CC BY
14
6. Поздникин, Ю. И. Нейрофизиологический мониторинг состояния нервной системы при хирургическом лечении тяжелых кифосколиозов у детей и подростков / Ю. И. Поздникин [и др.] // Адаптац. различных систем организма при сколиотической деформации позвоночника : методы лечения : Тезисы докл. международ. симп. - М., 2003. - С. 80-81.
7. Попелянский, Л. Ю. Ортопедическая вертебрология (вер-теброневрология) : руководство для врачей / Л. Ю. Попелянский. -М., 2003. - С. 4-9 ; 87-89.
8. Ульрих, Э. В. Аномалии позвоночника у детей / Э. В. Ульрих. -СПб., 1995. - С. 111.
9. Ульрих, Э. В. Ультразвуковая диагностика врожденного порока развития позвонков и спинного мозга у детей / Э. В. Ульрих, А. Ю. Мушкин, М. Г. Млодик. - Л., 1991. - С. 10-19.
10. Яновский, А. М. Спинномозговые расстройства при врожденных пороках и деформациях позвоночника у детей : автореф. дис.... канд. мед. наук / А. М. Яновски. - СПб., 1995.
11. Evans, S. MRI of «idiopathic» scoliosis / S. Evans [et al] // J. Bone Joint Surg. - 1996. - № 78B. - P. 314-317.
12. Machida, M. Pathogenesis of idiopathic scoliosis : SEPs in chicken with experimentally induced scoliosis and in patients with idiopathic scoliosis / M. Machida [et al] // J. Pediatr. Orthop. - 1994. -Vol. 14. - № 3. - P. 329-335.
13. Miller, A. Evaluafion and treatment of diastematomyelia / A. Miller [et al] // J. Bone Jt Surg. - 1993. - № 75 (9). - P. 1308-1317.
РЕЗЮМЕ
Ю. В. Гайдук
Клинико-неврологические нарушения и их коррекция у детей с врожденными пороками развития позвоночника и дис-пластическими сколиозами
Анализ результатов ранней диагностики и медикаментозной коррекции неврологических расстройств у детей с врожденными пороками развития позвоночника и диспластическими сколиозами на основании комплексных клинико-анамнестических данных, резуль-
татов электрофизиологических исследований и нейровизуализации. В клинике вертебрологии на базе Санкт-Петербургской государственной педиатрической медицинской академии проведено комплексное обследование 156 больных в возрасте от 6 месяцев до 16 лет (67 пациентов с врожденными аномалиями позвоночника, 89 человек с диспластическим сколиозом). Из 156 пациентов мальчики составили 48,4 % (76 человек), девочки - 51,6 % (80 человек). Диагноз ставился на основе результатов, полученных при комплексном обследовании, включающем динамический клинико-невроло-гический и ортопедический осмотры, рентгенографию, КТ, МРТ и электромиографию, ультразвуковое исследование.
Ключевые слова: дети, неврологическая симптоматика, врожденные пороки развития позвоночника, диспластический сколиоз.
SUMMARY
Ju. V. Gaiduc
Clinical neurological disorders and their correction in children with congenital abnormalities of the spine development and displastic scoliosis
The aim of the work was to analyse the results of carly diagnosis and pharmaceutical correction of neurological disorders in children with congenital abnormalities of the spine development and displastic scoliosis. The analysis was based on complex investigations of the medical history data, electrophysiological examination results, and neurovisualization conclusions. Thorough examination of 156 patients (76 boys and 80 girls) was carried out in the vertebrology clinic of Saint-Petersburg State Medical Academy. The age of the patients varied from 6 months to 16 years, 67 patients had congenital vertebral abnormalities and 89 - displastic scoliosis. The diagnosis was made on the basis of the results obtained during complex examination which included repeated examinations by a neurologist and orthopedist, radiological examinations, CT, MRI, electromyography and ultrasonic investigations.
