CC BY
90
ОБЗОРЫ
DOI: 10.23868/201812041
направленное перепрограммирование дифференцированных клеток в миогенном направлении
Ф.А. Индейкин1, М.О. Мавликеев2, Р.В. Деев3' 4
1 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия
2 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
3 ПАО «Институт Стволовых Клеток Человека», Москва, Россия
4 Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Рязань, Россия
DIRECTED MYoGENic REPROGRAMMING oF DIFFERENTIATED cELLs
F.A. Indeikin1, M.O. Mavlikeev2, R.V. Deev3 4
1 Kazan State Medical University, Kazan, Russia
2 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia
3 PJSC «Human Stem Cells Institute», Moscow, Russia
4 I.P. Pavlov Ryazan State Medical University, Ryazan, Russia
e-mail: f.indeickin@Yandex.ru
Морфологическим проявлением первичных миопатий является прогрессирующая утрата мышечной ткани с замещением её на соединительную ткань, ввиду чего возникает необходимость в компенсации клеточных потерь. В настоящее время отсутствуют отработанные методики, позволяющие восполнить клеточный пул пораженной мышцы. Методом, потенциально способным скорректировать проявления таких заболеваний, является направленное перепрограммирование клеток. Несомненным преимуществом этого подхода является отсутствие необходимости возвращения клеток в плюрипотентное состояние, что теоретически позволяет использовать его in vivo. С момента разработки этого метода в 1987 году R.L. Davis и H.M. Weintraub накоплен достаточный опыт по перепрограммированию в миогенном направлении in vitro. Настоящий обзор направлен на освещение фундаментальных основ метода направленного перепрограммирования, определение его положения в системе клеточных преобразований, анализ достижений в области направленного перепрограммирования и обсуждение нерешенных вопросов.
ключевые слова: направленное перепрограммирование, трансдифференцировка, миопатии, MyoD, клеточная терапия, метаплазия.
введение
Направленное перепрограммирование клеток — это искусственно индуцируемый процесс преобразования дифференцированной соматической клетки одного вида в другой без возвращения к стадиям с более высокой потентностью, основой которого является активация участков генома, детерминирующих развитие клетки в необходимом направлении [1-3]. В основе направленного перепрограммирования лежит явление трансдифференци-ровки. Общепринятым примером трансдифференцировки в естественных условиях считается процесс преобразования клеток наружной стороны зонтика в секретирующий перисарк (наружный органический скелет гидроидных медуз) у медузы Turritopsis nutricula [4]. Впервые искусственно индуцированная трансдифференцировка описана и произведена R.L. Davis и H.M. Weintraub (1987) [5]. Ими была продемонстрирована возможность прямого преобразования линии C3H10T1/2 мышиных эмбриональных фибробластов в миобласты за счет сверхэкспрессии гена myod, доставленного в клетку посредством цитомегаловирусного вектора.
Одной из областей потенциального практического применения технологии направленного перепрограммирования является коррекция первичных миопатий — гетерогенной группы заболеваний с прогредиентным течением, характеризующихся нарушением сократительной
A morphological manifestation of myopathies is progressive lesion of muscular tissue with it substitution by connective tissue which makes it necessary to compensate cell loss. To date, methods which can replenish a cell pool in an affected muscle are absent. A method which potentially can correct manifestations of such diseases is a direct cell reprogramming. The undoubted advantage of this approach is an absence of necessity of returning cell in a pluripotent stage which allows to use it in vivo. The great experience in myogenic conversion was accumulated since discovering this method in 1987 by R.L. Davis and H.M. Weintraub. This review is aimed to describe the fundamental bases of direct cell reprogramming, it's positioning in the system of cell fate routes, analysis of achievements in direct cell reprogramming field and discussion about unsolved issues.
Keywords: direct reprogramming, transdifferetiation, MyoD, cell therapy, metaplasia.
функции скелетных мышц, уменьшением или утратой двигательной активности [6-8].
Так как морфологическим проявлением миопатий является прогрессирующая утрата мышечной ткани, с особой актуальностью встает вопрос об источнике клеток, способных компенсировать эту утрату в морфофизиоло-гическом отношении.
Как известно, одним из наиболее передовых и перспективных в практическом отношении открытий в области клеточных биотехнологий является создание клеток с индуцированной плюрипотентностью (иПСК), впервые полученных научной группой под руководством S. Yamanaka (2006) из мышиных фибробластов дермы [9]. Образовавшиеся в результате ретровирусной трансдук-ции набором генов транскрипционных факторов Oct4, Klf4, Sox2 и c-Myc клетки оказались способны дифференцироваться в клетки всех зародышевых листков и формировать тератомоподобные опухоли in vivo. Полученные с помощью такой технологии клетки после коммитирова-ния и дифференцировки могут быть трансплантированы непосредственно в ткани или же предварительно модифицированы с целью коррекции генетических дефектов, что было продемонстрированно экспериментально [10-12].
Недостатком этой технологии является многоступенчатость процесса преобразования клеток, включающего их извлечение из организма, перепрограммирование,
рис. 1. Схема использования иПСК и метода направленного перепрограммирования клеток: 1 — путь использования иПСК предполагает индукцию плюрипотентности у фибробластов дермы с последующим коммитированием в миобласты и трансплантацией; 2 — метод направленного перепрограммирования позволяет напрямую преобразовать фибробласты в миобласты и трансплантировать их в скелетную мышцу; 3 — теоретически возможный путь перепрограммирования фибробластов в миобласты in situ
индукцию к развитию в определенном направлении, удаление вирусных частиц и последующую трансплантацию. Описанные манипуляции в определенной степени затрудняют интеграцию клеток в ткани и процессы морфогенеза, поскольку гистогенез определяется не столько наличием морфогенов в геноме клетки, сколько дифференциальной активностью этих генов, а также влиянием растворимых факторов микроокружения, регулирующих процесс дифференцировки трансплантируемых клеток. Ввиду этого следует ожидать ослабления морфогене-тических процессов как результата описанных выше манипуляций [13].
