CC BY
16
ТОМ 3 / VOL. 3
МАТЕРИАЛЫ II ВСЕРОССИЙСКОЙ КОНФЕРЕНЦИИ
113
классификации, полученной на основании расширенной панели с использованием ПЦР-метода и полученной стандартным ИГХ-методом (совпадение составило 61,7 %).
Выводы. Уровень экспрессии генов, кодирующих классические ИГХ-маркеры, хотя и отражает закономерности отличия фенотипов, тем не менее не является достаточным для прецизионной верификации. Молекулярный фенотип, определяемый методом анализа экспрессии мРНК с применением ПЦР в реальном времени с использованием панели из 19 генов, более адекватно отражает клинические отличия молекулярных подтипов (уровень безрецидивной выживаемости в группах). Полученные результаты совпадают с имеющимися в литературе данными о недостаточности используемой в настоящее время методики определения молекулярного фенотипа на основе ИГХ-метода («суррогатный метод») и необходимости перехода на расширенные панели с применением количественных молекулярно-биологических методов.
Комплексная экспрессия раковых тестикулярных антигенов в клетках HeLa
Д. И. Водолажский, Х.А. Могушкова, А. А. Пушкин, И. В. Межевова, Н.Н. Ткмошкина
ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, Ростов-на-Дону
Введение. Раковые тестикулярные антигены (РТА) в силу топически ограниченного характера их экспрессии, преимущественно в малигнизированных тканях, могут эффективно распознаваться иммунной системой пациентов с онкологическими заболеваниями. Это свойство предоставляет возможность использования РТА в качестве вакцин, активно стимулирующих специфичный иммунный противоопухолевый ответ.
Задачи исследования. Изучение в модельных условиях в клетках HeLa спектра экспрессии РТА.
Материалы и методы. В модельном эксперименте использовали культуру перевиваемых адгезионных клеток HeLa (рак шейки матки), выращенную в стандартных условиях. Определение относительной экспрессии 12 генетических локусов (GAGE4, CTAG1B, BAGE, MAGEA1, MAGEB2, MAGEA3, GAGE1, MAGEC1, MAGEB1, MAGEA4, MAGEA2, GAGE3) проводили методом RealTime qPCR (RT-qPCR). Суммарную РНК из тканей выделяли по методу P. Chomczynski и N. Sacchi (2006). Для синтеза библиотеки кДНК использовали набор реагентов «РЕВЕРТА-L» («Интерлабсервис», Россия). Праймеры разработали с использованием базы данных NCBI GenBank. RT-qPCR-амплификацию проводили на термоциклере Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, USA). Гене -тический локус GAPDH использовали в качестве референтного.
Результаты. Как следует из наших данных, все исследованные локусы по уровням транскрипционной активности разделились на подгруппы: высокоэкспрессивный локус — GAGE4; ограниченно-экспрессивные локусы - CTAG1B, BAGE, MAGEA1, MAGEB2, MAGEA3; низкоэкспрессивные локусы — GAGE1, MAGEC1, MAGEB1, MAGEA, MAGEA2; ультранизкоэкспрес-сивный локус — GAGE3.
Уровень относительной экспрессии РТА-генов выявил высокую вариабельность, достигающую диапазона почти 100-кратного размаха. Однако принадлежность к одному семейству не являлась гарантией однотипных показателей экспрессии исследованных локусов. Для семейства MAGE это предположение в рамках данного исследования подтвердилось: локусы MAGEA1, MAGEB2 и MAGEA3 проявляли идентичные уровни транскрип -ционной активности.
Выводы. Полученные данные позволяют более эффективно использовать линии перевиваемых клеточных культур, использующихся для антигенной нагрузки дендритно-клеточных вакцин, применяемых для лечения различных онкологических заболеваний.
Нарушение копийности генов EGFR и CCND1 при раке ротовой полости до и после лучевой терапии
Е.В. Голуб, В. В. Полькин, Г.Ф. Михайлова, Т. Г. Шкаврова, В. В. Цепенко, В. С. Медведев, П. А. Исаев
Медицинский радиологический научный центр им. А.Ф. Цыба — филиал ФГБУНМИРЦМинздрава России, Обнинск
Введение. В настоящее время остается актуальным решение задачи эффективного лечения и вероятности прогнозирования рецидива рака ротовой полости. В патогенезе данного заболевания несомненно участие генов EGFR и CCNDI, нарушение копийности которых способствует аномальной пролиферации и предотвращает апоптоз. Можно предположить, что одновременная оценка генетического статуса CCNDI и EGFR позволит выделить пациентов с повышенным риском рецидива и плохим прогнозом.
Задачи исследования. Изучение частоты клеток с нарушенной копийностью генов EGFR и CCNDI как прогностических маркеров рецидива.
Материалы и методы. Исследовали частоту клеток с нарушением числа копий генов EGFR и CCNDI в мазках слизистой оболочки ротовой полости 9 пациентов с различной стадией плоскоклеточного рака ротовой полости и разной локализацией опухоли до лечения и после суммарной очаговой дозы 19,0—28,8 Гр. У 5 пациентов в качестве внутреннего контроля взяты мазки слизистой оболочки ротовой полости со стороны, противоположной опухоли. Использовали метод интер-
сч
CS
со ш и
X ш
и
114
МАТЕРИАЛЫ II ВСЕРОССИЙСКОЙ КОНФЕРЕНЦИИ
ТОМ 3 / VOL. 3
см
>-
CS
со ш и
X ш
и
фазной флуоресцентной in situ гибридизации (I-FISH). Просчитано по 100—400 клеток для каждого образца.
Результаты. У пациентов группы внутреннего контроля частота клеток с повышенным числом копий генов EGFR и CCND1 не превышала 4,5 %. В мазках опухолевой ткани всех пациентов, взятых до проведения лучевой терапии, частота клеток с повышенной ко-пийностью генов EGFR и CCND1 варьировала в диапазонах 3,5—71,0 и 5,5—71,5 % соответственно. Полученные данные не зависели от стадии заболевания и места локализации опухоли. В группе пациентов с внутренним контролем частота клеток с повышенной копий-ностью обоих генов достоверно (р < 0,05) превышала показатели их собственного контроля. После проведения лучевой терапии у 4 пациентов отмечалось увеличение частоты клеток с повышенной копийностью генов EGFR и CCND1. Еще у 4 пациентов, наоборот, частота этих клеток снижалась, оставаясь достоверно (р < 0,05) выше показателей внутреннего контроля. У 1 пациента наблюдалась противоположная динамика частоты клеток с нарушенной копийностью генов EGFR и CCND1.
Выводы. Полученные данные свидетельствуют об индивидуальной реакции организма пациентов на проведение лучевой терапии и необходимости дальнейших исследований.
Мутационный статус гена BRAF и клинико-морфологические особенности меланомы кожи
И.Ю. Ефимова, Д. И. Водолажский, С. С. Кочуев
ФГБУ«Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, Ростов-на-Дону
Введение. Меланома кожи человека — исключительно агрессивная опухоль с высоким уровнем летальности и высокой склонностью к рецидивам и метастазиро-ванию. Оценка ряда морфологических характеристик новообразования имеет существенное значение при определении прогноза течения заболевания и формировании групп риска у больных меланомой кожи.
Задачи исследования. Определение ассоциаций между мутационным статусом гена BRAF и клинико-морфологическими особенностями меланомы кожи у пациентов Юга России, проходивших плановое лечение в Ростовском научно-исследовательском онкологическом институте в 2013—2015 гг.
Материалы и методы. В исследовании участвовали 50 мужчин в возрасте от 7 до 83 лет (медиана 56,5 года) и 50 женщин в возрасте от 24 до 80 лет (медиана 51 год) с морфологически подтвержденным диагнозом меланомы кожи. Проводили прямое секвенирование по Сэн-геру, Real-Time PCR. Для статистической обработки данных использовали непараметрический критерий Манна—Уитни, точный критерий Фишера и таблицы
сопряженности с применением критерия х2 для порогового уровняp < 0,05.
Результаты. Присутствие мутации в гене BRAF было статистически достоверно ассоциировано с увеличением уровня инвазии по Кларку (р < 0,05). Также установлено, что опухоли с активирующими мутациями в гене BRAF чаще возникали на участках кожи, подверженных периодической инсоляции (туловище), тогда как опухоли с wtBRAF преобладали на участках кожи с хроническим солнечным облучением (голова и шея). Подобные данные согласуются с исследованиями, проведенными ранее.
Общая частота проявления соматических мутаций У600 в гене BRAF составила 57 %. Нами установлены 3 варианта мутаций в экзоне 15 гена BRAF: р.У600Б, р.У600Ки У600 К601>Е. Мутация У600 К601>Е впервые диагностирована у пациента популяции Юга России. Частота проявления BRAF-мутаций составила: р.У600Е — 88 %, р.У600К - 10 % и К601>Е - 2 % случаев от всего количества мутаций.
Выводы. Установлено, что присутствие мутаций в гене BRAF было достоверно связано с увеличением уровня инвазии по Кларку. Обнаружено, что опухоли с активирующими мутациями в гене BRAF чаще возникали на участках кожи, подверженных периодической инсоляции (туловище). Опухоли без мутаций в гене BRAF преобладали на участках кожи с хроническим солнечным облучением (голова и шея). Общая частота проявления соматических мутаций У600 в гене BRAF составила 57 % (57 из 100 пациентов). В рамках настоящего исследования в гене BRAF были выявлены 3 варианта мутаций с различными частотами встречаемости: р.У600Е (88 %), р.У600К (10 %) и К601 >Е (2 %).
Количественный анализ опухолевых стволовых клеток в биопсийном материале трижды негативного рака молочной железы до лечения
И. А. Замулаева, Н.В. Орлова, С. Г. Смирнова, А.А. Енилеева, И.А. Смирнова
Медицинский радиологический научный центр им. А.Ф. Цыба — филиал ФГБУНМИРЦМинздрава России, Обнинск
Введение. В последние годы продемонстрировано существование опухолевых стволовых клеток (ОСК) в злокачественных новообразованиях различной локализации и стабильных линиях опухолевых клеток человека и животных. Рак молочной железы (РМЖ) был первой солидной опухолью, в которой установлено наличие ОСК. К настоящему времени накоплен значительный массив экспериментальных данных о более высокой резистентности ОСК к действию ионизирующего излучения и ряда химиопрепаратов по сравнению с остальными клетками опухоли, а также выяснены