Key words: children, neurological symptoms, congenital abnormalities of the spine development, displastic scoliosis.
© В. А. Балясная, 2009 г.
УДК 615.451.13-008.441.33:616.341]-092.4
В. А. Балясная
НАРУШЕНИЯ СЕКРЕТОРНОЙ
ФУНКЦИИ ТОНКОЙ КИШКИ
И ИХ КОРРЕКЦИЯ ПРИ ЭТА-
НОЛОВОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого
Как показытают данные многочисленных эпидемиологических и клинических исследований ученый, распространенность злоупотребления алкоголя стала представлять серьезную угрозу для всех стран мира [4, 9, 10, 16]. Россия лидирует в мире по негативным медико-биологическим и социальным последствиям потребления алкоголя [7]. При этаноловой интоксикации (ЭИ) в организме
возникают многообразные базисные системные морфо-функциональные изменения, приводящие к алкоголь-обусловленной патологии [13, 11]. Одним из важнейших патогенетических звеньев гомеостатических сдвигов при ЭИ являются нарушения функционального состояния тонкой кишки [6, 14]. Результаты исследований указывают, что несмотря на компенсаторные возможности кишечника к различным повреждающим факторам, отсутствие диспептических жалоб у больнык, секреторная функция тонкой кишки в ранние сроки развития ЭИ наиболее уязвима и требует к себе повышенного внимания [6, 13].
Целью данной работы явилось изучение показателей секреторной активности тонкой кишки под влиянием над-венного лазерного облучения крови (НЛОК) в комплексном лечении экспериментальной ЭИ.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальные исследования проведены на 10 здоровых и 80 половозрелых крысах Вистар обоего пола массой тела 220-250 г с моделью ЭИ. Условия содержания и кормления экспериментальных животнык
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
ч СПбГМУ
соответствовали «Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально- биологических клиник», утвержденным Приказом МЗ СССР № 1179 от 10 октября 1983 г. Эксперименты над животными были проведены в соответствии с Европейской конвенцией о защите животных, используемых в эксперименте (Директива 86/609ЕЕС).
I группа - контрольная (20 крыс), с моделью нелечен-ной экспериментальной ЭИ.
Модель ЭИ создавали по методике К В. Шелыгина и со-авт. (2002) введением ежедневно интрагастрально 40 % раствора этанола из расчета 4 г/кг/сут. массы в течение 5 суток.
II группа - опытная (60 крыс) - состояла их двух серий экспериментов, в которых проводилось лечение экспериментальной ЭИ. В первой серии экспериментов опытной группы (30 крыс) сразу после постановки модели ЭИ и в течение 5 суток проводили адекватную компенсацию обменных, водно-электролитных, гемодинамических нарушений, включающих в себя достаточную инфузионно-детоксикационную терапию (водно-электролитные растворы, гемодез из расчета 7 г/кг массы в течение суток внутривенно через хвостовую вену). Во второй серии экспериментов опытной группы (30 крыс) проводили аналогичное лечение с курсом надвенного лазерного облучения крови (НЛОК), состоящим из 5 сеансов. В настоящее время НЛОК отдается предпочтение по ряду причин: полная атравматичность, безопасность в аспектах вероятности внесения в кровь различных инфекционных факторов (абсолютная лазерная стерильность луча), психологическая комфортность для больного, возможность проведения курсового НЛОК в полном объеме как в условиях стационара, так и амбулаторно, отсутствие побочных явлений при правильном подборе режима работы. С целью биоэнергетической активации облучение проводилось ежедневно с помощью гелий-неонового лазера ЛГ-79-1 с длиной волны 632 нм при мощности на выходе световода 2 мВт экспозицией 20 мин на область проекции бедренной вены и наружной яремной вены.
Сроки наблюдений - 1, 2, 3 суток после окончания лечения. Эвтаназию животных проводили декапитацией, предварительно анестезируя фторотаном. Экспериментальные исследования выполнялись в соответствии с Методическими рекомендациями «Деонтология медико-биологического эксперимента» (1987), а также с соблюдением правил гуманного отношения с животными (Report of the AVMA Panel on Euthanasia JAVMA, 2001).