Другой нерешенной проблемой практического характера является риск канцерогенеза, обусловленный наличием клеток с остаточной плюрипотентностью.
Указанные недостатки технологии делают невозможным её применение in situ. Технология направленного перепрограммирования таких ограничений не имеет (рис. 1). Так, направленное перепрограммирование фибро-бластов в пораженной мышце в миобласты восполнит уменьшающийся пул мышечных клеток-предшественниц. Ещё одним преимуществом этой технологии является её эффективность на разных стадиях заболевания в отличие от генотерапевтических методов, теряющих эффективность по мере прогрессирования болезни.
Пролиферирующие в пораженной мышце фибро-бласты являются выгодной мишенью для направленного перепрограммирования в миогенном направлении. На сегодняшний день показана возможность получения из фибробластов кардиомиоцитов, нейронов, олигоден-дроцитов, астроцитов, шванновских клеток, гепатоцитов, инсулоцитов и др. [14-21]. Применительно к мышечным тканям, лучшие результаты, показавшие применимость технологии направленного перепрограммирования клеток in vivo, получены в отношении кардиомиоцитов [15, 22-24]. В частности, исследовательской группе под руководством K. Song удалось преобразовать фибро-бласты рубца, образовавшегося на месте инфаркта миокарда, в кардиомиоциты, трансдуцировав их ретрови-русами, содержащими гены gata4, hand2, mef2c и tbx5. Полученные клетки ассоциировались в функциональный синцитий и сокращались в ответ на электрическую
стимуляцию [24]. В этих опытах была успешно показана работоспособность методов восстановления тканей, основанных на направленном перепрограммировании соматических клеток, что позволяет рассматривать возможность их применения и для других клеток и тканей.
теоретические предпосылки создания технологии направленного перепрограммирования ш у^о
Понятие и механизмы трансдифференцировки. Как показывают исследования, проводившиеся начиная с ХХ века, развитие клетки не во всех случаях должно идти по пути повышения степени дифференцировки и специализации. При определенных условиях возможно направить развитие клетки по пути перепрограммирования, дедифференцировки и трансдифференцировки (рис. 2) [1, 5, 9, 25-27].
Понятие перепрограммирования (описываемого в зарубежной литературе как герподпаттлпд) включает в себя все изменения в развитии клеток, однако в большинстве случаев интерпретируется как переход дифференцированной клетки в плюрипотентное состояние [25, 26]. Также встречается определение перепрограммирования как процесса эпигенетических перестроек во время развития половых клеток млекопитающих, наиболее изученным механизмом которых является метилирование ДНК [25].
Дедифференцировка определяется как процесс, при котором клетка утрачивает свою морфофункцио-нальную специализацию, в основе которой предполагается активация генов, в норме экспрессирующихся в недифференцированных клетках [27]. В понимании генетических и молекулярных основ дедифференци-ровки отсутствует окончательная ясность, однако значительная роль отводится сигнальным путям МАРК (БПК, Л\1К, р38) и каноническому Wnt.
Трансдифференцировка, как было отмечено выше, предполагает преобразование соматической клетки одного вида в другой без возвращения к стадиям с более высокой потентностью. Понятие трансдифференцировки следует отличать от метаплазии. В случае метаплазии в ткани появляются клетки, отличающиеся измененной морфологией и функцией, однако сохраняющие свою принадлежность к исходному зародышевому листку.
Рис. 2. Возможные пути развития и перепрограммирования клетки в эмбриональном и постнатальном периоде: 1 — трансдифференцировка; 2 — дедифференцировка; 3 — перепрограммирование; 4 — метаплазия; 5 — эпителиально-мезенхимный переход. Помимо указанных путей развития часть клеток эмбриобласта дифференцируется в клетки внезародышевых органов (на схеме не указано)
Метаплазия — сложный и не до конца изученный и описанный процесс, при котором клетки одного вида, характерные для определенного участка ткани или органа постепенно заменяются другими клетками с сохранением принадлежности к зародышевому листку. На сегодняшний день отсутствует универсальное объяснение механизма метаплазии для всех описываемых случаев, хотя выдвигаются гипотезы, предполагающие возможные пути метаплазии. В качестве возможных механизмов предлагается трансдифференцировка клеток, дифференцировка циркулирующих в крови клеток, экспансия клеток из зон, граничащих с зоной метаплазии, и активация, экспансия и дифференцировка т. н. остаточных эмбриональных клеток [28, 29].
Однако наиболее обоснованным предположением является, по-видимому, активация транскрипционных факторов, запускающих дифференцировку тканеспеци-фичных мультипотентных клеток по нетипичному для них пути, что дает возможность четко отграничить понятие метаплазии от трансдифференцировки [28, 30].
Чаще всего причиной метаплазии является изменение условий существования клеток, требующих приспособления, как, например, при плоскоклеточной метаплазии бронхов. По мере прогрессирования метаплазии один тип ткани постепенно заменяется другим и со временем клетки образующейся ткани могут малигнизироваться.
Другими процессами, близкими к трансдифферен-цировке, являются эпителиально-мезенхимный и ме-зенхимно-эпителиальный переходы (ЭМП и МЭП). ЭМП — биологический процесс, в результате которого клетки эктодермального происхождения претерпевают множественные биохимические изменения, приводящие к смене эпителиального фенотипа на мезен-химный. Ключевыми фенотипическими изменениями являются утрата клетками полярности, обретение способности к миграции (и инвазии), увеличение резистентности к апоптозу и повышение уровня синтеза внеклеточного матрикса (ВКМ) [31].
