CC BY
39
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2011
НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ТРЕБОВАНИЙ ПО БЕЗОПАСНОМУ ПРОИЗВОДСТВУ И ПРИМЕНЕНИЮ В КОСМЕТОЛОГИИ ПРЕПАРАТОВ ИМ-Б1, ИМ-МК1 НА ОСНОВЕ БИФИДО- И МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
СТУДЕНИЧНИК Т.С.*, ШЕВЛЯКОВ В.В.**, ФИЛОНЮК В.А.***, ЭРМ Г.И.*, ЩУРСКАЯ Н.А.*, БУЙНИЦКАЯ А.В.*, ЧЕРНЫШОВА Е.В.*, КОЗЛОВСКАЯ Т.В.*
ГУ «Республиканский научно-практический центр гигиены» *,
ЧУО «Минский институт управления»**,
Министерство здравоохранения Республики Беларусь***
Резюме. Микробные препараты на основе бифидо- и молочнокислых бактерий не обладают существенной острой токсичностью, но проявляют в экспериментах выраженные аллергенные, антигенные и гемотоксические свойства.
Ключевые слова: микробные препараты ИМ-Б1 и ИМ-МК1, токсические, раздражающие, сенсибилизирующие, иммуномодулирующие и гемотоксические свойства.
Abstract. Microbial preparations on the basis of bifid- and lactic acid bacteria do not possess any significant acute toxicity, but show marked allergenic, antigenic and hemotoxic properties in the experiments.
Согласно санитарному законодательству, все новые вещества, в том числе биологической природы, перед опытнопромышленным производством и применением должны подвергаться токсиколого-гигиени-ческим исследованиям в объеме первичной токсикологической оценки для обоснования мер безопасности для здоровья работающих [1].
Адрес для корреспонденции: 220012, г.Минск, ул.Академическая, 8- Студеничник Т.С.
Целью настоящих исследований явились изучение и оценка патогенных, токсигенных и токсических свойств в острых опытах, определение показателей сенсибилизирующего, иммунотоксического и гемотоксического действия новых микробных препаратов ИМ-Б1 и ИМ-МК1, разработка заключений по токсико-лого-гигиенической оценке названных препаратов с обоснованными требованиями гигиенической безопасности при производстве и применении.
Методы
Микробные препараты ИМ-Б1 и ИМ-МК1, разработанные государственным научным учреждением «Институт микробиологии НАН Беларуси», предназначены для использования в косметической продукции в массовых долях от
0,001% до 1%. Согласно удостоверениям качества, выданным государственным научным учреждением «Институт микробиологии НАН Беларуси», микробные препараты представляют собой однородный порошок от светло-кремового до бежевого цвета, содержащие:
- микробный препарат ИМ-Б1 - лио-фильно высушенные клетки Bifidobacterium adolescentis В-456Д в концентрации не менее 1,0х1010 КОЕ/г, молоко сухое обезжиренное по ГОСТ 10970-87, сахарозу по ГОСТ 5833-75;
- микробный препарат ИМ-МК1 - лио-фильно высушенные клетки бактерий штамма Leuconostoc mesenteroides B-133 и бактерий Lactococcus lactis штаммов 1, B-132, B-333, молоко сухое обезжиренное по ГОСТ 1097087, сахарозу по ГОСТ 5833-75.
Бактерии штамма Bifidobacterium adolescentis В-456Д - короткие, прямые или разветвленные палочки с булавовидными утолщениями на концах, грамположительные, некислотоустойчивые, неподвижные, спор не образуют, факультативные анаэробы; катала-зоотрицательные, желатин не разжижают, пигмент не продуцируют. При анаэробном выращивании на плотных питательных средах они образуют круглые, гладкие, однородно кремовые или белые непрозрачные пастообразные колонии с ровными краями, диаметром 1-3 мм.
Бактерии штамма Leuconostoc mesenteroides B-133 - грамположительные, неподвижные клетки овальной или сферической формы, спор не образуют, факультативные анаэробы; каталазоотрицательные, желатин не разжижают, пигмент и индол не продуцируют. При анаэробном выращивании на плотных питательных средах они образуют круглые, гладкие, однородно кремовые или белые непрозрачные пастообразные колонии с ровными краями, диаметром 1-3 мм.
Молочнокислые бактерии Lactococcus
lactis штаммов 1, B-132, B-333 - грамположи-тельные, неподвижные клетки овальной или округлой формы, расположены в мазке попарно в коротких цепочках, спор не образуют, факультативные анаэробы; каталазоотрица-тельные, желатин не разжижают, пигмент и индол не продуцируют. При глубинном посеве в полужидкую питательную среду наблюдается равномерный рост по всей толще столбика среды.
Согласно заключениям учреждения образования «Гродненский государственный аграрный университет» и республиканского унитарного предприятия «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесско-го» указанные штаммы бактерий Bifidobacterium adolescentis, Leuconostoc mesenteroides B-133, Lactococcus lactis штаммов 1, B-132, B-333 являются непатогенными и нетоксигенными.