Решая проблему исследования показателей мембранного и полостного пищеварения в тонкой кишке, мы использовали методы определения амилолитической и ли-политической активности слизистой оболочки названного отдела кишечника. Применяли методику, разработанную Ц. Г. Масевичем, A. M. Уголевым (1967) в модификации Л. В. Дановского [2] (1976), дающую возможность определить состояние полостного и мембранного пищеварения в тонкой кишке на основе прочной связи амилазы и липазы с клеточной мембраной. Указанная методика позволяет дать оценку секреторной активности тонкой
кишки, удовлетворяющую всем физиологическим требованиям. Методика состоит в сравнении амилолитической и липолитической активности 5 проб, полученных в результате последовательного промывания в растворе Рингера кусочка слизистой оболочки средней трети тощей кишки животных (не более 12 мг). Первую пробу, обозначаемую как фракция С (смываемая), получали путем отмывания кусочка слизистой оболочки в растворе Рингера в течение 30 с. Три последующие пробы, обозначаемые как фракции Д1, Д2 и Д3 (десорбируемые), получали путем последовательного помещения кусочка слизистой оболочки тонкой кишки в 3 разные порции раствора Рингера, в котором пробы в течение 3 мин встряхивались с помощью специального аппарата. Пятую пробу, обозначаемую как фракция Г (гомогенат), получали путем гомогенизации кусочка слизистой оболочки, прошедшего указанные стадии обработки. Все полученные пробы центрифугировали при 5000 об. в течение 10 мин, а затем в предварительно подготовленные 2 ряда пробирок по 5 в каждом ряду, отмеченных соответственно 5 фракциям, переносили по 1,5 мл надосадочной жидкости. В первом ряду пробирок для определения амилоли-тической активности в качестве субстрата использовали 2 мл 0,1 % раствора крахмала, а во втором ряду для определения липолитической активности - 10 мл 0,04 % эмульсии трибутирина. Инкубацию проводили в течение 30 мин в водяной бане при 37-38 оС в аппарате с постоянным встряхиванием. В контрольных пробах, которые готовились при каждом исследовании тех же реактивов, 1,5 мл надосадочной жидкости (источник фермента) заменяли раствором Рингера.
Для определения амилолитической активности контрольный и исследуемые растворы колориметрировали в фотоэлектроколориметре (ФЭК) при красном светофильтре против дистилированной воды. Количество гид-ролизованного крахмала (У-мкг/мг/мин) рассчитывали по формуле
у = а - (К - К,)
у Н - С - К , где а - количество крахмала, равное 2000 микрограмм, взятое для инкубации с источником фермента в 2 мл 0,1 % раствора; К - показания ФЭК контрольного раствора; К1 - показания ФЭК опыта (С, Д, Д, Д , Г); Н - вес кусочка слизистой оболочки тонкой кишки, взятого для исследования; С- постоянный коэффициент, равный 11,25.
Липолитическую активность слизистой оболочки тонкой кишки оценивали сталагмометрическим методом по формуле
х = 355,5 - (К2 - К,) Н - (К2 - К,) ,
где X - количество гидролизованного трибутирина (в мкт/ мг/мин); К1 - число капель в контрольном растворе; К2 -число капель в контрольной эмульсии трибутирина; К -число капель эмульсии трибутирина в фракциях С, Д, Д2, Д3 и Г после инкубации с источником фермента; Н - вес
кусочка слизистой оболочки тонкой кишки; 355,5 -постоянный коэффициент.