На сегодняшний день выделяют три вида ЭМП: естественный, происходящий только в эмбриогенезе при миграции клеток эпибласта и нервных гребней; ЭМП при
заживлении ран и фиброзировании и ЭМП при опухолевой прогрессии [32].
В качестве основных генетических регуляторов ЭМП выделяют транскрипционные факторы SNAIL1 и 2, TWIST1 и 2, Ю, E12, E47 и ZEB. Экспрессия этих факторов наблюдается на наиболее ранних этапах ЭМП, что позволяет предположить их главенствующую роль в контроле переключения генов, специфичных для эпителиального или мезенхимного фенотипа. Профиль экспрессии генов этих факторов во многом зависит от вида клетки, в которой протекает ЭМП, вида ЭМП и индуцирующих факторов, к которым относят ТОРр, РОР, НОР, 1ОР1, ЕОР, РЮОР и др. [33].
Важно отметить, что понятие «ЭМП» вызывает справедливую критику со стороны классических гистологов, разделяющих концепцию жесткой детерминации клеточных элементов в онтогенезе [34]. Однако, следует подчеркнуть, что ЭМП не тождественен трансдифферен-цировке, т. к. при ЭМП клетка сохраняет свою принадлежность к эпителиальной ткани. Ошибочно говорить об ЭМП как о непосредственном преобразовании эпителиальной клетки в мезенхимную (мезенхимальную). Более корректным является утверждение о временной смене клеткой её «образа жизни» с неподвижного, фиксированного к базальной мембране и (или) другим клеткам эпителиального на подвижный мезенхимальный. Вопрос о том, имеет ли смысл выделять ЭМП как явление, отличное от закономерно протекающих гистогенетических процессов, по-прежнему остается дискуссионным.
Процессом, обратным ЭМП, является МЭП, при котором клетки приобретают эпителиальный фенотип. В целом, теме МЭП посвящено меньшее количество исследований. Классическим примером МЭП в эмбриогенезе является формирования нефрона из клеток нефроген-ной мезенхимы (мезодермы). Также обнаружено участие МЭП в формировании отдаленных метастазов [35].
Трансдифференцировка, лежащая в основе направленного перепрограммирования клеток, в отличие от описанных выше процессов, в естественных условиях в тканях человека не происходит. Однако на молекулярном уровне прослеживается определенное сходство с ЭМП. При исследовании молекулярных механизмов направленного перепрограммирования было установлено, что действие
транскрипционных факторов, запускающих изменение фенотипа клетки, разделено во времени. Подобное деление удобно и с функциональной точки зрения, поскольку позволяет разработать концепцию прикладных решений, а также делает изложение более удобным. Было установлено, что одни факторы, которые можно обозначить как инициирующие, начинают перепрограммирование клетки за счет оттеснения нуклеосом неактивного участка генома, содержащего необходимую программу развития. Этим они делают его доступным для терминирующих транскрипционных факторов, которые запускают программу развития, находящуюся на этом участке [36]. Из такой функциональной классификации логичным становится деление факторов по времени активности на ранние и поздние. Описанное деление является концептуальным для создания моделей технологии направленного перепрограммирования.
Так, в случае кардиомиогенного перепрограммирования Gata4 является геном, запускающим кардиомиоген-ную программу развития, в то время как Tbx5 участвует в терминальных стадиях дифференцировки до кардиоми-оцитов, способных сокращаться [24]. Аналогичные механизмы действуют и для нейрогенного перепрограммирования. Наличие инициирующего фактора Ascl1 является ключевым для активации репрессированного участка генома фибробластов, необходимого для связывания терминальными факторами Brn2 и Mytl1, которые, в свою очередь, осуществляют более тонкую регуляцию генома для дифференцировки фибробласта по нейрогенному пути [2].
При этом используемые для перепрограммирования факторы, являются факторами, активными в эмбриональный период развития, что делает определяющим в выборе факторов, запускающих перепрограммирование клеток в миогенном направлении, понимание ключевых молекулярных событий, запускающих эмбриональный рабдомиогистогенез.
Механизмы рабдомиогенной дифференцировки в эмбриогенезе. Скелетная мускулатура преимущественно является производным сомитной параксиальной мезодермы. Гистогенез скелетной мышечной ткани — процесс преобразования от исходной клеточной формы организации до симпластической, завершающийся формированием нервно-мышечных единиц. В эмбриогенезе скелетной мышечной ткани Р.К. Данилов и соавт. (2010) выделяют следующие стадии: миобластическую, миосимпластиче-скую, стадию мышечных трубочек, а также стадии молодых и зрелых мышечных волокон [37]. Ключевое значение в дифференцировке клеток миотома и морфогенезе скелетной мышечной ткани имеют сигнальные молекулы, основные функции которых представлены в табл. 1. Основными факторами, определяющими миогистогенез, являются белки семейств генов Wnt, Pax и мышечных ре-гуляторных факторов (myogenic regulatory factors, MRF). Помимо них описаны также факторы, модулирующие действие основных участников миогенеза. К ним относятся миоцит-специфические энхансерные факторы (myocyte enchancer factors, MEF), усиливающие миогенную индукцию совместно с MRF, а также факторы, входящие в семейство TGF-p. Последние способны как усиливать, так и угнетать морфогенетические процессы в зависимости от условий и молекулярного контекста. К ним, помимо самого TGF-p относятся BMP Myostatin, IGF-1, IGF-2 [38].
