. Шипицына 1, К. В. Шалепо 1, А. М. Савичева 1 (savitcheva@mail.ru), М. Домейка 2
1 ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН, Санкт-Петербург, Россия;
2 Отделение медицинских наук Уппсальского университета, Уппсала, Швеция
Введение
С 1998 года в Санкт-Петербурге и Ленинградской области осуществляется российско-шведский проект «Инфекции, передаваемые половым путем: проблемы учета, повышение качества диагностики и управления». Основная цель проекта — совершенствование качества диагностики и терапии инфекций, передаваемых половым путем. Для улучшения качества диагностики ИППП в России планировалось решить следующие задачи:
• разработка и внедрение стандартов и алгоритмов ведения пациентов с ИППП;
• oптимизация и стандартизация лабораторной диагностики ИППП и внедрение системы контроля качества;
• oценка распространенности инфекций репродуктивного тракта с использованием современных стратегий и методов.
В рамках проекта был проведен целый ряд исследований, основной целью которых было оптимизировать лабораторную диагностику ИППП в России. Результаты исследований представлены на международных конференциях и опубликованы в международных и российских журналах. Кроме того, защищены диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук «Валидация методов лабораторной диагностики инфекций, вызываемых Chlamydia trachomatis» (Шалепо К. В.) и «Микробиологические аспекты устойчивости к антибактериальным препаратам» (Шипицына Е. В.).
В статье дается обзор научных работ, направленных на оптимизацию лабораторной диагностики ИППП, как завершенных, так и находящихся в стадии проведения.
Лабораторная диагностика N. gonorrhoeae в Санкт-Петербурге, Россия: анализ количества проб, оценка методов диагностики, рекомендации по оптимизации
Цели: Провести анализ лабораторной диагностики инфекций, вызываемых Neisseria gonorrhoeae, в пяти лабораториях Санкт-Петербурга и Ленинградской области, с учетом количества исследуемых проб и диагностических характеристик используемых методов, и выра-
ботать рекомендации по улучшению качества диагностики гонореи на основе международных стандартов.
Методы: Данные были получены из анкет, заполненных врачом-лаборантом, а также во время посещений лабораторий, участвовавших в исследовании. Для оценки качества питательных сред были использованы референс-штаммы N. gonorrhoeae (n=29).
Результаты: В 2004 году в пяти лабораториях методом микроскопии было исследовано 330 879 мазков, окрашенных по Граму. В 407 из них обнаружены грамотрицательные диплококки, морфологически сходные с гонококками. Куль-туральным методом исследовано 38 020 проб, из них 420 были положительными в отношении N. gonorrhoeae. Четыре лаборатории для куль-туральной диагностики использовали российскую неселективную среду Комплегон, одна лаборатория использовала селективную среду Biocult-GC (Финляндия). Обе среды оказались недостаточно оптимальными для выявления N. gonorrhoeae. Только две лаборатории использовали какие-либо методы для идентификации N. gonorrhoeae. В остальных лабораториях использовался лишь оксидазный реагент. Тестирование N. gonorrhoeae на чувствительность к антибиотикам проводили в двух лабораториях и анализировали только редкие штаммы. Ни в одной лаборатории не было полной оценки качества диагностики.
Заключение: Диагностика инфекций, вызываемых N. gonorrhoeae, в Санкт-Петербурге и Ленинградской области не в полной мере соответствует международным рекомендациям. Для выделения гонококков должны быть в основном использованы селективные питательные среды и, более того, следует более часто определять чувствительность штаммов к антибиотикам и проводить видовую идентификацию N. gonorrhoeae. Кроме того, используемые методы культивирования и определения чувствительности к антибиотикам, включая среду и критерии интерпретации результатов, должны быть оптимизированы и стандартизированы; качество лабораторной диагностики должно подтверждаться систематическими внутренними и внешними контролями.
Публикации:
1. Unemo M., Savicheva A., Budilovskaya O., Sokolovsky E., Larsson M., Domeika M. Sex Transm Infect. 2006;82(1):41-4.
Диагностика инфекций, вызываемых
Chlamydia trachomatis, в России — отечественные тесты могут быть эффективными, однако необходима их оптимизация
Цели и методы: Целью работы явилась оценка трех отечественных ПЦР-тестов для диагностики генитальной хламидийной инфекции в сравнении с культуральным методом и двух тестов прямой иммунофлюоресценции (ПИФ).
Результаты: Всего было обследовано 650 пациентов. В целом самую высокую диагностическую чувствительность продемонстрировал метод ПЦР. Однако чувствительность метода существенно варьировала: от 79 до 100 % в зависимости от теста, пола пациента и типа образца. Самая высокая чувствительность была получена для образцов из вагины и мужской уретры (100 %). Специфичность ПЦР-тестов варьировала от 97 до 100 %>. Чувствительность культурального метода и обоих ПИФ-тестов оказалась низкой — она варьировала от 46 до 56 0% и от 55 до 75 % соответственно. Специфичность культу-рального метода составила 100 %, а специфичность обоих ПИФ- тестов варьировала от 99 до 100 %.