Фракция С отражает активность амилазы и липазы в межворсинчатых пространствах и используются как один из показателей полостного пищеварения. Фракции Д в виде суммы активности этих фракций (ХД), а также фракция Г отражают количество адсорбированной и прочно связанной амилазы и липазы, что дает возможность использовать эти пробы как показатели состояния мембранного пищеварения. На основании определения показателей липолитической и амилолитической активности слизистой оболочки тонкой кишки животных мы
У Д + г
вычисляли коэффициент K = ^-для амилазы и липазы, который имеет большое диагностическое значение и выражает соотношение между мембранным и полостным пищеварением.
Гистохимическому исследованию подвергали материал, взятый из средней трети тонкой кишки. Полученный
гистологический материал фиксировался в 10 % растворе нейтрального формалина (с РН 7,2-7,4). Парафиновые блоки и парафиновые среды готовили по стандартной методике.
В данной работе, помимо исследования амилолити-ческой и липолитической активности слизистой оболочки тонкой кишки, гистохимически в названом отделе кишечника животных изучалась активность щелочной фос-фатазы (ЩФ) и сахарозы - энзимов, катализирующих метаболические процессы. Протеолитический фермент ЩФ катализирует в щелочной среде расщепление эфи-ров ортофосфорной кислоты на различные спирты и фенолы. В тонкой кишке отмечается большая активность ЩФ. В наших исследованиях активность ЩФ в слизистой оболочке тонкой кишки животных определяли тетразоли-евым методом в модификации J. Мс. Qadey (1970) [5].
Сахароза - важнейший дисахарид - образуется в результате связывания глюкозы и фруктозы, за счет восстанавливающих групп обоих сахаров. Активность сахарозы в слизистой оболочке тонкой кишки животных вы-
0,35
Контрольная Опытная Опытная группа группа группа
серия1 серия 2
j через 1 сут.
черз 2 сут. [-]через 3 сут.
3,5
3 -2,5 __ 2 __ 1,5 1 -0,5 -0 __
т.
■
■
■
Норма Контрольная Опытная Опытная группа группа группа
серия 1 серия 2
^через 1 сут. ^через 2 сут. цчерез 3 сут.
J
ШШ
■
Норма
Контрольная группа
Опытная группа 1
Опытная группа 2
^через 1 сут. ^ через 2 сут. □ через 3 сут.
Норма Контрольная Опытная Опытная группа группа 1 группа 2
1 через 1 сут. йчерез 2 сут. □ через 3 сут.
Влияние традиционных методов лечения и надвенного лазерного облучения крови на состояние секреторной активности тонкой
кишки у животных с этаноловой интоксикацией
являли сопряженным окислением глюкозы с применением нитротетразолия синего в модификации Z. Lojda (1965) [5].
Весь полученный цифровой материал был подвергнут статистической обработке методом вариационной статистики [1, 3], с использованием пакета статистических программ Statgraph, записанного на компьютере типа IBM PC 180386/40. На основании величин и числа наблюдений по таблице Стьюдента определяли вероятность различий (р). Различия расценивались как достоверные, начиная со значений р<0,05, т. е. когда вероятность различия была равна или превышала 95 %.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ результатов, проведенных в данной работе, свидетельствует, что в первые 3 суток после эксперимента у нелеченных животных с моделью ЭИ отмечаются прогрессирующие нарушения секреторной активности тонкой кишки (рисунок). Это проявлялось в ослаблении активности процессов мембранного гидролиза и резком снижении адсорбционной способности слизистой оболочки тонкой кишки животных.
Результаты исследования секреторной функции тонкой кишки биохимическими и гистохимическими методами свидетельствуют, что у нелеченных животных в динамике развития ЭИ резко уменьшалась амилолитиче-ская и липолитическая активность слизистой оболочки тонкой кишки, а также активность щелочной фосфатазы и сахарозы (таблица).