Общепринятые в токсиколого-гигиени-ческой практике токсикологические, гематологические, биохимические, иммуноаллерголо-гические исследования, статистическая обработка данных, полученных в эксперименте с использованием 140 белых крыс, 100 белых мышей, 6 кроликов-альбиносов, выполнены в соответствии с [1-10].
Результаты и обсуждение
В условиях однократного интраназаль-ного и внутрижелудочного введения микробного препарата ИМ-Б1 белым крысам и белым мышам в максимально возможных стандартных концентрациях и дозах не установлено гибели животных и признаков интоксикации на протяжении 7-суточного периода наблюдения (табл. 1). Во время всего эксперимента подопытные животные всех групп оставались активными, охотно поедали корм и имели гладкий шерстный покров. Среднесмертельная доза DL50 при внутрижелудочном введении препарата белым крысам составила более 1,72х1010 м.кл./кг.
При внутрибрюшинном введении белым мышам микробного препарата ИМ-Б1 в максимально возможной стандартной дозе по 5,0х108 м.кл./жив. в течение всего периода наблюдения гибели и существенных клини-
Таблица 1
Параметры вирулентности, токсигенности и токсичности микробного препарата ИМ-Б1
Вид и количество животных (сред. масса опытных жив.) Способ введения, объём введенного препарата Доза, м.кл./жив. Критерии эффектов Оценка действия,
гибель клиника
Бел. кр. - 6 оп.+6 к. Бел. мыши - 6 оп.+6 к. Интран. по 0,1 см Интран.по 0,02см3 1х108 2х107 0/6 0/6 н.о. н.о. Отсутствует Отсутствует
Бел. кр. - 6 оп.+6 к. (174,5 г) В/жел. по 3 см3 3х109 0/6 н.о. БЬ50>1,72х 1010 м.кл./кг
Бел. мыши - 8 оп.+6 к. (30,56 г) В/бр. по 0,5 см3 5х108 0/8 н.о. БЬ50>1,64х 1010 м.кл./кг
Бел. мыши - 6 оп.+6 к. (26,3 г) П/к. по 0,5 см3 фильтрата в зад. лапу 5х108 0/6 н.о. Т оксигенность отсутствует
Бел. мыши - 6 оп.+6 к. (24,84 г) В/бр. по 0,5 см3 убитой культуры 5х108 0/6 н.о. Токсичность отсутствует
Примечание: н.о. - не обнаружено.
ческих проявлений интоксикации опытных животных не установлено. DL50 при внутри-брюшинном введении белым мышам - более 1,64х1010 м.кл./кг.
Следовательно, микробный препарат ИМ-Б1 в максимально испытанных дозах не проявляет существенные вирулентные свойства, что определяет отнесение соответствующего штамма микроорганизмов к IV классу опасности.
Подкожное введение в лапу белым мышам фильтрата культуральной жидкости в объёме по 0,5 см3 из микробного препарата ИМ-Б1 не приводило к гибели животных, величина отека и время его регрессии не отличались от контроля при отсутствии некроза кожи, что свидетельствует об отсутствии у микробного препарата ИМ-Б 1 существенной способности выделять экзотоксины, т.е. ток-сигенных свойств.
Внутрибрюшинное введение белым мышам убитой нагреванием бактериальной культуры микробного препарата ИМ-Б1 в объёме по 0,5 см3 (доза 5,0х108 м.кл./жив.) также не приводило к гибели опытных животных и признакам интоксикации.
Результаты острых экспериментов свидетельствуют об отсутствии у микробного препарата ИМ-Б1 вирулентности, а также токси-
генности (способности выделять экзотоксины) и токсичности (патогенности эндотоксинов) для теплокровных животных.
В условиях однократного интраназаль-ного и внутрижелудочного введения микробного препарата ИМ-МК1 белым крысам и белым мышам в максимально возможных стандартных дозах не установлено гибели животных и симптомов интоксикации (табл. 2). Все животные, взятые в эксперимент, оставались активными, охотно поедали корм и имели гладкий шерстный покров. Ориентировочная DL50 при внутрижелудочном введении микробного препарата ИМ-МК1 белым крысам - более 1,66х1010 м.кл./кг (IV класс опасности).
При внутрибрюшинном введении белым мышам микробного препарата ИМ-МК1 в максимально возможной стандартной дозе по 5,0х108 кл./жив. гибели и проявления существенных клинических симптомов интоксикации животных опытной и контрольной групп не установлено в течение всего периода наблюдения. DL50 при внутрибрюшинном введении белым мышам - более 1,46х1010 м.кл./кг.
Следовательно, микробный препарат ИМ-МК1 в максимально испытанных дозах не проявляет существенной вирулентности, что
Таблица 2
Параметры вирулентности, токсигенности и токсичности микробного препарата ИМ-МК1
Вид и количество животных (сред. масса опытных животных) Способ введения, объём введенного препарата Доза, кл./жив Критерии эффектов Оценка действия,
гибель клиника
Бел. кр. - 6 оп.+6 к. Бел. мыши - 6 оп.+6 к. Интран. по 0,1 см Интран.по 0,02см3 1х108 2х107 0/6 0/6 н.о. н.о. Отсутств. Отсутств.