Практические вопросы направленного перепрограммирования клеток
Клетки, используемые для перепрограммирования в миогенном направлении. Наиболее значимыми свойствами, которыми должны обладать клетки, используемые в качестве исходных для направленного
перепрограммирования, являются генетическая пластичность, проявляющаяся в способности формировать фенотип необходимого вида клетки, и доступность, выражающаяся в простоте получения достаточного количества клеточного материала. Второй критерий выбора объясняется антипролиферативным действием фактора мышечной дифференцировки MyoD, а также уменьшением числа клеток в процессе их преобразования и трансплантации.
Как было отмечено выше, наиболее убедительные результаты перепрограммирования клеток in vitro были достигнуты с использованием фибробластов. При этом обнаруживается, что степень эффективности преобразования зависит от используемой популяции фибро-бластов. Так, в опытах по аденовирусной трансдукции фибробластов эндомизия, перимизия и дермы человека, полученных из операционного материала, последние показали лучшие результаты преобразования (оценка проводилась на основании сравнения доли клеток, экс-прессирующих тяжелые цепи миозина саркомеров) [19]. Причина этого до конца не ясна, однако авторы связывают это с тем, что фибробласты дермы и миобласты происходят из дермамиотома, в то время как фибробласты скелетных мышц конечностей — из соматоплевры.
Другими клетками, используемыми в опытах по направленному перепрограммированию, являются эндоте-лиоциты, гладкомышечные клетки и т. н. мононуклеарные клетки крови. Преимущество использования этих клеток заключается в их доступности, проявляющейся простотой выделения и экспансии, а также общность эмбрионального происхождения. Исследований, посвященных их направленному перепрограммированию в миобласты, в настоящий момент нет, однако существуют работы, показавшие их принципиальную способность к направленному перепрограммированию в гладкомышечные и фо-торецепторные клетки [39-41].
Другим потенциальным видом клеток, способным к преобразованию, являются мультипотентные мезен-химальные стромальные клетки (ММСК), полученные из жировой ткани. Для них была показана возможность направленного перепрограммирования в гепатоциты, кератиноцитоподобные клетки и нейрональные стволовые клетки in vitro [42-45]. В случае миогенного направленного перепрограммирования ММСК жировой ткани у полученных клеток обнаруживалась способность к слиянию друг с другом и синтезу мышечных белков (ми-огенин, а-актинин, дистрофин, миомейкер и др.), сопоставимая с фибробластами, что позволяет рассматривать их выгодным источником исходных клеток [44].
Методы направленного перепрограммирования клеток в миогенном направлении. В отношении направленного перепрограммирования клеток в миогенном направлении существует ряд работ, проведенных in vitro и ex vivo с последующей трансплантацией опытного материала в ткани лабораторных животных. В то же время отсутствуют работы, описывающие опыт перепрограммирования непосредственно in vivo.
Начиная с опытов H.M. Weintraub (1987), в экспериментах по перепрограммированию клеток в миогенном направлении наибольшее распространение в качестве индуцирующего фактора получил MyoD, используемый изолированно или совместно с другими факторами. Вторым рассматриваемым фактором был Myf5, однако было показано, что его изолированного действия на физиологическом уровне экспрессии недостаточно для активации специфичных для миогенного дифферона генов [38].
На основании проведенных исследований можно сделать вывод о главенствующей, но не исключительной
роли фактора MyoD для перепрограммирования фи-бробластов в миобласты. Это подтверждается исследованием, показавшим, что индукция преобразования NIH3T3 фибробластов в миобласты под воздействием MyoD приводит к образованию клеток, синтезирующих десмин, дистрофин и миозин, однако неспособных к слиянию [6, 47]. В то же время исследование по CRISPR/ Саз9-опосредованному нокауту гена myod в линии им-мортализованных миобластов С2С12 показало, что в таком случае дальнейшая дифференцировка этих клеток переключается на адипогенный путь развития [48].
Более эффективным оказалось использование MyoD, усиленного за счет слияния гена myod с доменом вирусного транскрипционного активатора VP64 [46]. Трансдуцированные лентивирусом с описанной конструкцией фибробласты демонстрировали более высокие уровни экспрессии миогенных маркеров, а также большую частоту слияния миобластов по сравнению с культурой, трансдуцированной нативным геном myod.
По-прежнему дискуссионным остается вопрос выбора способа индукции MyoD в исходных клетках. В случае доставки гена myod наиболее распространено использование адено- и лентивирусов [17, 19, 47, 49]. К преимуществам использования вирусной доставки относится более высокая эффективность проникновения в клетки, экспрессии генетического материала, а также возможность интеграции в геном.
Продолжительность экспрессии целевых генов напрямую зависит от используемого вируса. Для невстра-ивающихся в геном клетки-хозяина аденовирусов она ограничивается действием нуклеаз, разрушающих находящуюся в цитоплазме конструкцию. Встраивающиеся в геном лентивирусы таких ограничений не имеют, однако их использование сопряжено с риском тумурогенеза ввиду потенциальной возможности инсерционного мутагенеза [50, 51].
Другим способом, позволяющим получить необходимую для направленного перепрограммирования концентрацию MyoD в клетке, является непосредственное введение этого фактора, синтезированного бактериальной клеткой нетоксигенного штамма Pseudomonas aeruginosa посредством секреторной системы 3 типа. Среднее число преобразованных таким методом клеток, имеющих миогенные маркеры, составляет 29 %, что, по мнению авторов, свидетельствует о его эффективности [52]. Однако в контексте терапевтических аппликаций перспективность такого метода вызывает сомнение.