В доступной нам литературе мы не нашли убедительных исследований секреторной активности тонкой кишки на фоне традиционных методов лечения ЭИ. Вместе с тем клинические и экспериментальные наблюдения подавляющего большинства исследователей свидетельствуют о выраженных восстановительных процессах в тканях кишечной стенки, обеспечивающих компенсаторные приспособления данного органа при различных патологических процессах [5, 11]. Сравнительный анализ показателей секреторной функции тонкой кишки у животных опытной группы 1 серии позволил установить, что активность ферментных систем мембранного и полостного пищеварения продолжала оставаться сниженной по сравнению с нормой (рисунок).
Так, коофициент К, который выражает взаимоотношения мембранного и полостного пищеварения, для амилазы через 2 суток после лечения традиционными методами был равен 2,03± 0,21, а для липазы - 2,84±0,17, что ниже соответственно на 0,27 и на 0,35 по сравнению с данными, полученными у здоровых животных.
Гистохимические методы исследования щелочной фосфатазы и сахарозы в слизистой оболочке тонкой кишки у животных опытной группы 1 серии, в лечении которых применялись только традиционные методы терапии, подтверждали и дополняли характеристику ферментного спектра названного отдела кишечника: отмечалось снижение активности указанных энзимов в ткани тонкой кишки, даже на 3-и сутки после эксперимента, по сравнению с нормой.
Таким образом, традиционные методы лечения ЭИ не способствуют в первые 3-и сутки после эксперимента нормализации показателей, отражающих секреторную функцию тонкой кишки.
Сравнительный анализ показателей мембранного гидролиза и активности щелочной фосфатазы и сахарозы в слизистой оболочке тонкой кишки выявил, что применение у животных НЛОК в комплексном лечении ЭИ уже через сутки ускоряет восстановление секреторной активности кишечника. Это проявлялось в увеличении показателей коофициента К амилолитической и липолитической активности тонкой кишки (рисунок).
Увеличилась также активность щелочной фосфатазы и сахарозы в слизистой оболочке тонкой кишки крыс 2 серии опытной группы по сравнению с показателями, полученными у животных, в лечении которых применялись только традиционные методы терапии (рисунок).
На 2-е сутки эксперимента активность щелочной фос-фатазы в слизистой оболочке тонкой кишки животных опытной группы 2 серии достоверно возросла в 1,2 раза в сравнении с результатами, полученными у крыс, леченных традиционными методами (Р<0,05) (рисунок).
Анализ полученных данных свидетельствует, что под влиянием НЛОК, применяемом в комплексном лечении экспериментальной ЭИ, достаточный уровень ферментативной активности тонкой кишки восстанавливался
Влияние традиционных методов лечения и надвенного лазерного облучения крови на состояние секреторной активности тонкой кишки у животных с этаноловой
интоксикацией
Продолжительность наблюдений (сут.) K амилазы K липазы Активность ферментов (у.е.)
щелочной фосфатазы сахарозы
Норма
2,30±0,24 3, 19±0,14 0,71±0,02 0,30±0,04
ЭИ без лечения
1 2,01±0,21 2,83±0,17 0,44±0,02 * 0,16±0,01 *
2 1,71±0,12 * 2,71±0,11 * 0,36±0,02 * 0,13±0,05 *
3 1,64±0,10 * 2,15±0,15 * 0,31±0,03 * 0,12±0,02 *
ЭИ + лечение традиционными методами
1 2,05±0,20 2,92±0,14 0,44±0,02 0,16±0,01
2 2,03±0,21 2,84±0,17 0,42±0,03 0,18±0,01
3 2,14±0,21 2,77±0,10 ** 0,52±0,03 ** 0,16±0,01
ЭИ + лечение традиционными методами + НЛО
1 2,12±0,21 2,98±0,15 0,49±0,03 0,21±0,01
2 2,25±0,19 3, 10±0,14 0,58±0,03 *** 0,17±0,01
3 2,29±0,22 3,18±0,16 0,62±0,02 *** 0,28±0,02 ***
* достоверны по отношению к здоровым животным (р<0,05); ** достоверны по отношению к показателям животным контрольной группы (р<0,05); *** достоверны по отношению к показателям животным, в лечении которых применялись только традиционные методы терапии (р<0,05).