Бел. кр. - 6 оп.+6 к. (181,1 г) В/жел. по 3 см3 3х109 0/6 н.о. DL50>1,66х 1010 м.кл./кг
Бел. мыши - 8 оп.+6 к. (34,26 г) В/бр. по 0,5 см3 5х108 0/8 н.о. DL50>1,46х 1010 м.кл./кг
Бел. мыши - 6 оп.+6 к. (27,2 г) П/к. по 0,5 см3 фильтрата в зад. лапу 5х108 0/6 н.о. Т оксигенность отсутствует
Бел. мыши - 6 оп.+6 к. (25,94 г) В/бр. по 0,5 см3 убитой культуры 5х108 0/6 н.о. Токсичность отсутствует
Примечание: н.о. - не обнаружено.
определяет отнесение соответствующего штамма микроорганизмов к IV классу опасности.
Подкожное введение в лапу белым мышам фильтрата культуральной жидкости в дозе по 0,5 см3 из микробного препарата ИМ-МК1 не приводило к гибели животных, величина отека и время его регрессии не отличались от контроля при отсутствии некроза кожи, что свидетельствует об отсутствии у препарата существенной способности выделять экзотоксины, т.е. токсигенных свойств.
Внутрибрюшинное введение белым мышам убитой нагреванием бактериальной культуры микробного препарата ИМ-МК1 в объёме по 0,5 см3 (доза 5,0х108 м.кл./мл) также не приводило к гибели опытных животных и признакам интоксикации.
Результаты острых экспериментов свидетельствуют об отсутствии у микробного препарата ИМ-МК1 вирулентности, а также токсигенности (способности выделять экзотоксины) и токсичности (патогенности эндотоксинов) для теплокровных животных.
При однократных четырехчасовых аппликациях микробных препаратов ИМ-Б1 и ИМ-МК1 белым крысам на выстриженные
участки кожи спины площадью 16 см2 в объёме 0,32 см3 (доза 3,2х108 м.кл./жив.) в обоих случаях не выявлено видимых признаков интоксикации и гибели животных на протяжении всего периода наблюдений. Явления раздражения и воспаления кожных покровов на местах аппликаций (гиперемия, сухость, отек) не обнаружены, что подтверждается данными инструментального исследования толщины кожной складки на опытных участках кожи белых крыс через 16 часов после воздействия, не имевших значимых различий с таковыми на контрольных «окошках».
Инстилляция по 50 мкл микробных препаратов ИМ-Б1 и ИМ-МК1 (доза 5х107 м.кл./ жив.) в нижний конъюнктивальный свод глаз кроликов сразу после внесения вызывала у отдельных животных кратковременное рефлекторное слезотечение, проходящее спустя 5-10 минут наблюдения. В последующий период наблюдения изменений со стороны конъюнктивы и других структур глаза не отмечено.
Следовательно, изучаемые микробные препараты ИМ-Б1 и ИМ-МК1 не проявляют раздражающих кожу и токсических кожно-ре-
зорбтивных свойств, не вызывают ирритатив-ные изменения.
Выявление сенсибилизирующего действия проводилось на шестые сутки опыта интраназального введения белым крысам микробных препаратов в объёме по 0,1 см3 (доза 1,0х108 м.кл./жив.) провокационным внутри-кожным тестом опухания лапы (ВТОЛ) путем внутрикожного введения препаратов в апоневроз коллатеральных задних лап животных опытных и контрольных групп в дозе по 1,2х106 м.кл./жив в объёме 0,06 см3.
Результатами исследований установлено (табл. 3), что микробный препарат ИМ-Б1 при пятикратном ингаляционном введении вызывал только у 2 из 10 животных развитие гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) с выраженностью 1-2 балла. При этом регистрировалось возрастание у животных опытной группы абсолютного показателя теста опухания лапы по сравнению с контролем, а также увеличение относительной величины ВТОЛ в баллах, которые несколько превышали таковые в контроле. В то же время, средние показатели ГЗТ не имели существенных различий в сравниваемых группах.
Частота положительных провокационных кожных реакций у менее чем 25% живот-
ных опытной группы при отсутствии существенной значимости различий относительного показателя ВТОЛ в контроле и опыте даже по критерию t Стьюдента (Р>0,05) и тем более по жесткому критерию «Х» свидетельствует об отсутствии существенной сенсибилизирующей способности у микробного препарата ИМ-Б1 при кратковременном ингаляционном поступлении в организм.
Пятикратное ингаляционное введение микробного препарата ИМ-МК1 сопровождалось индукцией слабо выраженной сенсибилизации по ГЗТ только у 2 из 10 животных (табл. 4). Средние абсолютный и относительный показатели ВТОЛ у животных опытной группы незначительно превышали таковые в контрольной группе (Р>0,05).