В ряду способов доставки предпочтителен тот, который одновременно решает несколько проблем. В связи с этим мы предполагаем использование вирусных векторов более перспективным.
Отдельно стоит выделить исследование, посвященное возможности активации эндогенных MRF за счет воздействия на культуру клеток in vitro 5-азацитидином — аналогом цитидина [53]. Включение его в геном ингибирует метилирование ДНК, которое, в свою очередь, инициирует программы дифференцировки клеток. При культивации кардиомиоцитов предсердия мышей C57BI/6, с 5-аза-цитидином обнаруживались веретеновидные клетки, синтезирующие факторы и белки MyoD, миогенин и аль-фа-актинин, однако статистически достоверной разницы в количественной оценке его экспрессии между контрольной и экспериментальной культурами не обнаруживалось. Перспективность использования метода, основанного на изолированном действии 5-азацитидина, в клинической практике сомнительна ввиду низкой эффективности метода, а также сложности в его управлении и не специфичности действия, что приводит к токсическим эффектам.
Более обнадеживающие результаты получены в одном из немногих, а, возможно, и единственном на сегодняшний день эксперименте, часть которого была проведена in vivo. Мышиные фибробласты дермы были ex vivo трансдуцированы геном myod с использованием аденовируса в качестве вектора, после чего их трансплантировали в переднюю большеберцовую мышцу мышей. Образованные in vitro мышечные трубочки экспрессировали гены ацетилхолиновых рецепторов, креатинкиназы, легких цепей миозина, MRF, глицеральдегидфосфатдегидрогеназы. В волокнах, образовавшихся in vivo, обнаруживалась поперечная исчерченность. В исследовании было показано, что после введения в переднюю большеберцовую мышцу мыши преобразованные клетки сохраняются в ней на протяжении 8 недель [19].
Дополнительной точкой приложения стимулов, позволяющей потенциировать действие MRF, является активация некоторых сигнальных путей одновременно с воздействием основными факторами перепрограммирования.
Продемонстрирована возможность усиления действия MyoD в результате обработки клеточной культуры биофлаваноидом гесперидином. Это достигается за счет увеличения внутриядерного содержания MyoD и повышении аффинности его связывания с ДНК. В эксперименте на культуре С2С12 миобластов была обнаружена зависимость между воздействием на клеточную культуру гесперидина и образованием большего (по сравнению с контролем] числа цилиндрических миоцитов, многоядерных мышечных трубочек, а также экспрессией главного комплекса гистосовместимости MHC на мембране образовавшихся клеток. Опыты на мышах с модельной криотравмой также продемонстрировали прямую связь между воздействием гесперидина и скоростью регенеративных процессов, что делает его потенциальным агентом повышения эффективности перепрограммирования [54].
Воздействие на культуру in vitro преобразуемых клеток ингибитором пути TGFp SB431542 (ChemSpider ID 3716512] привело к увеличению длины и диаметра миотуб, что позволяет сделать предположение о повышении эффективности преобразования клеток [1 7]. Схожие результаты были получены при активации сигнального пути Wnt посредством добавления WNT3A или ингибировании GSK3P через добавление CHIR99021 (ChemSpider ID 8023270].
Описанные опыты позволяют предположить перспективность использования факторов-модуляторов процессов перепрограммирования клеток как положительных регуляторов, повышающих эффективность преобразования клеток.
Исходя из имеющихся экспериментальных работ, следует сделать вывод о большей перспективности экзогенной индукции направленного перепрограммирования ввиду возможности управления количеством доставляемого в клетку фактора или его транскрипта, а также возможности его модуляция за счет слияния с более сильным промотором или использования дополнительных факторов, усиливающих миогенез. Кроме того, на эндогенную активацию MRF накладываются ограничения, связанные со сложностью ингибирования всех репрес-соров необходимых генов с одной стороны и неселективностью действия ингибиторов метилирования с другой.
Критерии оценки эффективности направленного перепрограммирования клеток в миогенном направлении. Для доказательства успешного преобразования клеток необходима система признаков, подтверждающих получение целевой клетки. По мере развития методов
индукции направленного перепрограммирования исследовательскими группами был накоплен определенный набор маркеров, свидетельствующих о наличии некоторых миогенных фенотипических признаков успешно перепрограммированных клеток. Безусловным морфо-физиологическим критерием, позволяющим говорить об успешном перепрограммировании, является способность у полученных клеток сливаться в способный к сокращению симпласт. Однако на настоящем уровне понимания и развития технологий перепрограммирования клеток о сравнительном прогрессе можно судить по обнаружению у них отдельных молекулярно-генетических, морфологических и функциональных критериев.
Фундаментальной функциональной характеристикой мышечных клеток является наличие токов ионов Ca2+ в ответ на деполяризацию ввиду их участия в инициации сокращения за счет связывания с молекулами тропо-нина. В in vitro исследовании, проведенном в 2017 г., была продемонстрирована способность образованных в результате преобразования клеток к циркуляции ионов Ca2+, однако способности к сокращению у полученных клеток обнаружено не было [17].
Широкое распространение получил качественный и количественный анализ экспрессии мышечно-спец-ифичных генов, а также их продуктов. К ним относятся MyoD, MYOG, гены десмина, MHC, GAPDH, мышечной креатин-киназы, легких цепи быстрого миозина, дистро-фина [17, 19, 46, 52].
Первые представления о появлении клеток, обладающих некоторыми свойствами миобластов может дать оценка организации цитоскелета, так как он является морфологической основой функциональной специализации мышечных клеток [17, 52, 55]. Для этого в качестве маркеров используются альфа-актинин 2, тропонин I, тяжелые цепи миозина быстрых и медленных волокон, а также десмин.