в среднем через 3 суток после окончания лечения (рисунок). Это проявлялось в увеличении до исходных контрольных показателей коофициента К для амилазы и липазы у животных 2 серии опытной группы на 3-и сутки после лечения. Отмечалось также увеличение активности щелочной фосфатазы и сахарозы в слизистой оболочке тонкой кишки по сравнению с показателями, полученными у крыс I серии.
Так, на 3-и сутки эксперимента активность щелочной фосфатазы в слизистой оболочке тонкой кишки животных 2 серии опытной группы достоверно возросла в 1,2 раза, а сахарозы в 1,8 раза, в сравнении с результатами, полученными у крыс, леченных традиционными методами (Р<0,05).
Таким образом, применение НЛОК в комплексном лечении ЭИ ускоряет у животных восстановление секреторной активности тонкой кишки. Важно отметить, что усиление секреторной активности тонкой кишки под влиянием НЛОК, применяемом в комплексном лечении экспериментальной ЭИ, вероятно, может считаться эффективным резервным механизмом, обеспечивающим быструю адаптацию метаболических процессов в изученном отделе кишечника. Причем такое адаптационное повышение активности ферментов мембранного и полостного пищеварения в тонкой кишке наиболее четко выражено у животных, в комплексном лечении которых применялось НЛОК.
ЛИТЕРАТУРА
1. Александров, В. В. Обработка медико-биологических данных на ЭВМ / В. В. Александров, В. С. Шнейдеров. - Л., Медицина, 1984. - 160 с.
2. Дановский, Л. В. Клинические исследования мембранного пищеварения / Л. В. Дановский. - Казань, 1967. - 197 с.
3. Клабукова, Е. Р. Математическое прогнозирование коэффициентов массы внутренних органов подопытных крыс в эксперименте / Е. Р. Клабукова // Мед. акад. жур. - 2003. - Т. 3. - № 3. -С. 183-184.
4. Кошкина, Е. А. Распространенность алкоголизма и наркомании среди населения России / Е. А. Кошкина // Психиатрия и психофармакотерапия. - 2002. - № 3. - С. 89-91.
5. Лили, Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия / Р. Лилли. - М., 1969. - 643 с.
6. Махов, В. М. Системная патология органов пищеварения алкогольного генеза. «Болезни органов пищеварения» / В. М. Махов // Рос. мед. журн. - 2006. - № 1. - С. 5-13.
7. Минаев, С. В. Алкоголизация населения - медико-социальная проблема / С. В. Минаев // Новые Санкт-Петербург. врачеб. ведомости. - 2005. - № 2. - С. 32-34.
8. Немцов, А. В. Алкогольный урон регионов России / А. В. Немцов. - М., 2003. - 120 с.
9. Никифоров, И. А. Эпидемиологические аспекты наркотизма / И. А. Никифоров // Медицинская помощь : науч.-практ. журн. -2005. - № 4. - С. 9-15.
10. Материалы Всерос. форума «Алкоголь и здоровье населения России 1900-2000». - М., 2000. - С. 167-173.
11. Соловьева, Н. М. Биокоррекция биохимических и микробиологических проявлений алкогольной интоксикации / Н. М. Соловьева, С. М. Лейхитер, Н. А. Шидркова // Науч. рос. конф., посвящ. 175 летию со дня рождения С. П. Боткина. 29-31 мая 2007. - 2007. - С. 68-69.
12. Уголев, А. М. Гормоны пищеварительной системы : физиология, патология, теория функциональных блоков / А. М. Уголев, О. С. Радбиль. - М., 1995. - 238 с.
13. Удовенкова, Л. П. Клинико-социальные аспекты гепаторе-нального синдрома алкогольной интоксикации / Л. П. Удовенкова, П. И. Сидоров, А. Т. Соловьев // Науч. рос. конф., посвящ. 175-летию со дня рождения С. П. Боткина. 29-31 мая 2007. -2007. - С. 71-72.