Исходя их критериев классификационной аллергической активности веществ, микробный препарат ИМ-МК1 при кратковременном ингаляционном поступлении в организм не проявляет существенную сенсибилизирующую способность, так как частота положительных провокационных кожных реакций определена у менее чем 25% животных опытной группы при отсутствии существенной значимости различий относительного показателя ВТОЛ в контроле и опыте даже по критерию t Стьюдента (Р>0,05).
Таблица 3
Показатели выявления гиперчувствительности замедленного типа у белых крыс после недельного интраназального воздействия микробного препарата ИМ-Б1
Показатель ВТОЛ через 24 ч после внутрикожного тестирования Ед. измерения Г руппы сравнения, М+т (количество взятых в эксперимент животных)
контроль(п=10) опыт (п=10)
- абсолютные величины 10-2 мм 1,10 + 0,46 5,10 + 2,35
- 1,67
- относительные величины Н 0/10 2/10
Балл 0 0,30 + 0,21
- 1,43
«Х» 1,65
Примечание: * - достоверные различия с контролем при Р<0,05, ** - достоверные различия с контролем при Р<0,01, 0 - тенденция к различиям с контролем при Р<0,1, Н - числитель - количество животных с положительными (сверхнормативными) результатами, знаменатель - всего в опыте.
Таблица 4
Показатели выявления гиперчувствительности замедленного типа у белых крыс после недельного интраназального воздействия микробного препарата ИМ-МК1
Показатель ВТОЛ через 24 ч после внутрикожного тестирования Ед. измерения Г руппы сравнения, М+т (количество взятых в эксперимент животных)
контроль (п=10) опыт (п=10)
- абсолютные величины - относительные величины 10-2 мм 1;к Н Балл 1;к «Х» 3,00 + 1,09 0/10 0 5,40 + 1,86 1,11 2/10 0,20 + 0,13 1,50 1,65
Примечание: * - достоверные различия с контролем при Р<0,05, ** - достоверные различия с контролем при Р<0,01, 0 - тенденция к различиям с контролем при Р<0,1, Н - числитель - количество животных с положительными (сверхнормативными) результатами, знаменатель - всего в опыте.
Следовательно, изученные микробные препараты ИМ-Б1 и ИМ-МК1 не проявляют сенсибилизирующую активность при кратковременном ингаляционном поступлении в организм лабораторных животных в максимальной стандартной концентрации.
Иммунотоксическое действие может проявляться аллергизацией, иммунизацией и неспецифической иммуномодуляцией организма. Поэтому в хроническом ингаляционном эксперименте изучены все три возможных иммунотоксических эффекта.
Белые крысы двух опытных групп подвергнуты месячному ингаляционному воздействию микробных препаратов ИМ-Б1 и ИМ-МК1 (ежедневное 5 раз в неделю в течение месяца интраназальное введение по 0,1 см3 препаратов в дозе по 1,0х108 м.кл.) в соответствующих концентрациях 4,89х109 м.кл./м3 и 5,53х109 м.кл./м3. Контрольным животным аналогично вводился физиологический раствор.
Длительное ингаляционное воздействие микробным препаратом ИМ-Б1 сопровождалось индукцией у животных значимой активной кожной анафилаксической реакции (табл. 5), т.к. абсолютные показатели ВТОЛ у белых крыс опытной группы были существенно выше, чем в контрольной группе (на 247,9%, Р<0,01), тогда как относительные уровни
ВТОЛ в опытной группе хотя вдвое и превышали контроль, но существенных различий не выявлено.
В то же время, в сыворотке крови животных опытной группы реагиновые антитела выявлялись по реакции дегрануляции тучных клеток (РДТК) в довольно низком титре со средним уровнем несколько даже ниже контрольного (Р>0,05), вероятно, в результате потребления антител в аллергической реакции. Различий в абсолютном количестве ба-зофилов крови животных опытной и контрольной групп не установлено. Это свидетельствует о развитии у животных, подвергшихся ингаляционному воздействию микробного препарата ИМ-Б1, умеренно выраженного аллергического процесса немедленного анафилактического типа.
О развитии у животных существенной ГЗТ после месячного воздействия микробным препаратом ИМ-Б1 свидетельствуют более высокие уровни абсолютного (на 183,1%, Р<0,05) и относительного показателей ВТОЛ, который возрастал в опыте через 24 часа после внутрикожной провокационной пробы в 2 раза по сравнению с контролем (Р<0,1).
На общем фоне снижения кислородного метаболизма в гранулоцитах крови животных опытной группы отмечается еще более значи-
Таблица 5
Иммуноаллергологические показатели белых крыс после месячного ингаляционного
воздействия микробного препарата ИМ-Б1
Показатели Ед. изм. Группы сравнения, М + т
контроль опыт
ВТОЛ: - активная кожная анафилаксия (через 1 час) - ГЗТ (через 24 часа) Б о м 4,80 + 1,50 3/10 0,30 + 0,15 11,9 + 1,40** 6/10 0,60 + 0,16
б 0 ад м м 6,50+ 1,60 2/10 0,20 + 0,13 11,9 + 1,96* 6/10 0,60 + 0,160
РСЛЛ Н % 5/10 16,7 + 3,32 9/10 24,3 + 3,04
РСНСТ: - % возраст. к контролю - индекс стимуляции % усл. ед 78,4 + 12,5 1,19 + 0,06 40,8 + 10,6* 1,12 + 0,05
РДТК % 0,14 + 0,06 0,13 + 0,06
Абсолютное количество базофилов 3 в мм 2,80 + 1,30 2,50 + 1,02
Активность комплемента сыворотки крови усл. ед. 64,3 + 7,69 66,6 + 12,4
ЦИК сыворотки крови усл. ед. 86,2 + 6,94 89,2 + 7,50
НСТ-тест -Спонтанный: возр. к контр. -Зн-стимулир.: возр. к контр. индекс стимуляции Величина фагоцитарного резерва % 53,8 + 7,00 27,1 + 7,97*
% 94,3 + 11,0 53,5 + 11,5*
ед. 1,30 + 0,07 1,20 + 0,05
% 40,5 + 9,00 26,5 + 5,70
Лизоцим сыворотки крови % 69,7 + 0,54 70,9 + 0,99
БАСК % 68,8 + 5,09 75,5 + 4,18
Т-лимфоциты: отн. абс. % 21,4 + 1,80 19,8 + 1,62
109/л 2,62 + 0,23 2,43 + 0,16
Примечание: * - достоверные различия с контролем при Р<0,05, ** - достоверные различия с контролем при Р<0,01, 0 - тенденция к различиям с контролем при Р<0,1, Н - числитель - количество животных с положительными (сверхнормативными) результатами, знаменатель - всего в опыте.
тельное уменьшение количества образующегося формазана в клетках в результате его восстановления кислородными метаболитами при стимуляции гранулоцитов микробным препаратом ИМ-Б1 - на 48% по сравнению с контролем (Р<0,05). Это отразилось на более низкой величине, чем в контроле, и интегрального показателя РСНСТ - индекса стимуляции. Данный факт свидетельствует о специфическом глубоком угнетении кислородного мета-
болизма в гранулоцитах, что не позволило оценить специфический гипериммунный ответ гранулоцитов крови.
У белых крыс опытной группы уровень циркулирующих иммунокомплексов в сыворотке крови (ЦИК) незначительно превышал контрольный, что показывает отсутствие развития в организме на воздействие микробным препаратом ИМ-Б1 существенного аллергического процесса иммунокомплексного типа.
Одновременно с этим, у животных опытной группы отмечалось незначительное повышение по отношению к контролю уровня реакции специфического лейколизиса (РСЛЛ) и комплементарной активности сыворотки крови (Р>0,05), что свидетельствует о весьма слабой активации в организме на воздействие микробным препаратом ИМ-Б1 механизмов аллергизации по комплементза-висимому цитотоксическому типу реакции.
Месячное ингаляционное воздействие микробным препаратом ИМ-МК1 сопровождалось индукцией у животных значимой по частоте выявления и выраженности активной кожной анафилаксической реакции (табл. 6), т.к. абсолютные и относительные уровни ВТОЛ у белых крыс опытной группы были существенно выше, чем у животных контрольной группы (соответственно, на 215,7%, Р<0,01, и на 350,0%, Р<0,001).
Таблица 6
Иммуноаллергологические показатели белых крыс после месячного ингаляционного воздействия микробным препаратом ИМ-МК1
Показатели Ед. изм. Группы сравнения, М + т
контроль опыт
ВТОЛ:
- активная кожная анафилаксия 10-2мм 6,20 + 1,52 14,3 + 1,90**
(через 1 час) Н 1/10 8/10
Балл 0,10 + 0,10 0,90 + 0,18***
- ГЗТ (через 24 часа) 10-2мм 6,20+ 2,20 14,7 + 2,04*
Н 2/10 9/10
Балл 0,30 + 0,21 1,10 + 0,18**
РСЛЛ Н 5/10 8/10
% 14,1 + 3,78 23,3 + 4,02
РСНСТ: % 108,5 + 7,00 50,0 + 8,60***
- % возраст. к контролю усл.ед 1,37 + 0,05 1,24 + 0,06
- индекс стимуляции
% 0,09 + 0,05 0,18 + 0,06
РДТК
3 в мм 2,80 + 1,30 3,12 + 1,12
Абсолютное количество базофилов
Активность комплемента сыворотки крови усл. ед. 64,3 + 7,69 60,9 + 9,01
ЦИК сыворотки крови усл. ед. 86,2 + 6,94 90,4 + 4,73
НСТ-тест
-Спонтанный: возр. к контр. % 53,8 + 7,00 18,5 + 5,50***
-Зн-стимулир.: возр. к контр. % 94,3 + 11,0 61,9 + 12,50
индекс стимуляции ед. 1,30 + 0,07 1,40 + 0,11
Величина фагоцитарного резерва % 40,5 + 9,00 41,2 + 11,7
Лизоцим сыворотки крови % 69,7 + 0,54 71,3 + 0,82°
БАСК % 68,8 + 5,09 76,2 + 4,02
Т-лимфоциты: отн. % 21,4 + 1,80 22,5 + 1,73
абс. 109/л 2,62 + 0,23 2,71 + 0,26
Примечание: * - достоверные различия с контролем при Р<0,05, ** - достоверные различия с контролем при Р<0,01, 0 - тенденция к различиям с контролем при Р<0,1, Н - числитель - количество животных с положительными (сверхнормативными) результатами, знаменатель - всего в опыте.
Однако средний уровень реагиновых антител в крови животных опытной группы по РДТК хотя и превышал в 2 раза таковой в контрольной группе, но различия с контролем были недостоверными. Не выявлено статистически значимых различий по абсолютному количеству базофилов крови в опыте и контроле.
У животных после месячного ингаляционного воздействия микробным препаратом ИМ-МК1 установлена выраженная индукция гиперчувствительности клеточноопосредованного (замедленного) типа, так как абсолютный показатель ВТОЛ на 237,1%, Р<0,05, а относительный показатель в 9 раз (Р<0,01) превышали таковые у животных контрольной группы.
Выявить специфический гипериммун-ный ответ гранулоцитов крови опытных животных не удалось в результате того, что уровень генерации оксидных радикалов в гранулоцитах крови при их стимуляции микробным препаратом ИМ-МК1 по НСТ-тесту был резко угнетен по сравнению с контрольными животными (на 53,9%, Р<0,01). Соответственно, индекс стимуляции кислородного метаболизма в гранулоцитах опытных животных был даже ниже, чем в контроле.
Не установлено развитие у белых крыс опытной группы аллергических реакций им-мунокомплексного и комплементзависимого цитотоксического типов, поскольку величины характеризующих их показателей - ЦИК, РСЛЛ и активности комплемента сыворотки крови - мало отличались от таковых у контрольных животных.
Определение антигенности препаратов осуществляли по оценке их влияния на фагоцитарную функциональную активность грану-лоцитов крови по тесту восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест).
Установлено (таблица 5), что ингаляционное воздействие препаратом ИМ-Б1 вызывало у животных значительное (почти в 2 раза) снижение спонтанного уровня генерации фагоцитами супероксидных радикалов по сравнению с контролем (Р<0,05). При стимуляции гранулоцитов известным активатором НСТ-теста опсонизированным зимозаном определялось снижение в клетках уровня кислород-
ного метаболизма на 43,3% (Р<0,05), что подтверждает и снижение у животных опытной группы интегрального показателя индекса стимуляции. При этом у животных опытной группы снижалась и величина фагоцитарного резерва фагоцитов (Р>0,05).
Подобные результаты установлены и у животных после длительного ингаляционного воздействия препаратом ИМ-МК1 (табл. 6).
Следовательно, полученные экспериментальные результаты свидетельствует о выраженной антигенной активности микробных препаратов ИМ-Б1 и ИМ-МК1 при их длительном ингаляционном поступлении в организм, проявляющейся существенной ингиби-цией кислородного метаболизма в гранулоцитах крови и существенном угнетении их функциональной бактерицидной способности.
Активность комплемента и содержание лизоцима в сыворотке крови белых крыс обеих опытных групп, как и интегральный показатель антимикробной резистентности крови
- бактериальная активность сыворотки крови (БАСК), существенно не отличались от контрольных величин.
Со стороны относительных и абсолютных показателей содержания в крови Т-лим-фоцитов у белых крыс обеих опытных групп не отмечено их существенного различия с соответствующими величинами у контрольных животных.
Следовательно, ингаляционное воздействие микробных препаратов ИМ-Б1 и ИМ-МК1 не сопровождается существенным иммуномодулирующим действием на организм.
Качественно-количественные показатели красного ростка кроветворения у животных после ингаляционного воздействия микробным препаратом ИМ-Б1 характеризовались существенным снижением по сравнению с контрольными животными концентрации в крови гемоглобина, среднеклеточного и среднего содержания гемоглобина в эритроцитах, некоторым повышением количества тромбоцитов и значимым увеличением их среднего объема (табл. 7).