Однако следует отметить, что наличие даже всех вышеперечисленных маркеров, обнаруживаемых в полученных клетках, лишь косвенно указывает на успешность их преобразования. Присутствие этих маркеров не дает оснований сделать заключение о том, что полученные клетки идентичны естественным миобластам. Это подтверждается работой D. Manandhar и соавт. 2017 года, в которой было продемонстрировано, что хотя в человеческих фибробластах дермы, трансду-цированных лентивирусом с myod, обнаруживаются РНК-транскрипты мышечных маркеров, глобальных геномных изменений не происходит [56]. В частности, была зафиксирована активация сайтов, ответственных за ранний миогенез, однако профиль экспрессии в целом не соответствовал профилю экспрессии миобла-стов. Полученные в ходе перепрограммирования клетки авторы, сравнивая их с миобластами, определяют как находящиеся на ранних этапах миогенной детерминации. При этом отмечается также активность в полученных клетках фибробласт-специфичных сайтов.
Таким образом, необходимо предположить, что на уровне генома получаемые в ходе преобразования клетки представляют собой переходную форму между фибробластом и миобластом, что указывает на ограниченность методов оценки результатов перепрограммирования, а также на недостаточность понимания процесса преобразования клеток.
Заключение
За 30 лет, прошедших с момента первой попытки направленного перепрограммирования клеток, углубление понимания фундаментальных механизмов
трансдифференцировки, лежащих в основе направленного перепрограммирования клеток, позволило создать модели, позволяющие добиться более полного преобразования клеток, недостаточного, однако, для применения в клинической практике. Хотя достигнут определенный успех в морфологическом отношении, проявляющийся в слиянии образованных миобластов в миотубы, а также способности у полученных клеток к изменению ци-топлазматической концентрации ионов Ca2+ в ответ на электрическую стимуляцию, способности к сокращению у образованных миотуб не обнаруживалось. Помимо этого, анализ геномных изменений, происходящих в преобразуемых клетках, показал, что при активации ранних специфичных для развития по миогенному пути сайтов, общий профиль экспрессии не соответствует таковому у нативных миобластов. При этом наблюдаемая экспрессия фибробласт-специфичных генов, по-видимому, также затрудняет процесс преобразования клеток.
Исходя из этого, возникают два направления повышения эффективности направленного перепрограммирования клеток. С одной стороны, выдвигаются обоснованные экспериментально предположения о повышении эффективности преобразования клеток при создании усиленного синтетического MyoD и активации некоторых сигнальных путей. С другой стороны, возникает необходимость исследований, направленных на увеличение степени геномных изменений, позволяющих снизить влияние генов исходной клетки. Существуют исследования, раскрывающие механизмы выбора одной из конкурирующих программ развития в процессе дифференцировки норадренергических и холинергических нейронов [57]. По-видимому, описанный механизм несет черты универсальности в отношении дифференцирующихся клеток и, выделив ключевые факторы развития клетки по пути фибробласта, возможно будет направлено отключить эту программу, что, предположительно, повысит эффективность перепрограммирования.
На настоящем уровне понимания процесса перепрограммирования и с учетом сопряженных с использованием рисков, предпочтительной областью применения метода в клинической практике следует рассматривать первичные миопатии. В этом случае метод позволит компенсировать значительную утрату клеток, что увеличит уровень жизни таких пациентов. В то же время, выбор скелетной мускулатуры конечностей в качестве первой терапевтической мишени описываемого метода позволит в большей степени контролировать реакцию организма на манипуляцию, что сделает её более безопасной.
В попытках лечения первичных миопатий с помощью клеточных методов использовались разные подходы, однако на сегодняшний день не было достигнуто результатов, позволявших говорить об их успешности. В настоящее время опыт применения описываемого метода в рабдомиогенном направлении крайне скромен, что может внушать некоторый пессимизм, однако значительные успехи направленного перепрограммирования в кардиомиогенном направлении in vivo вдохновляют на дальнейшее развитие метода.
И хотя современные методы исследований позволили значительно расширить и углубить понимание процессов, происходящих при регенерации мышц на молекулярном уровне, в функционирующем мышечном органе существуют, по-видимому, многие метаболические и физические факторы, оказывающие свои влияния на процесс регенерации. Таким образом, в контексте рабдомиогенной регенерации следует говорить о нише, являющейся своего рода интерфейсом между клетками и происходящими в них процессами и действующими
на них факторами окружения, которые могут повысить эффективность методов при применении их in vivo.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета и субсидий, выделенных Казанским (Приволжским) федеральным университетом по государственному заданию в сфере научной деятельности.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ГЛОССАРИЙ
Дисплазия — это врожденное или приобретенное изменение дифференцировки клеток (гисто- и органогенеза) в связи с необратимым повреждением (модификацией) ДНК и приводящее к изменению размеров, формы и строения клеток и тканей.
Дифференцировка — направленный процесс реализации генетически обусловленной программы развития, проявляющийся приобретения клеткой морфофункцио-нальной специализации в процессе её онтогенеза.
Дедифференцировка — процесс утраты клеткой её морфофункциональной специализации в результате
ЛИТЕРАТУРА:
1. Shen C.N., Burke Z.D., Tosh D. Transdifferentiation, metaplasia and tissue regeneration. Organogenesis 2004; 1(2): 36-44.
2. Prasad A., Teh D.B., Shah Jahan F.R. et al. Direct conversion through trans-differentiation: efficacy and safety. Stem Cells Dev. 2017; 26(3): 154-65.