14. Шабанов, П. Д. Биология алкоголизма / П. Д. Шабанов, С. Ю. Калишевич. - СПб., 1998. - 272 с.
15. Шелыгин, К. В. Использование лабораторных животных в токсикологическом эксперименте / К. В. Шелыгин, И. А. Кирпич, В. Е. Леонтьев ; под ред. проф., академика РАМН П. И. Сидорова. -Архангельск, 2002. - 19 с.
16. Schoppet, M. Alcohol and the heart / M. Schoppet, B. Maisch // Herz. - 2001. - Vol. 26. - № 5. - P. 345-352.
SUMMARY
В. А. Балясная
Нарушения секреторной функции тонкой кишки и их коррекция при этаноловой интоксикации в эксперименте
Целью данной работы явилось изучение показателей секреторной активности тонкой кишки (САТК) под влиянием надвенного лазерного облучения крови (НЛОК) в комплексном лечении экспериментальной этаноловой интоксикации (ЭИ) у крыс. Исследование показало, что традиционные методы лечения ЭИ не нормализуют САТК. Использование НЛОК в комплексном лечении ЭИ ускоряет восстановление САТК у животных.
Ключевые слова: секреторная функция, тонкая кишка, эта-ноловая интоксикация, лазерное облучение.
SUMMARY
V. Д. Balyasnaya
Secretory activity disorders in the small intestine and their correction in experimental ethanol intoxication
The aim of the work was to study the indices of the secretory activity of the small intestine (SASI) after above-venous laser irradiation (LI) of blood in complex treatment of experimental ethanol intoxication (EI) in rats. The investigation showed that traditional methods of EI tratment failed to normalize SASI wheras the method of above venous LI sped up the SASI recovery in the animals.
Key words: secretory activity, small intestine, ethanol intoxication, laser irradiation.
ч СПбГМУ ..
© Л. Ю. Гривцова, 2009 г. УДК 612.119:616.155.3
Л. Ю. Гривцова
ЭКСПРЕССИЯ ОБЩЕЛЕЙКОЦИТАРНОГО АНТИГЕНА СБ45 НА МОБИЛИЗОВАННЫХ (СБ34+) СТВОЛОВЫХ КЛЕТКАХ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ
Лаборатория иммунологии гемопоэза, централизованный клинико-лабора-торный отдел ГУ РОНЦ имени Н. Н. Блохина РАМН
ВВЕДЕНИЕ
Экспрессия общелейкоцитарного антигена (СБ45) характерна для всех гемопоэтических клеток, включая ранние, морфологически незрелые формы. Исключением являются эритроциты, зрелые тромбоциты и плазматические клетки. На стволовых кроветворных клетках экспрессия молекулы С045 слабая в сравнении с лимфоцитами. По мере созревания стволовых кроветворных клеток уровни экспрессии общелейкоцитарного антигена нарастают [6, 13].
Отсутствие С045 на фракции стволовых клеток может, скорее, характеризовать стволовые клетки другой, нежели гемопоэтическая, природы (мезенхимальные, нейро-нальные), происходящие, как и стволовая кроветворная клетка-предшественница, из эмбриональной стволовой, плюрипотентной клетки [5, 8].
Экспрессия молекулы СБ34 в сочетании со слабой, фоновой экспрессией С045-антигена возможна на клетках-предшественницах эндотелиальной природы [15], однако большинство таких С034+-предшественников будут отрицательны по экспрессии С045-антигена.
Факт экспрессии С045 на гемопоэтических стволовых клетках (СКК) положен в основу стандартных цитометри-ческих протоколов для подсчета абсолютного количества стволовых гемопоэтических клеток в образце [3].
