CC BY
96
Физика твёрдого тела Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лоб ачевского, 2013), № 2 (2), с. 34-38
УДК 579.23
НАНОТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ АСМ-МОРФОМЕТРИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК
© 2013 г. С.Н. Плескова,1’2 Е.В. Дубровин,3 И.С. Голубева,4
Е.Н. Горшкова,1 Е.Е. Пудовкина 1,4
'Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского 2Лаборатория междисциплинарного исследования Бургундского университета, Дижон, Франция 3Московский госуниверситет им. М.В. Ломоносова 4Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева
pleskova@mail.ru
Поступила в редакцию 04.04.2013
Разработан алгоритм наноразмерной морфометрии бактериальных клеток с использованием высокоразрешающей атомно-силовой микроскопии. На основании анализа количественных характеристик выявлена зависимость морфологических параметров бактериальной клетки от физико-химических свойств используемых субстратов. Определено, что высокоориентированный пиролитический графит и стекло минимально деформируют бактериальную клетку. Разработаны нанолитографические методы модификации поверхностей, позволяющие проводить исследования нативных бактериальных клеток в жидкостной ячейке.
Ключевые слова: атомно-силовая микроскопия, морфометрия, бактерии.
Введение
Традиционно для диагностики и систематики бактерий ведущими являются биохимические и генетические тесты [1]. Однако в последнее время в связи с пониманием штаммо-вой мультивалентности морфологических, экологических, функциональных свойств, в связи с исследованием трансформации бактерий экст-рануклеоидными элементами, изменяющими фенотипические признаки микроорганизмов, все большее значение приобретают комплексные методы исследования. Среди них одно из ведущих мест принадлежит методам высокоразрешающей микроскопии. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) является уникальным методом, поскольку позволяет проводить точную морфометрическую оценку основных параметров бактериальных клеток, исследовать молекулярные (гидрофобные и электростатические) взаимодействия на поверхности бактерий, картировать физико-химические свойства, измерять ригидность клеточной стенки и адгезивные свойства клеточной поверхности, а также натяжение поверхностных макромолекул [2]. К настоящему времени с помощью АСМ охарактеризованы несколько десятков различных штаммов бактерий, среди которых Escherichia coli
[3], Klebsiella pneumoniae, Helicobacter pylori, Lactobacillus fermentum, Bifidobacterium longum, Arthrobacter globoformis, Bacillus sphaericus [4],
Staphylococcus aureus [5], Bacillus cereus, Streptococcus pyogenes [6] и многие другие. К настоящему времени определено два магистральных направления в области морфометрии бактерий: (1) апробирование новых субстратов (в том числе и созданных нанотехнологическими методами), на которых происходило бы минимальное искажение всех морфологических характеристик бактериальных клеток, и (2) исследование бактерий в максимально физиологичной для них среде и в нативном состоянии. Поэтому целью данной работы являлось исследование основных морфологических параметров грамположительных (Staphylococcus aureus) и грамотрицательных (Escherichia coli) бактерий с нанометровым разрешением, а также определение условий их исследования в витальном состоянии.
Экспериментальная часть
Основным объектом исследования являлись штаммы Staphylococcus aureus 956 и Escherichia coli 321-5, выделенные на базе инфекционной больницы №2 г. Нижнего Новгорода. Бактерии выращивали на мясо-пептонном агаре (МПА, 18-24 ч, 37°С), дважды отмывали стерильным физиологическим раствором (ОАО НПК) (200 g, 20 мин), взвешивали в дистиллированной воде и доводили коэффициент экстинкции до стандартного значения 10 МЕ стандарта мутно-
Таблица 1
Основные морфологические параметры бактериальных клеток (Л - общее количество измерений)
Длина, нм Ширина, нм Диаметр, нм Высота, нм Площадь, мкм2 Объем, мкм3
E. coli 1760±520 (N=215) 963±156 (N=220) 389 ± 54 (N=157) 2.3 ± 0.8 (N=67) 0.5 ± 0.2 (N=67)
S. aureus 736±109 (N=222) 593 ± 90 (N=337) 1.2 ± 0.4 (N=78) 0.4 ± 0.2 (N=78)
сти. Полученную суспензию наносили на поверхность подложек (0.5 мкл) и выдерживали при 37°С до полного высыхания [7].
Для морфометрического анализа бактерий использовали: стерильные предметные стекла, поликарбонат с ячеистой структурой, высокоориентированный пиролитический графит (ВОПГ), слюду, четырехкратно-концентрированный МПА. Скол с поверхности поликарбоната, ВОПГ и слюды производили с помощью адгезивной ленты.
Для экспериментов, направленных на разработку методов исследования бактериальных клеток в жидкостной ячейке, бактериальную суспензию наносили на поверхность поликарбоната с ячеистой структурой или концентрированного МПА и сканировали в нативном состоянии.
АСМ-исследования бактерий (Solver Pro, NT-MDT, Россия) осуществляли в контактном и резонансном режиме сканирования на воздухе (морфометрическая серия экспериментов) и в дистиллированной воде (витальная серия экспериментов). Для измерения использовали канти-леверы DNP и MSCT (Bruker, США), обработку изображений проводили в программе «Фемтоскан» (ЦПТ, Россия).
Результаты и их обсуждение
Общепринятым методом фиксации микробиологических объектов для АСМ-исследований является их высушивание на поверхности подложки. Согласно работе И. Соколова и соавт. (1996), после использования такого способа иммобилизации бактерии сохраняют свою жизнеспособность [8]. В данной работе мы представляем разработанную комплексную методику диагностической морфометрии бактериальной поверхности на основе анализа её АСМ-изображений. Она включает в себя измерение линейных размеров бактерий (высоты, ширины, длины, диаметра), площади и объёма бактериальной клетки:
(1) высоту измеряли путём построения профиля поверхности вдоль линии, ориентированной по направлению сканирования. В качестве нижней точки выбран уровень субстрата, в качестве верхней - самая высокая точка бактерии;
(2) ширину бактерии измеряли путём построения профиля поверхности вдоль линии, направленной перпендикулярно длинной оси клетки. Замеряющие плоскости располагали на полувысоте клетки для нивелирования эффекта конволюции;
(3) длину клетки измеряли путём построения профиля поверхности вдоль линии, направленной по максимально длинной оси клетки. Замеряющие плоскости располагали на полувысоте клетки. Длину и ширину клеток определяли для палочковидных форм;
(4) диаметр определяли для кокковых форм бактерий. Направление измерения выбирали произвольно. Замеряющие плоскости располагали на полувысоте клетки.
Для вычисления площади и объёма клетки первоначально выделяли объект (бактериальную клетку), далее расчет указанных величин проводили автоматически. Для корректного выделения объекта вычисляли средний уровень поверхности, среднее квадратичное отклонение от этого уровня и максимальную высоту, отсчитанную от среднего уровня. Затем сравнивали две плоскости, одна из которых имела высоту промежуточную между средним уровнем и максимальной высотой бактериальной клетки, а вторая находилась на два среднеквадратичных отклонения выше среднего уровня. Та из плоскостей, которая оказывалась ниже, принималась за пороговую. В качестве объекта (бактериальной клетки) принимали все расположенное выше пороговой плоскости. Разработанный метод оценки дает максимально валидные результаты при использовании гладких подложек.
Результаты АСМ-морфометрии грамполо-жительных и грамотрицательных бактерий, адсорбированных на поверхности стекла, суммированы в табл. 1.
E. coli адсорбируется преимущественно в виде одиночных клеток, иногда в виде небольших агрегатов, S. aureus либо располагается в виде одиночных клеток, либо формирует классические «гроздевидные» агрегаты на поверхности стекла.
Результаты исследования влияния субстрата на морфологию бактериальной клетки представлены на рис. 1.