3. Graf T., Enver T. Forcing cells to change lineages. Nature 2009; 462(7273): 587-94.
4. Piraino S., Boero F., Aeschbach B. et. al. Reversing the life cycle: medusae transforming into polyps and cell transdifferentiation in Turritopsis nutricula (Cnidaria, Hydrozoa). Biol. Bull. 1996; 190(3): 302-12.
5. Davis R.L., Weintraub H., Lassar A.B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell 1987; 51(6): 987-1000.
6. Деев Р.В., Мавликеев М.О., Бозо И.Я. и др. Генно-клеточная терапия наследственных заболеваний мышечной системы: современное состояние вопроса. Гены и клетки 2014; IX(4): 6-33.
7. Kinter J., Sinnreich M. Molecular targets to treat muscular dystrophies. Swiss Med. Wkly. 2014; 144: w13916.
8. Miller J.B., Girgenrath M. The role of apoptosis in neuromuscular diseases and prospects for anti-apoptosis therapy. Trends Mol. Med. 2006; 12(6): 279-86.
9. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126(4): 663-76.
10. Darabi R., Pan W., Bosnakovski D. et al. Functional myogenic en-graftment from mouse iPS cells. Stem Cell Rev. 2011; 7(4): 948-57.
11. Darabi R., Arpke R.W., Irion S. et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell 2012; 10(5): 610-9.
12. Goudenege S., Lebel C., Huot N.B. et al. Myoblasts derived from normal hESCs and dystrophic hiPSCs efficiently fuse with existing muscle fibers following transplantation. Mol. Ther. 2012; 20(11): 2153-67.
13. Youssef A.A., Ross E.G., Bolli R. et al. The promise and challenge of induced pluripotent stem cells for cardiovascular applications. JACC Basic Transl. Sci. 2016; 1(6): 510-23.
14. Caiazzo M., Giannelli S., Valente P. et al. Direct conversion of fibro-blasts into functional astrocytes by defined transcription factors. Stem Cell Reports 2015; 4(1): 25-36.
15. Fu J.D., Srivastava D. Direct reprogramming of fibroblasts into car-diomyocytes for cardiac regenerative medicine. Circ. J. 2015; 79(2): 245-54.
16. Wapinski O.L., Vierbuchen T., Qu K. et al. Hierarchical mechanisms for direct reprogramming of fibroblasts to neurons. Cell 2013; 155(3): 621-35.
17. Boularaoui S.M., Abdel-Raouf K.M.A., Alwahab N.S.A. et al. Efficient transdifferentiation of human dermal fibroblasts into skeletal muscle. J. Tissue Eng. Regen. Med. 2018; 12(2): e918-36.
18. Ito N., Kii I., Shimizu N. et al. Direct reprogramming of fibroblasts into skeletal muscle progenitor cells by transcription factors enriched in undifferentiated subpopulation of satellite cells. Sci. Rep. 2017; 7(1): 8097.
19. Lattanzi L., Salvatori G., Coletta M. et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene
активации генов, поддерживающих недифференцированный фенотип клетки.
Перепрограммирование — процесс преобразования дифференцированной клетки в плюрипотентную. Также: процесс эпигенетических перестроек в геноме во время развития половых клеток млекопитающих.
Метаплазия — процесс появления в ткани клеток, отличающихся морфологией и функцией, однако сохраняющих принадлежность к своему зародышевому листку.
Трансдифференцировка — процесс преобразования дифференцированной клетки одного вида в другой без возвращения к стадиям с более высокой потентностью.
Эпителиально-мезенхимный переход — обратимый процесс смены клеткой способа жизни и организации с эпителиального фенотипа на мезенхимальный. Эпителиально-мезенхимальный переход может происходить как в норме, во время эмбрионального гистогенеза, так и в патологии, при фиброзировании и опухолевой прогрессии.
In vitro — технология выполнения экспериментов с культурами клеток и тканей вне организма.
In vivo — технология выполнения экспериментов непосредственно в организме исследуемого объекта.
Ex vivo — технология выполнения эксперимента с клетками и тканями, выделенными из организма.
transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J. Clin. Invest. 1998; 101(10): 2119-28.
20. Zhu S., Russ H.A., Wang X. et al. Human pancreatic beta-like cells converted from fibroblasts. Nat. Commun. 2016; 7: 10080.
21. De la Rosa M.B., Sharma A.D., Mallapragada S.K. et al. Transdifferentiation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF)-secreting mesenchymal stem cells significantly enhance BDNF secretion and Schwann cell marker. J. Biosci. Bioeng. 2017; 124(5): 572-82.
22. leda M., Fu J.D., Delgado-Olguin P. et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell 2010; 142(3): 375-86.
23. Qian L., Yu Huang C., Ian Spencer et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature 2012; 485(7400): 593-8.
24. Song K., Nam Y.J., Luo X. et al. Heart repair by reprogramming non-my-ocytes with cardiac transcription factors. Nature 2012; 485(7400): 599-604.
25. https://www.nature.com/subjects/reprogramming.
26. Mall M., Wernig M. The novel tool of cell reprogramming for applications in molecular medicine. J. Mol. Med. (Berl.) 2017; 95(7): 695-703.
27. Cai S.A., Fu X., Sheng Z. Dedifferentiation: a new approach in stem cell research. BioScience 2007; 57(8): 655-62.
28. Jiang M., Li H., Zhang Y. et al. Transitional basal cells at the squa-mous-columnar junction generate Barrett's oesophagus. Nature 2017; 550(7677): 529-33.
29. Shields H.M., Zwas F., Antonioli D.A. et al. Detection by scanning electron microscopy of a distinctive esophageal surface cell at the junction of squamous and Barrett's epithelium. Digestive Diseases and Sci. 1993; 38(1) 97-108.
30. Rigden H.M., Alias A., Havelock T. et al. Squamous metaplasia is increased in the bronchial epithelium of smokers with chronic obstructive pulmonary disease. PLoS One 2016; 11(5): e0156009.
31. Русакова С.Э., Бирина В.В., Камардин Е.В. Мезенхима, эпителии и «эпителиально-мезенхимальные переходы». В кн.: Вопросы морфологии XXI века 2018; 5: 40-4.
32. Kalluri R., Weinberg R.A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 2009; 119(6): 1420-8.
33. Lamouille S., Xu J., Derynck R. Molecular mechanisms of epithelialmesenchymal transition. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2014;15(3): 178-96.
34. Русакова С.Э., Бирина В.В., Камардин Е.В. Мезенхима, эпителии и «эпителиально-мезенхимальные переходы». В кн.: Вопросы морфологии XXI века. Вып. 5. — СПб.: Из-во «ДЕАН», 2018: 40-6.
35. Ekblom P. Developmentally regulated conversion of mesenchyme to epithelium. FASEB J. 1989; 3(10): 2141-50.
36. Zaret K.S., Carroll J.S. Pioneer transcription factors: establishing competence for gene expression. Genes Dev. 2011; 25(21): 2227-41.
37. Данилов Р.К. ред. Руководство по гистологии. Санкт-Петербург: СпецЛит; 2010.
38. Копанцева Е.Е., Белявский А.В. Регуляторы скелетно-мышечного миогенеза. Молекулярная биология 2016; 50(2): 195-222.
39. Coll-Bonfill N., Melina M.M., Victor I. et al. Transdifferentiation of endothelial cells to smooth muscle cells play an important role in vascular remodeling. Am. J. Stem Cells 2015; 4(1): 13-21.
40. Komuta Y., Ishii T., Kaneda M. et al. In vitro transdifferentiation of human peripheral blood mononuclear cells to photoreceptor-like cells. Biol. Open 2016; 5(6): 709-19.
41. Hong X., Margariti A., Le Bras A. et al. Transdifferentiated Human Vascular Smooth Muscle Cells are a New Potential Cell Source for Endothelial Regeneration. Sci. Rep. 2017; 7(1): 5590.
42. Darvishi M., Tiraihi T., Mesbah-Namin S.A. et al. Motor neuron Transdifferentiation of neural stem cell from adipose-derived stem cell characterized by differential gene expression. Cell Mol. Neurobiol. 2017; 37(2): 275-89.
43. Shi J.G., Fu W.J., Wang X.X. et al. Transdifferentiation of human adipose-derived stem cells into urothelial cells: potential for urinary tract tissue engineering. Cell Tissue Res. s2012; 347(3): 737-46.
44. Lue J., Lin G, Ning H, et al. Transdifferentiation of adipose-derived stem cells into hepatocytes: a new approach. Liver Int. 2010; 30(6): 913-22.
45. Chavez-Munoz C., Nguyen K.T., Xu W. et al. Transdifferentiation of adipose-derived stem cells into keratinocyte-like cells: engineering a stratified epidermis. PLoS One 2013; 8(12): e80587.
46. Kabadi A.M., Thakore P.I., Vockley C.M. et al. Enhanced MyoD-Induced Transdifferentiation to a Myogenic Lineage by Fusion to a Potent Transactivation Domain. ACS Synth. Biol. 2015; 4(6): 689-99.
47. Bo R.D., Torrente Y., Corti S. et al. In vitro and in vivo tetracycline-controlled myogenic conversion of NIH-3T3 cells: evidence of programmed cell death after muscle cell transplantation. Cell Transpl. 2001; 10: 209-21.
48. Wang C., Liu W., Nie Y. et al. Loss of MyoD promotes fate transdifferentiation of myoblasts into brown adipocytes. EBioMedicine 2017; 16: 212-23.
49. Liu Z., Fan H., Li Y. et al. Experimental Studies on the Differentiation of Fibroblasts into Myoblasts induced by MyoD Genes in vitro. Int. J. Biomed. Sci. 2008; 4(1): 14-9.
50. Nayerossadat N., Maedeh T., Ali P.A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Adv. Biomed. Res. 2012; 1: 27.
51. Ramamoorth M., Narvekar A. Nonviral vectors in gene therapy-an overview. J. Clin. Diagn. Res. 2015; 9(1): GE01-6.
52. Bichsel C., Neeld D., Hamazaki T. et al. Direct reprogramming of fibroblasts to myocytes via bacterial injection of MyoD protein. Cell Repro-gram. 2013; 15(2): 117-25.
53. Kaur K., Yang J., Eisenberg C.A. et al. 5-azacytidine promotes the transdifferentiation of cardiac cells to skeletal myocytes. Cell Reprogram. 2014; 16(5): 324-30.
54. Jeong H., Lee J.Y., Jang E.J. et al. Hesperedin promotes MyoD-in-duced myogenic differentiation in vitro and in vivo. Br. J. Pharmacol. 2011; 163(3): 598-608.
55. Becher U.M., Breitbach M., Sasse P. et al. Enrichment and terminal differentiation of striated muscle progenitors in vitro. Exp. Cell Res. 2009; 315(16): 2741-51.
56. Manandhar D., Song L., Kabadi A. et al. Incomplete MyoD-induced transdifferentiation is associated with chromatin remodeling deficiencies. Nucleic Acids Res. 201; 45(20): 11684-99.
57. Furlan A., Lübke M., Adameyko I. et al. The transcription factor Hmx1 and growth factor receptor activities control sympathetic neurons diversification. EMBO J. 2013; 32(11): 1613-25.
Поступила: 14.092018