По мере накопления данных оказалось, что экспрессия антигена С045 на СКК неоднозначна. Так, при изучении мобилизованных аутологичных СКК у 72 % пациентов с последствиями тяжелой травмы спинного мозга нами выявлена отчетливая фракция С034+-клеток с крайне слабой (ниже уровня гранулоцитов) экспрессией СБ45 или с полным ее отсутствием [14].
Возможно, столовые кроветворные клетки с отсутствием экспрессии С045 входят в состав фракции наиболее ранних СКК, иммунофенотип которых в настоящее время описывают как СБ34+Ип-,НЬА-БК-- СБ38-, ТЪу-1+/к™ [7, 12].
Целью работы явилась характеристика мобилизованных (СБ34+) СКК здоровых доноров кроветворной ткани для аллогенной трансплантации в отношении экспрессии антигена СБ45 и маркеров, ассоциированных с фракцией ранних СКК, - молекул НЬА-ОЯ и С038.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Оценено 63 образца клеток лейкоконцентрата (обогащенная фракция мобилизованных стволовых клеток периферической крови) у 59 здоровых доноров кроветворной ткани для аллогенной трансплантации. Средний возраст доноров составил 34 года (от 17 до 48 лет), преобладали женщины (42 - женщины, 17 - мужчины).
Мобилизацию СКК проводили в монорежиме: Г-КСФ без химиотерапии (в 1-3 дни по 5,0 мкг/кг веса, дважды, четвертый день по 10,0 мкг/кг веса дважды). Лейкокон-центрат получали путем сепарации клеток периферической крови на аппарате «Cobe Spectra» (лейкаферез).
Материал для полноценной трансплантации (2,0х106 и более СБ34+-клеток/кг массы тела реципиента) в большинстве случаев был набран за 1 сеанс лейкафереза. Для 8 пациентов потребовалось за 2 лейкафереза, для одного пациента проведено 3 процедуры сбора СКК.
Статистический анализ данных включал корреляционный анализ и сравнение средних с использованием коэффициента Стьюдента. Непараметрические данные сопоставлены посредством таблиц сопряжения. Использована программа SPSS версия 12 for Windows.
Оценка качества трансплантационного материала осуществлялась иммунологически в реакции прямой иммуно-флуоресценции с учетом данных на проточном цитомет-ре. При пробоподготовке использовали метод лизиса с отмывкой. Ввиду необходимости оценки субпопуляций стволовых клеток, в том числе и оценки количества Сй34+СВ45--клеток, исходный протокол нами модифицирован. Подсчет СКК в образце на лейкоциты проводили стандартно, а при оценке субпопуляций в анализ включались все СБ34+-образца, затем в пределах гейта CD34+-клеток оценивалась экспрессия антигенов CD45, HLA-DR CD38 (рис. 1). Использованы следующие комбинации антител и флюорохромов: CD34PerCP/DRPE/CD38FITC, CD34PerCP/DRPE/CD45FITC и CD34FITC/DRPE/ CD45PerCP.
В работе применены прямые коньюгаты моноклональ-ных антител к антигенам: CD34: клон HPCA-2a (8G12), IgG 1, метка РЕ, клон HPCA-2a (8G12), IgG1, метки PerCP, PE-cy5 клон BIRMA-K 3, CD45, метки FITC, PE-cy5, HLA-DR и CD38 (метки FITC, PE), и изотипические контроли соответствующего изотипа с необходимой флуоресцентной меткой (PE, FITC, PerCP. PE-cy5).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Относительное содержание CD34+-клеток в образцах лейкоконцентратов среди лейкоцитов составило 0,35±0,03 % (от 0,02 до 1,25 %). На предмет экспрессии CD45 оценено 63 лейкоконцентрата, и всего лишь в 2 образцах популяции CD45neg CD34+-клеток нами не выявлено. Экспрессия общелейкоцитарного антигена на стволовых CD34+-клетках значительно варьировала от слабой (гранулоциты) до строго негативной (рис. 2). Мы условно разделили уровни экспрессии CD45 в пределах фракции стволовых клеток:
