CC BY
73
doi: 10.24411/0235-2451-2021-10109 УДК 636.084.12:579.62:636.42/.48
Научно-практическое обоснование возможности использования мелассы для культивирования Bifidobacterium bifidum
В.С. ПОПОВ, Н.В. ВОРОБЬЕВА
Курский федеральный аграрный научный центр, ул. Карла Маркса, 70 б, Курск, 305021, Российская Федерация
Резюме. В статье приведены результаты исследований по культивировнию Bifidobacterium bifidum в высокоуглеводной питательной среде на основе мелассы свекловичной и научно-практическому обоснованию возможности использования культуральной жидкости в качестве биологически активной добавки для коррекции микробиоценоза желудочно-кишечного тракта животных. Материалом для лабораторных исследований служила меласса сахарной свеклы в концентрации 5...25 % (контроль 100 %). Для ее ферментации использовали пробиотический микроорганизм Bifidobacterium bifidum штамм № 1. Бактериальный концентрат готовили с использованием суточной культуры микроорганизмов, которую стандартизировали до 1х1о6 КОЕ/см3. Экспериментальные исследования проводили на 30 здоровых поросятах-сосунах 30 суточного возраста (в период подготовки к отъему) и в 60 суточном возрасте при использовании комбикорма на растительно-зерновой основе. По результатам тестирования в среде для культивирования Bifidobacterium bifidum установлена вариабельность массовой доли суммы сбраживаемых сахаров в пределах 53,7.23,7 %, водородного показателя - 6,70.3,77 рН, максимальная в опыте численность Bifidobacterium bifidum отмечена при культивировании микроорганизмов на питательной среде с содержанием мелассы 5 % на вторые сутки - 7х106 КОЕ/см3. Концентрация незаменимых и условно заменимых аминокислот, а также органических кислот в опытном образце с 5 % мелассы на 8-е сутки культивирования была значительно выше, чем в исходной мелассе. В микробиоценозе поросят-сосунов преобладали В. bifidum и Lactobacillus, численность которых варьировала в пределах 107...109 КОЕ/г. У поросят-отъемышей в 60 суточном возрасте установлено снижение количества лактобактерий до 103 КОЕ/г, увеличение стафилококков и клостридий до 106 и 107 КОЕ/г соответственно, а также незначительное увеличение другой условно-патогенной микрофлоры. Вместе с тем концентрация бифидобактерий оставалась на уровне 109 КОЕ/г. Ключевые слова: пробиотические микроорганизмы, метаболиты, микробиоценоз, питательная среда, культуральная жидкость, поросята, кишечная микрофлора.
Сведения об авторах: В. С. Попов, доктор ветеринарных наук, зав. лабораторией (e-mail: viktor.stugen@yandex.ru); Н. В. Воробьева, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник (e-mail: v.nelli.v@yandex.ru).
Для цитирования: Попов В.С., Воробьева Н. В. Научно-практическое обоснование возможности использования мелассы для культивирования Bifidobacterium bifidum // Достижения науки и техники АПК. 2021. Т. 35. № 1. С. 48-51. doi: 10.24411/02352451-2021-10109.
Scientific and practical substantiation of the possibility of molasses application for the cultivation of Bifidobacterium bifidum
V.S. Popov, N.V. Vorobieva
Kursk Federal Agrarian Scientific Center, ul. Karla Marksa, 70b, Kursk, 305021, Russian Federation
Abstract. The article presents the results of studies on the cultivation of Bifidobacterium bifidum in a high-carbohydrate nutrient medium based on beet molasses and the scientific and practical substantiation of the possibility of using the culture liquid as a biologically active additive for correcting the microbiocenosis of the gastrointestinal tract in animals. The material for laboratory studies was sugar beet molasses at a concentration of 5-25% (in the control, the concentration was 100%). For its fermentation, we used the probiotic microorganism Bifidobacterium bifidum strain No. 1. The bacterial concentrate was obtained using a daily culture of microorganisms, which was standardized to 1x10E6 CFU/cm3. Experimental studies were conducted on 30 healthy 30-day old suckling piglets (during the period of preparation for weaning) and on 60-day old piglets using the mixed feed on a plant-grain basis. According to the results of testing Bifidobacterium bifidum, the mass fraction of the sum of fermentable sugars ranged from 53.7% to 23.7%; pH ranged from 6.70 to 3.77; the maximum population of Bifidobacterium bifidum in the experiment was noted during the cultivation of microorganisms in a nutrient medium containing 5% of molasses on the second day - 7x10E6 CFU/cm3. The concentration of essential and conditionally nonessential amino acids, as well as organic acids in the experimental sample was significantly higher than in the original molasses. In the microbiocenosis of suckling piglets prevailed B. bifidum and Lactobacillus; their population varied within 10E7-10E9 CFU/g. Weaned piglets aged 60 days showed a decrease in the number of lactobacilli to 10E3 cFu/g, an increase in staphylococci and clostridia to 10E6 CFU/g and 10E7 CFU/g, respectively, a slight increase in other opportunistic microflora. At the same time, the concentration of bifidobacteria remained at the level of 10E9 CFU/g.
Keywords: probiotic microorganisms; metabolites; microbiocenosis; nutrient medium; culture liquid; piglets; intestinal microflora. Author Details: V. S. Popov, D. Sc. (Vet.), head of laboratory (e-mail: viktor.stugen@yandex.ru); N. V. Vorobieva, Cand. Sc. (Vet.), senior research fellow (e-mail: v.nelli.v@yandex.ru)
For citation: Popov VS, Vorobieva NV. [Scientific and practical substantiation of the possibility of molasses application for the cultivation of Bifidobacterium bifidum]. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2021;35(1):48-51. Russian. doi: 10.24411/0235-2451-2021-10109.
Пробиотики на основе живых микроорганизмов считаются полезными и безопасными. Дальнейшее развитие этого направления предусматривает разработку метабиотиков, которые будут аналогами или улучшенными копиями природных биологически активных веществ, производимых пробиотическими микроорганизмами. При этом культивирование пробитических микроорганизмов предусматривает использование оптимальных питательных сред для получения метабиотиков [1, 2, 3].
Применение пробиотических биологически активных добавок в кормлении поросят раннего отъема - один из
факторов регуляции их микробиоценоза, от которого зависят практически все физиологические функции и биохимические реакции макроорганизма, влияющие на формирование неспецифического иммунитета и естественной резистентности [4, 5].
Метабиотики - продукты метаболизма пробиотических микроорганизмов, среди которых можно назвать лизоцим, бактеиоцины, каталазы, ферменты, органические и аминокислоты, полипептиды и др. [6, 7, 8]. Помимо биологически активного воздействия на макроорганизм, они в значительной степени отвечают за антагонисти-
ческую активность продуцирующего пробиотика, тем самым создавая благоприятные условия для его жизнедеятельности и интеграции в микробиомное сообщество желудочно-кишечного тракта [9, 10].
Клинический эффект метаболитных пробиотических препаратов при формировании микробиоценоза во многом зависит от биологического и химического состава среды желудочно-кишечного тракта и проявляется лишь в период приёма вследствие не благоприятных условий для ассимиляции. Поэтому возникает необходимость поиска способов пролонгировования эффекта от применения пробиотиков. Одновременно следует подчеркнуть важную роль в формировании микробиоценоза желудочно кишечного тракта животных «нормальной микрофлоры». Она активно участвует в процессах пищеварения, продуцируя энзимы, задействованные в метаболизме белков, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот. Отмирая, аутофлора переваривается и усваивается организмом в качестве источник белка [6, 10, 11].
Таким образом, разработка метаболитных пробио-тиков, научно-практическое обоснование возможности их использования в качестве биологически активных добавок с определением закономерностей изменения состава кишечного микробиоценоза поросят в отъемный период, позволит выявить важное звено в патогенезе возникновения и развития гастроэнтеритов, что даст возможность коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Разработка биологически активных добавок метаболитного типа, обогащенных клеточными компонентами бактерий-продуцентов представляется актуальным направлением в области биотехнологии и кормления животных.
Бифидобактерии весьма требовательны к составу питательной среды, особенно к наличию легкоусвояемых азотистых соединений, аминокислот, углеводов, ненасыщенных жирных кислот, витаминов, минеральных элементов. Этим требованиям в наибольшей степени соответствует питательная среда на основе мелассы свекловичной.
Меласса - побочный продукт производства сахара. Это коричневый сироп (патока), остающийся после его кристаллизации. В химическом составе мелассы выделяют - 79% сухого вещества. На 1 кг которого приходится: 116 г сырой золы, 135 г сырого протеина, 3 г сырого жира, и 746 г безазотистых экстрактивных веществ (БЭВ), 0 г крахмала, 652 г сахара, 0,5 г фосфора, 2,5 г кальция, 7,6 г натрия, 54 г калия [12].
Цель исследований - обоснование технологии культивирования Bifidobacterium bifidum на питательной среде из мелассы свекловичной и изучение возможности применения метабиотиков в качестве биологически активной добавки для коррекции микробиоценоза желудочно-кишечного тракта у поросят раннего отъема.
Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:
обосновать возможности использования мелассы свекловичной в качестве питательной среды при культивировании пробиотического микроорганизма Bifidobacterium bifidum;
изучить влияние оптимальной экспериментальной пробиотической суспензии на формирование микробиоценоза желудочно-кишечного тракта поросят-отъёмышей.
Условия, материалы и методы. Исследования выполняли в лаборатории «Агробиотехнологии» Курского ФАНЦ. Материалом для их проведения служила меласса сахарной свеклы, разведенная дистиллированной водой до концентрации 5 %, 10 %, 15 %, 20 % и 25 % (контроль -меласса в чистом виде). Для ее ферментации, которую проводили в течение 8 суток, использовали пробиотиче-ский микроорганизм Bifidobacterium bifidum штамм № 1. Бактериальный концентрат готовили на основе суточной культуры, стандартизированой до 1х106 КОЕ/см3. По окончании ферментации определяли массовую долю сбраживаемых сахаров (по ОСТ 18-395-82) и содержание сырого протеина (по ГОСТ 32044.1-2012). Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) подсчитывали в камере Горяева согласно ОФС.1.7.2.0008.15. Содержание аминокислот, витаминов и органических кислот в куль-туральной жидкости измеряли методом капиллярного электрофореза на приборе «Капель».
Клинические исследования биопрепарата проводили на 30 здоровых поросятах-сосунах 30 суточного возраста в период подготовки к отъему и в 60 суточном возрасте при переводе животных на комбикорм СК-5. Для эксперимента сформировали две группы поросят по 15 голов в каждой: первая - контрольная, особям II группы дополнительно 1 раз в 7 суток выпаивали биопрепарат (культуральную жидкость с метабиотиками) на основе Bifidobacterium bifidum штамм № 1 в количестве не менее 109 КОЕ/гол. в дозе 2 мл на 1 кг живой массы.
Результаты и обсуждение. При использовании среды с содержанием 5 % мелассы численность Bifidobacterium bifidum на вторые сутки культивирования достигала 7х106 КОЕ/см3 (рис. 1). При других концентрациях максимальная в опыте величина этого показателя приходилась на третьи сутки и не превышала 6,6х106 КОЕ/см3. Следует предположить, что это обусловлено первоочередным использованием легкосбраживаемых сахаров мелассы в течение первых 2.. .3 суток. На пятые сутки численность микроорганизмов изучаемого вида снижалась до минимального в опыте уровня при всех концентрациях мелассы и составляла 3.4х106 КОЕ/см3. С 5.6 суток начинался ее повторный рост, что, возможно, связано с переходом бифидобактерий на питание более сложными углеводами. На восьмые сутки самую высокую численность микроорганизмов отмечали на среде с 25 % мелассы - 6,5х 106 КОЕ/см3, а самую низкую в варианте с 5 % - 4х106 КОЕ/см3. Таким образом, наиболее целесоо-
8 7 6
(О
2 5
X
Ш 4
S 3
2 1 0
£
/ г —^ ——Г
1
2
сутки
Рис. 1. Вариабельность динамики Bifidobacterium bifidum на питательных средах с различной концентрацией мелассы, КОЕ/см3: ♦ - 5 %; —■--10 %; —Л--15 %; —X— 20 %;
—Ж— - 25 %.
3
4
5
6
7
8
Таблица 1. Изменения питательной среды на основе мелассы в процессе ферментации
Показатель Цельная меласса (контроль) Среда с концентрацией мелассы 5 % на 8 сутки ферментации
Сумма сбраживаемых сахаров, %* 53,7 23,7
Сырой протеин, г/л 5,35 5,70
Водородный показатель, рН 6,70 3,77
*поляризационным методом.
бразно использование для размножения Bifidobacterium bifidum среды с содержанием 5 % мелассы, поскольку это позволяет достичь максимальной численности микроорганизмов за минимальный период культивирования. Преимущество среды с 25 % мелассы заключается в возможности поддержания величины этого показателя в пределах 3,6.. ,6,6х106 КОЕ/см3 до 8 суток. В связи с изложенным дальнейшие исследования проводили со средой с оптимальным содержанием мелассы (5 %) после 8 суток культивирования, что обусловлено задачей обоснования возможности использования мелассы в качестве питательной среды для Bifidobacterium bifidum.
В процессе культивирования Bifidobacterium установлено снижение суммы сбраживаемых сахаров (по ОСТ 18-395-82) в среде с концентрацией мелассы 5 %, по сравнению с их содержанием в цельной мелассе, на 30 % (табл. 1). Одновременно произошло уменьшение водородного показателя на 2,93 ед., что в комплексе подтверждает активную жизнедеятельность пробиотика в культуральной жидкости.
Во время культивирования, наряду с увеличением численности Bifidobacterium bifidum, происходит выделение в культуральную жидкость метабиотиков в виде органических соединений. В наших исследованиях содержание лизина в среде для выращивания микроорганизма возросло, по сравнению с концентрацией в цельной мелассе, в 26 раз, фенилаланина - в 14 раз, суммы лейцин+изолейцин - в 6,4 раза (табл. 2). Аналогичное увеличение отмечали и по другим незаменимым и условно заменимым аминокислотам, что свидетельствует о высокой активности пробиотических микроорганизмов.
Таблица 2. Протеиногенные аминокислоты, мг/л
Аминокислота Среда с концентрацией мелассы 5 % на 8 сутки ферментации Цельная меласса (контроль)
Аргинин 10,50 18,30
Лизин 27,90 0,62
Тирозин 29,10 0,44
Фенилаланин 14,80 0,31
Гистидин 6,10 5,40
Лейцин+изолейцин 90,10 14,90
Метионин 14,50 2,10
Валин 36,40 3,50
Пролин 83,90 2,40
Треонин 163,10 1,50
Серин 26,50 4,80
Аланин 224,80 1,50
Глицин 33,00 1,80
развитии микроорганизмов [7]. Отмеченные разнонаправленные изменения, вероятно, обусловлены тем, что высокоуглеводная питательная среда на основе мелассы и специфичность метаболизма Bifidobacterium bifidum не адекватны в отношении синтеза различных органических кислот.
Метабиотики культивируемых пробиотических микроорганизмов из группы витаминов были представлены в основном группой В. При этом если содержание витамина В1 находилось на одном уровне (в мелассе -4,9 мг/л, в среде с 5 % мелассы после культивирования Bifidobacterium - 5,5 мг/л), то концентрация витаминов В2 и В3 после 8 суток ферментации достоверно (t=2,776 при p<0,05) уменьшилась, по сравнению с мелассой в чистом виде, на 21,6 мг/л и 4,7 мг/л до 4,4 и 37,3 мг/л соответственно. Это может быть обусловлено как разведением мелассы при изготовлении среды, так и результатами жизнедеятельности пробиотика в среде, компонентов которой было недостаточно для их синтеза.
1200
Содержание янтарной и уксусной кислот в культуральной жидкости на основе среды с концентрацией мелассы 5 % возросло, по сравнению с величинами этих показателей в цельной мелассе, соответственно в 2,4 и 41,1 раз (рис. 2). При этом количество щавелевой кислоты в опытном образце уменьшилось, по сравнению с контролем, в 1,5 раза. В исследованиях других авторов были отмечены аналогичные процессы, что подтверждает пригодность мелассы в качестве питательной среды для
Таблица 3. Состав микроорганизмов кишечного
микробиоценоза (n=30), КОЕ/г фекалий
Вид микроорганизмов 30 суток (средний фон) 60 суток
контроль опыт
Bifidobacterium >109 105 >109
Lactobacillus 109 >103 105
Enterobacter отсутствует отсутствует отсутствует
Proteus отсутствует 105 103
Staphylococcus >103 >106 104
Clostridium 104 107 105
активных компонентов (метабиотиков) пробиотических микроорганизмов [13].
В наших исследованиях в контроле также отмечена тенденция к изменению кишечной микрофлоры в сторону относительного неблагополучия микробиоценоза. В частности, установлено снижение численности лакто- и бифидобактерий до 103 и 105 КОЕ/г соответственно, увеличение стафилококков до 106 КОЕ/г, клостридий - до 107 КОЕ/г и незначительный рост количества другой условно-патогенной микрофлоры, что, вероятно, связано с переводом поросят на растительные корма. В опытной группе так же наблюдали естественное снижение численности лактобактерий, связанное со сменой рациона, но она (105 КОЕ/г) была значительно выше, чем в контроле. При этом содержание бифидобактерий сохранялось на уровне величины этого показателя у поросят до отъема. Кроме того, в опытной группе отмечена меньшая численность условно патогенной микрофлоры, чем в контроле.
Выводы. Наибольшая численность Bifidobacterium bifidum отмечена при культивировании микроорганиз-
мов на питательной среде с содержанием мелассы 5 % на вторые сутки - 7х106 КОЕ/см3. Использование этого варианта позволяет достичь максимальной численности Bifidobacterium bifidum за минимальный период культивирования.
В процессе ферментации происходит значительное увеличение содержания незаменимых и условно заменимых аминокислот и органических кислот в культуральной жидкости, в том числе лизина - в 26 раз, фенилаланина - в 14 раз, суммы лейцин+изолейцин -в 6,4 раза.
У поросят-отъемышей в 60 суточном возрасте установлено снижение численности лактобактерий, по сравнению с возрастом 30 суток, до 103 КОЕ/г в контроле и 105 КОЕ/г в опытной группе, увеличение стафилококков до 106 и 104 КОЕ/г соответственно, клостридий - до 107 и 105 КОЕ/г. При этом содержание бифидобактерий в контрольной группе уменьшилось до 105 КОЕ/г, а в опытной сохранилось на уровне величины этого показателя у животных до отъема (109 КОЕ/г).
Литература.
1. Метабиотики как естественное развитие пробиотической концепции / М. Д. Ардатская, Л. Г. Столярова, Е. В. Архипова и др. // Трудный пациент. 2017. Т. 15. № 6-7. С. 35-39.
2. Shenderov B. A. Metabiotics: novel idea or natural development of probiotic conception // Microb Ecol Health Dis. 2013. Vol. 24. P. 203-299.
3. Characterization of the fecal microbial communities of Duroc pigs using 16S rRNA gene pyrosequencing / E. A. Pajarillo, J. P. Chae, M. P. Balolong, et al. //Asian-Australas. J. Anim. Sci. 2015. No. 28. P. 584-591.
4. Пробиотики на смену антибиотикам: монография /Л. Н. Гамко, И. И. Сидоров, Т. Л. Талызина и др. Брянск: Брянский ГАУ, 2015. 136 с.
5. Новые подходы к разработке биологически активной добавки на основе метаболитов Bifidobacterium bifidum / В. С. Попов, Г. А. Свазлян, Н. М. Наумов и др. // Вестник Курской ГСХА. 2020. № 5. С. 130-135.
6. Грязнева Т. Н. Биологически активные вещества, продуцируемые бактериями рода Bacillus // Лечащий врач. 2013. № 4. С. 54-63.
7. Dietary probiotic Lactobacillus plantarum L-211 for farm animals. II. The additive for piglets / V. I. Fisinin, E. A. Artem'eva, 1.1. Chebotarev, et al. // Sel'skokhozyaistvennaya biologiya. 2017. Vol. 52. No. 2. P. 418-424.
8. Несчисляев В. А., Мокин, П. А., Федорова Т. В. К вопросу разработки высокоэффективных метаболитных про-биотиков //Актуальные направления научных исследований: от теории к практике. 2016. № 2-1 (8). С. 15-17.