Месячное ингаляционное воздействие микробным препаратом ИМ-МК1 также вы-
Таблица 7
Показатели периферической крови белых крыс после месячного ингаляционного воздействия микробных препаратов ИМ-Б1 и 11М-МК1
Г руппы сравнения, М + т
Показатели, ед. изм. Ед. изм. контроль опыт 1 (ИМ-Б1) опыт 2 (ИМ-МК1)
- Эритроциты 1012/л 6,43 + 0,14 6,29 + 0,14 5,71 + 0,24*
- Средн. объем эритроцитов усл. ед. 74,8 + 1,95 76,5 + 0,80 73,7 + 2,50
- Г емоглобин г/л 128,3 + 3,60 117,0 + 3,05* 107,1 + 2,90***
- Средн. содерж. НЬ в эритр. мкг/кл 267,9 + 6,20 245,3 + 4,40** 252,7 + 8,19
- Среднеклеточный НЬ усл. ед. 20,0 + 0,44 18,7 + 0,37* 19,6 + 0,97
- Г ематокрит усл. ед. 47,9 + 1,14 48,5 + 0,60 43,3 + 1,70*
- Тромбоциты 10 9/л 440,2 + 26,6 474,3 + 23,2 394,0 + 17,6
- Средн. объем тромбоцитов усл. ед. 8,10 + 0,14 8,51 + 0,10* 7,93 + 0,20
- Лейкоциты 10 9/л 10,9 + 1,20 15,1 + 2,20 15,5 + 0,96**
Лейкоформула: - с/я нейтрофилы: отн. % 28,9 + 3,83 28,7 + 2,36 22,6 + 3,80
абс. 10 9/л 3,51 + 0,93 4,01 + 0,63 3,60 + 0,74
- п/я нейтрофилы: отн. % 1,30 + 0,15 1,30 + 0,15 1,20 + 0,13
абс. 10 9/л 0,14 + 0,02 0,18 + 0,06 2,56 + 2,38
- лимфоциты: отн. % 62,0 + 3,42 64,3 + 2,52 70,1 + 3,58
абс. 10 9/л 6,46 + 0,41 10,1 + 1,59* 10,8 + 0,79***
- эозинофилы: отн. % 3,80 + 0,63 1,90 + 0,31* 2,40 + 0,400
абс. 10 9/л 0,41 + 0,05 0,31 + 0,06 0,37 + 0,07
- моноциты:отн. % 4,00 + 0,52 3,80 + 0,55 3,60 + 0,58
абс. 10 9/л 0,44 + 0,07 0,57 + 0,14 0,52 + 0,06
Примечание: * - достоверные различия с контролем при Р<0,05, ** - достоверные различия с контролем при Р<0,01, 0 - тенденция к различиям с контролем при Р<0,1, Н - числитель - количество животных с положительными (сверхнормативными) результатами, знаменатель - всего в опыте.
зывало у животных выраженное снижение на 116,5% (Р<0,001) содержания в крови гемоглобина при достоверном уменьшении количества эритроцитов, что обусловило значимое снижение и интегрального показателя гематокрита на 9,6% (Р<0,05) по сравнению с контрольными животными.
Со стороны лейкоцитарной формулы у животных обеих опытных групп отмечалось возрастание в периферической крови количества лейкоцитов, причем в случае с микробным препаратом ИМ-МК1 эти различия были достоверны при Р<0,01, а также харак-
терное возрастание относительного и, особенно, абсолютного количества лимфоцитов. У животных 1 и 2 опытных групп выявлено также значимое снижение удельного веса содержания эозинофилов. Данная картина лейкоцитарной формулы весьма характерна для иммунозависимых воспалительных процессов в организме.
Следовательно, длительное ингаляционное воздействие обоих микробных препаратов на организм животных сопровождается выраженными гемотоксическими проявлениями.
Заключение
1. Микробный препарат ИМ-Б1 на основе бактерий штамма Bifidobacterium adolescentis В-456Д в стандартных максимальных дозах при разных путях поступления в организм лабораторных животных разных видов не проявляет существенных патогенных свойств: DL50 при внутрижелудочном введении белым крысам более 1,72х1010 м.кл./кг, при внутрибрюшинном введении белым мышам
- более 1,64х1010 м.кл./кг, что определяет его отнесение к IV классу опасности. Препарат не проявляет токсигенных и токсических свойств.
2. Микробный препарат ИМ-МК1 на основе бактерий штамма Leuconostoc mesenteroides B-133 и бактерий Lactococcus lactis штаммов 1, B-132, B-333 в стандартных максимальных дозах при разных путях поступления в организм лабораторных животных разных видов не проявляет существенных патогенных свойств: DL50 при внутрижелудоч-ном введении белым крысам более 1,66х1010 м.кл./кг, при внутрибрюшинном введении белым мышам - более 1,46х1010м.кл./кг, что определяет его отнесение к IV классу опасности. Препарат не проявляет токсигенных и токсических свойств.
3. Микробные препараты ИМ-Б1 и ИМ-МК1 не обладают кожно-раздражающим и ирритативным действием.
4. Микробные препараты ИМ-Б1 и ИМ-МК1 в максимальной стандартной дозе (1,0х108 м.кл./жив.) вызывали при недельной ингаляции развитие в организме отдельных опытных животных слабой гиперчувствительности замедленного типа. По классификационным критериям препараты не обладают существенной сенсибилизирующей способностью (отсутствие аллергенной активности).
5. При длительном (в течение месяца) ингаляционном воздействии микробные препараты ИМ-Б1 и ИМ-МК1 в максимально возможных концентрациях (4,89х109 м.кл./м3 и 5,53х109 м.кл./м3 соответственно) вызывали у белых крыс индукцию выраженного аллерги-зирующего эффекта преимущественно по немедленному анафилактическому и замедленному клеточноопосредованному типам гипер-
чувствительности с отсутствием существенного развития механизмов иммунокомплекс-ного и комплементзависимого цитотоксичес-кого типов аллергических реакции. Оба препарата проявляли выраженную антигенную способность, выразившуюся ингибицией спонтанного и индуцированного кислородного метаболизма в гранулоцитах крови - угнетение бактерицидной функции фагоцитов, значимое гемотоксическое действие при отсутствии существенных проявлений иммуномодулирующих свойств.
6. На основании результатов токсиколо-го-гигиенических исследований микробные препараты ИМ-Б1 и ИМ-МК1 могут быть рекомендованы для опытно-промышленного производства и использования по назначению со строгим соблюдением мер профилактики выявленного вредного действия на организм работников.
7. С учетом проявления выраженного ингаляционного сенсибилизирующего и им-мунотоксического действия микробных препаратов ИМ-Б1 и ИМ-МК1 при их производстве и применении следует в обязательном порядке предусмотреть меры коллективной (приточно-вытяжная механическая вентиляция) и индивидуальной защиты (средства индивидуальной защиты органов дыхания, очки, спецодежда), технологические меры, направленные на предупреждение или ограничение поступления их в воздух рабочей зоны (герметизация, укрытие и внутренняя аспирация оборудования), а также меры первичной и вторичной медицинской профилактики.
8. Работающие в контакте с микробными препаратами должны проходить предварительные (в соответствии с МУ № 03/0829107 от 26.07.1991 «Критерии профессионального отбора лиц, поступающие на аллергоопасные работы») и периодические (по п. 2.3 Приложения 1 к постановлению Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 08.08.2000 № 33 «О порядке проведения обязательных медицинских осмотров работников») медицинские осмотры, при этом особое внимание при медицинских осмотрах следует обращать на иммуно-аллергологический статус.
9. Использование микробных препаратов ИМ-Б1 и ИМ-МК1 в качестве ингредиентов косметической продукции, применяемой наружно, не представляет потенциальный риск для здоровья человека, поскольку содержащиеся в препаратах штаммы бактерий являются естественными для кишечной аутомикрофлоры организма человека, не продуцируют экзо- и эндотоксины, а препараты не обладают токсическими и токсигенными свойствами даже в максимально возможных концентрациях.
10. Поскольку микробные препараты ИМ-Б1 и ИМ-МК1 представляют аллергоопасность при длительном ингаляционном поступлении в организм, а содержащиеся в них штаммы бактерий не имеют гигиенических нормативов, то для постоянного промышленного производства следует предусмотреть разработку их предельно допустимых концентраций в воздухе рабочей зоны и методы контроля по характерному штамму бактерий.
Литература
1. Экспериментальное обоснование ПДК микроорга-низмов-продуцентов и содержащих их готовых форм препаратов в объектах производственной и окружающей среды: Методические указания № 5789/1-91. - М., МЗ СССР, 1993. - 23 с.
2. Постановка исследований по изучению раздражающих свойств и обоснованию предельно допустимых концентраций избирательно действующих раз-
дражающих веществ в воздухе рабочей зоны: Инструкция 1.1.10-13-57-2005 / Мин-во здравоохранения РБ. - Мн., 2005. - 16 с.
3. Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование предельнодопустимых уровней загрязнений кожи: Инструкция 1.1.10-13-56-2005 / Мин-во здравоохранения РБ. - Мн., 2005. - 23 с.
4. Требования к постановке экспериментальных исследований по изучению аллергенных свойств и обоснованию предельно допустимых концентраций химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосферы: Методические указания № 1.1.11-12-52003 // Сб. офиц. документов по мед. труда и произв. санитарии. - Ч. XIV / Мин-во здравоохранения РБ. - Мн., 2004. - С. 133-156.
5. Архипова, О.Г. Методы исследования в профпато-логии / Под ред. О.Г. Архиповой. - М.: Медицина, 1988. - С. 68-84.
6. Кост, Е.А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования / Е.А. Кост. - М.: Медицина, 1975. - 326 с.
7. Вильчинский, М.П. Упрощенная методика избирательной окраски базофильных гранулоцитов крови / М.П. Вильчинский // Лабор. дело. - 1972. - №1. - С. 58-60.
8. Кузовкова, Н.А. Колориметрические методы исследования в иммунологии: метод. рекомендации / Н.А. Кузовкова, Т.Е. Злотник, С.В. Жаврид. - Мн., 1992. - 12 с.
9. Шубик, В.М. Методические рекомендации по иммунологическому обследованию профессионально работающих с источниками ионизирующих излучений / В.М. Шубик [и др.]. - Л., 1981. - 15 с.
10. Ремизов, П.И. Методы определения естественной (неспецифической) резистентности организма: учебное пособие / П.И. Ремизов, Г. А. Башмаков. -Л., ВМА им. С.М. Кирова, 1976. - 64 с.
Поступила 16.04.2011 г. Принята в печать 03.06.2011 г.