Выводы: Результаты исследования дают основание предположить, что в будущем отечественные ПЦР-тесты могут с успехом использоваться для выявления C. trachomatis в урогенитальных пробах, полученных как инвазивным, так и неинвазивным путем. Одновременный анализ двух различных образцов от женщин приводит к значительному повышению выявляемости C. trachomatis. Тем не менее, необходимо подчеркнуть, что оптимизация и обеспечение качества диагностики C. trachomatis, особенно отечественных ПИФ-тестов, представляется крайне важным.
Публикации:
1. Шалепо К. В., Шипицына Е. В., Савичева А. М., Домейка М. Журнал акушерства и женских болезней, 2001, Т. L, № 4, с.77-82.
2. Шалепо К. В., Шипицына Е. В., Савиче-ва А. М., Домейка М. Журнал акушерства и женских болезней, 2002, Т. LI, № 1, c. 95-100.
3. Shalepo K., Savitcheva A., Shipitsyna E., Unemo M., Domeika M. APMIS. 2006;114(7-8):500-7.
Пулирование проб: чувствительный, специфичный и экономичный подход к диагностике инфекций, вызываемых Chlamydia trachomatis
Цели: Целью исследования было оценить диагностические характеристики и экономическую
эффективность технологии пулирования эндо-цервикальных проб для скрининга и диагностики генитальной хламидийной инфекции, а также исследовать распространенность хламидийной инфекции среди женщин, проживающих в Ленинградской области.
Методы: Всего было проанализировано 1500 эндоцервикальных проб, пулированных по 5 и 10 проб. Полученные результаты сравнивали с результатами индивидуального тестирования. Для анализа использовали ПЦР-тест, оцененный в предыдущем исследовании (Диагностика инфекций, вызываемых Chlamydia trachomatis, в России — отечественные тесты могут быть эффективными, однако необходима их оптимизация).
Результаты: Ни одна из используемых методик пулирования не повлияла на чувствительность и специфичность ПЦР-анализа. Распространенность генитальной хламидийной инфекции, рассчитанная по результатам индивидуального тестирования, а также анализа пулов по
5 и 10 проб, равнялась 6,6, 6,1 и 6,0 % соответственно. Экономия средств, полученная при использовании технологии пулирования с целью диагностики, составила 53,3 %% (5 проб в пуле) и 44,0 % (10 проб в пуле).
Заключение: Пулирование проб — это точный и экономичный подход для выявления C. trachomatis методом ПЦР, который может быть использован как для индивидуальной диагностики, так и для проведения больших эпидемиологических исследований.
Публикации:
1. Шипицына Е. В., Савичева А. М., Башма-кова М. А., Шалепо К. В. Журнал акушерства и женских болезней, 2002, Т. LI, № 1, c. 101-104.
2. Shipitsyna E., Shalepo K., Savicheva A., Unemo M., Domeika M. Acta Derm Venereol. 2007; 87(2):140-3.
Устойчивость Chlamydia trachomatis к антибиотикам in vitro: методологические аспекты и клиническое значение
Охарактеризована чувствительность 25 клинических штаммов Chlamydia trachomatis к антибиотикам, наиболее широко применяемым для лечения хламидийной инфекции. Из 25 штаммов 10 (40 %) были определены как устойчивые in vitro к доксициклину, 10 (40 %) — к азитромицину, 11 (44 %) — к джозамицину, 11 (44 %) — к спирамицину и 11 (44 %) — к офлоксацину. Множественную резистентность проявили 12 (48 %) изолятов, причем
6 из них оказались устойчивыми ко всем протестированным антибиотикам. Показан гетеро-типический характер резистентности: только
небольшая часть популяции хламидий (< 1%) выживала в присутствии высоких концентраций антибиотика. Сопоставлены результаты контрольных исследований с данными тестирования чувствительности хламидий к антибиотикам in vitro и показано отсутствие связи между ан-тибиотико-резистентностью хламидий in vitro и неудачами антихламидийной терапии. Так, 9 человек из 25 при нимали препарат, к которому хламидии, выделенные до лечения, были устойчивы in vitro. Ни у одного из этих пациентов хламидии после лечения в культуре клеток не выделялись. Напротив, в единственном случае выделения хламидий в культуре клеток после лечения клинический изолят, полученный до лечения, оказался чувствительным к препарату, который использовался для антихламидийной терапии. Таким образом, тестирование чувствительности хламидий к антибиотикам при выборе препарата для лечения хламидийной инфекции представляется нецелесообразным.
Публикации: 1. Шипицына Е. В., Савичева А. М., Хуснутдино-ва Т. А., Шалепо К. В., Мисюрина О. Ю., Говорун В. М., Домейка М. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2004, Т. 6, № 1, с. 54-64
Применение метода NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) в реальном времени для диагностики урогенитальной хламидийной инфекции
Целью данного исследования явилась апробация нового теста, основанного на техно-
Тестирование урогенитальных проб на ДНК C. trachomatis
логии NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) в реальном времени, для диагностики урогенитальной хламидийной инфекции. Всего было обследовано 193 пациента в возрасте от 16 до 42 лет (средний возраст 22,8 года), при этом большинство из них имели симптомы урогенитальной инфекции. Соскобы эпителия цервикального канала у женщин и уретры у мужчин были исследованы методами культуры клеток, полимеразной цепной реакции (ПЦР) и NASBA. Хламидийная инфекция была диагностирована у 29 пациентов (15 %): у 21 из них хламидии были обнаружены всеми тремя методами, тогда как 8 проб были отрицательными в культуре. Чувствительность обоих молекулярных методов равнялась 100 %, куль-турального — 78,4%. Прогностическая значимость отрицательных результатов для ПЦР и NASBA составила 100 %, для КК — 95,3 %. Специфичность, а также прогностическая значимость положительных результатов всех трех методов равнялась 100 %. Таким образом, новый тест на основе метода NASBA в реальном времени обладает высокой чувствительностью и специфичностью и может быть рекомендован в качестве подтверждающего метода для диагностики урогенитальной хламидийной инфекции.
Публикации:
1. Шипицына Е. В., Воробьева Н. Е., Сави-чева А. М., Соколовский Е. В., Гущин А. Е., Рыжих П. Г., Шипулин Г. А. Журнал акушерства и женских болезней, 2005, Т. LIV, № 4, с. 17-21.
Таблица 1
с использованием пяти ПЦР-тестов*
1 2 3 4 5 Количество проб
Женщины (n = 319) Пробы из цервикального канала (п = 319) + + + + + 34
+ + - - — 2
+ + - - + 1
- - - - — 282
Пробы из вагины (п=298) + + + + + 31
+ + - - — 2
+ + - - + 2
263
Мужчины (n = 127) Пробы из уретры (п = 127) + + + + + 13
- - + + + 1
- - - - — 113
Моча (п = 127) + + + + + 12
+ + - — — 1
111
* 1 — ПЦР с электрофорезной системой детекции ампликонов (ДНК-технология); 2 — ПЦР в реальном времени (ДНК-технология); 3 — ПЦР с электрофорезной системой детекции ампликонов (ЦНИИ эпидемиологии); 4 — ПЦР в реальном времени (ЦНИИ эпидемиологии); 3 — ПЦР с электрофорезной системой детекции ампликонов (Литех).
Таблица 2
Тестирование урогенитальных проб на ДНК N. gonorrhoeae с использованием пяти ПЦР-тестов*
1 2 3 4 5 Количество проб
Женщины (n = 319) Пробы из цервикального канала (п = 319) + + + + + 5
+ + + + - 1
- - - - - 313
Пробы из вагины (п = 317) + + + + + 4
+ + + + - 1
- - + + - 1
- - - - - 311
Мужчины (n = 127) Пробы из уретры (п = 127) + + + + + 4
- - - + - 1
- - - - - 122
Моча (п = 127) + + + + + 5
- + - + - 1
- - - - - 121
* 1 — ПЦР с электрофорезной системой детекции ампликонов (ДНК-технология); 2 — ПЦР в реальном времени (ДНК-технология); 3 — ПЦР с электрофорезной системой детекции ампликонов (ЦНИИ эпидемиологии); 4 — ПЦР в реальном времени (ЦНИИ эпидемиологии); 3 — ПЦР с электрофорезной системой детекции ампликонов (Литех).
Оценка молекулярно-биологических методов, используемых в России для диагностики ИППП (в стадии проведения)
Цели: Молекулярно-биологические методы, особенно метод ПЦР, широко используются в России для диагностики ИППП. Однако результаты исследований на ИППП, проводимые с применением молекулярно-биологических методов в разных лабораториях, могут значительно различаться, в связи с чем возникает необходимость их всесторонней оценки.
Целью данного исследования является оценка диагностических характеристик ПЦР-тестов, используемых в России для диагностики инфекций, вызываемых Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae.
Предварительные результаты: Проанализирован материал от 446 посетителей молодежных центров Санкт-Петербурга — 319 женщин и 127 мужчин. У женщин на ДНК C. trachomatis тестировали соскобы из цервикального канала и отделяемое влагалища, на ДНК N. gonorrhoeae — со-скобы из цервикального канала и мочу, у мужчин на ДНК обоих возбудителей анализировали со-
скобы из уретры и мочу. Результаты исследования представлены в таблицах 1 и 2.
В целом все тесты продемонстрировали высокий показатель совпадения результатов. Так, например, для 316 из 319 соскобов из цервикаль-ного канала получены одинаковые результаты при тестировании на C. trachomatis всеми пятью методами, и только в трех случаях разные тесты дали разные результаты.
Для разрешения дискордантных результатов и оценки диагностических характеристик исследуемых методов планируется использовать рефе-ренс-методы.
Заключение
Для улучшения ситуации с диагностикой и терапией ИППП в России необходима тщательная валидация диагностических методов и стандартизация диагностических процедур. Хочется верить, что результаты наших исследований могут сформировать основу рекомендаций по оптимизации лабораторной диагностики ИППП в России.