9. Механизмы влияния пробиотиков на симбионтное пищеварение / Н. А. Ушакова, Р. В. Некрасов, И. В. Правдин и др. // Известия Российской академии наук. Серия биологическая. 2015. № 5. С. 468-476.
10. Панин А. Н., Малик Н. И. Пробиотики - неотъемлемый компонент рационального кормления животных // Ветеринария. 2006. № 7. С. 19-22.
11. Revealing the combined effects of lactulose and probiotic enterococci on the swine faecal microbiota using 454 pyrosequencing / J. P. Chae, E. A. Pajarillo, J. K. Oh, et al. // Microbial Biotechnology. 2016. No. 9. P. 486-495.
12. Potthast C., Brinker S., Maier K. Futtermittel aus der Zuckerrubenverarbeitung - neue Daten zu Inhaltsstoffen aus einer bundesweiten Erhebung // Sugar industry. 2011. Vol. 136. No. 10. P. 663-669.
13. Кишечный микробиоценоз у поросят отъемного периода / А. В. Притыченко, А. Н. Притыченко, М. П. Бабина и др. //Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства. 2012. № 15-2. С. 258-263.
References
1. Ardatskaya MD, Stolyarova LG, Arkhipova EV, et al. [Metabiotics as a natural development of the probiotic concept]. Trudnyi patsient. 2017;15(6-7):35-9. Russian.
2. Shenderov BA. Metabiotics: novel idea or natural development of probiotic conception. Microb Ecol Health Dis. 2013;24:203-99.
3. Pajarillo EA, Chae JP, Balolong MP, et al. Characterization of the fecal microbial communities of Duroc pigs using 16S rRNA gene pyrosequencing. Asian-Australas. J. Anim. Sci. 2015;(28):584-91.
4. Gamko LN, Sidorov II, Talyzina TL, et al. Probiotiki na smenu antibiotikam: monografiya [Probiotics to replace antibiotics: monograph]. Bryansk (Russia): Bryanskii GAU; 2015. 136 p. Russian.
5. Popov VS, Svazlyan GA, Naumov NM, et al. [New approaches to the development of dietary supplements based on metabolites of Bifidobacterium bifidum]. Vestnik Kurskoi GSKhA. 2020;(5):130-5. Russian.
6. Gryazneva TN. [Biologically active substances produced by bacteria of the genus Bacillus]. Lechashchii vrach. 2013;(4):54-63. Russian.
7. Fisinin VI, Artem'eva EA, Chebotarev II, et al. Dietary probiotic Lactobacillus plantarum L-211 for farm animals. II. The additive for piglets. Sel'skokhozyaistvennaya biologiya. 2017;52(2):418-24.
8. Neschislyaev VA, Mokin, PA, Fedorova TV. [On the development of highly effective metabolic probiotics]. Aktual'nye napravleniya nauchnykh issledovanii: ot teorii k praktike. 2016;(2-1):15-7. Russian.
9. Ushakova NA, Nekrasov RV, Pravdin IV, et al. [Mechanisms of the influence of probiotics on symbiotic digestion]. Izvestiya Rossiiskoi akademii nauk. Seriya biologicheskaya. 2015;(5):468-76. Russian.
10. Panin AN, Malik NI. [Probiotics are an essential component of sustainable animal nutrition]. Veterinariya. 2006;(7):19-22. Russian.
11. Chae JP, Pajarillo EA, Oh JK, et al. Revealing the combined effects of lactulose and probiotic enterococci on the swine faecal microbiota using 454 pyrosequencing. Microbial Biotechnology. 2016;(9):486-95.
12. Potthast C, Brinker S, Maier K. Futtermittel aus der Zuckerrubenverarbeitung - neue Daten zu Inhaltsstoffen aus einer bundesweiten Erhebung. Sugar industry. 2011;136(10):663-9.
13. Pritychenko AV, Pritychenko AN, Babina MP, et al. [Intestinal microbiocenosis in weaning piglets]. Aktual'nye problemy intensivnogo razvitiya zhivotnovodstva. 2012;(15-2):258-63. Russian.