Таблица 2
Основные морфологические параметры Е. сой, измеренные при адсорбции на разных поверхностях ________________________________(Л - общее количество измерений) ___________________________________
Высота, нм Площадь, мкм2 Объем, мкм3
Слюда 259 ± 45 2.6 ± 0.6 0.4 ± 0.і
(N=9) (N=9) (N=9)
ВОПГ 422±134 і.7 ± 0.6 0.5 ± 0.2
(N=115) (N=33) (N=33)
Поликарбонат 429 ± 97 0.9 ± 0.4 0.3 ± 0.і
(N=102) (N=37) (N=37)
Стекло 389 ± 54 2.3 ± 0.8 0.5 ± 0.2
(N=157) (N=67) (N=67)
Разработанный алгоритм нанотехнологической АСМ-морфометрии был использован для оценки изменений основных параметров бактериальной клетки в зависимости от используемого субстрата. Результаты приведены в табл. 2.
Таким образом, морфометрические параметры в значительной степени зависят от физикохимических свойств субстрата. В частности, очевидно, что из-за гидрофильности и наличия заряда на поверхности максимальна адгезия грамотрицательных бактерий на слюде (для клетки на этой подложке отмечена минимальная высота и максимальная площадь поверхности). Но этот эффект повышенной адгезивности вызывает и максимальную деформацию бактериальных клеток. Аналогичная тенденция выявлена в отношении стафилококков - максимальная «гроздевидная» агрегация отмечена именно при анализе бактерий на слюде. Минимальное искажение количественных морфологических характеристик клеток отмечено для ВОПГ и стекла, вероятнее всего, из-за гидрофобных свойств и отсутствия заряда на поверхности. Именно эти субстраты сохраняют объем бактерий, поэтому в случае необходимости использования диагностической морфометрии бактериальных клеток измерения должны проводиться на поверхности ВОПГ либо стекла.
Одним из принципиальных методических вопросов является поиск субстрата, на котором происходила бы прочная адгезия бактериальных клеток, поскольку при витальных исследованиях в жидкости достаточно минимального механического воздействия кантилевера для десорбции бактериальных клеток с поверхности подложки. В этом случае сканирование бактерий становится невозможным. Практически применяются разнообразные методы модификации подложек для прочной адгезии или ковалентной иммобилизации бактерий на поверхности. Среди них преобладают различные способы электростатической функционализации либо химической модификации поверхности [9]. Однако, как было отмечено выше, такие варианты изменения поверхности неизбежно приводят к искажению нормальной морфологии бактери-
альной клетки и уводят наблюдения от физиологических кондиций.
Нами были апробированы два способа нано-литографического конструирования потенциальных ям, функционирующих в качестве «механических ловушек» для бактериальных клеток. Мясо-пептонный агар (МПА) представляет собой питательную среду, максимально удовлетворяющую физиологические потребности бактериальной клетки, поэтому представляется наиболее перспективным его использование в качестве субстрата и проведение динамических наблюдений за нативными бактериальными клетками непосредственно на поверхности агара. Однако МПА имеет чрезвычайно рыхлую, вязкую и обводненную консистенцию, поэтому при сканировании зонд удаляет верхний слой агара, вместе с адсорбированными на нем бактериями. При этом происходит необратимая контаминация зонда и кантилевера с изменением амплитудно-частотных характеристик. Поэтому перед проведением нанолитографии готовили четырехкратно-концентрированный агар, который был плотным, имел малую степень обводненности и формировал на поверхности ячеистые структуры. Нанолитографию концентрированного агара производили с помощью кантилевера: велось сканирование заданного фрагмента поверхности агара с увеличенной силой прижатия зонда. В результате такого воздействия можно получать лунки любой требуемой глубины, формы и периметра (рис. 2а, б).
Получившиеся лунки являются потенциальными ямами для бактерий, которые позволяют закреплять исследуемые клетки и получать витальные изображения микроорганизмов в максимально физиологичной для них среде (рис. 2 в). Возможность варьировать размеры лунок открывает широкие возможности для исследования различных по морфологии клеток.
В качестве альтернативного нанолитографи-ческого субстрата для бактериологических АСМ-исследований был проанализирован поликарбонат с дорожками из чередующихся отверстий. На поверхность поликарбоната наносили суспензию S. aureus 956. Рисунок 3 на-
Рис. 1. Изменение морфологии E. тН в зависимости от используемого субстрата. Слева представлена топография поверхности, справа - боковой профиль бактериальной клетки. Изображение представлено по каналу «высота». Размер скана 50 мкм. Бактерии адсорбированы: (а) на слюде (на субстрате закрепляется малое количество изолированных клеток); (б) на высокоориентированном пиролитическом графите (на субстрате закреплено большое количество агрегатов бактерий, боковой профиль показывает большую высоту бактерий в сравнении с профилем на слюде); (в) на поликарбонате (отмечается зональное распределение бактериальных клеток); (г) на стекле (на субстрате закреплено большое количество изолированных бактериальных клеток)
глядно демонстрирует фиксацию бактерий в потенциальных ямах дорожек. Адгезированные клетки были прочно закреплены и не сдвигались кантилевером при сканировании (белые стрелки), тогда как бактерии, не попавшие в потенциальные ямы, не были иммобилизованы на подложке: об их присутствии можно было судить только по светлым трекам на АСМ-изображениях (чёрные стрелки).
Микроорганизмы демонстрировали высокую адгезионную активность как в серии «воздушных» экспериментов, так и при исследовании в жидкости. Исследование в витальном состоянии показало, что бактерии надежно иммобилизуются не только в самих потенциальных ямах, но и на границе раздела «яма - ровная поверхность» (рис. 3в). Вероятнее всего, за надежную
Рис. 2. Модификация поверхности для витальных исследований бактериальных клеток: (а) нанолитографи-ческая методика создания потенциальных ям на четырехкратно-концентрированном мясо-пептонном агаре с использованием АСМ-зонда; (б) боковой профиль поверхности, демонстрирующий возможность нанометро-вого измерения глубины и ширины образуемых лунок; (в) пример практического использования наношаблона - S. aureus нанесены на поверхность модифицированного нанолитографией субстрата и сканированы в нативном состоянии. Изображения представлены по каналу «высота». Размер сканов 54 мкм
фиксацию золотистого стафилококка отвечают основные факторы адгезии и колонизации, т.е. тейхоевые кислоты и набор экспрессируемых белков-адгезинов, заякоренных в клеточной стенке [10].
Заключение
Таким образом, для решения задач практической диагностической морфометрии необходимо использовать высокоразрешающую АСМ-микроскопию. Варьируя подложки с разными физико-химическими свойствами, можно получать четкие изображения бактериальных клеток как в высушенном состоянии (на воздухе), так и в жидкости. Наименьшее искажение размеров и формы бактериальной клетки наблюдается при
Рис. 3. Фиксация бактериальных клеток и их исследование в витальном состоянии на лунках поликарбоната: (а) S. aureus, прочно адсорбированные в лунках поликарбоната, обозначены белыми стрелками, бактерии, не фиксированные на поверхности и легко сдвигаемые кантилевером, - черными стрелками; (б) микроорганизмы могут сорбироваться как в виде изолированных клеток, так и в виде агрегатов; (в) закрепление стафилококка происходит не только в лунках, но и в пограничной зоне «яма - ровная поверхность»; (г) боковой профиль указывает на сохранение основных морфометрических характеристик бактерий при их исследовании на поверхности наношаблона. Изображения представлены по каналу «высота». Размер сканов (а) и (б) составляет 50 мкм, (в) и (г) 10.6 мкм
применении подложек из стекла или высокоориентированного пиролитического графита. Фактором, в большей степени влияющим на состоятельность приготовленного образца и позволяющим вести наблюдения в жидкости, является наличие собственной структуры (потенциальных ям) на поверхности субстрата.
Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (соглашение 14.B37.21.0132). Грант Президента РФ МК-312.2013.2 «Развитие физико-биологических подходов для моделирования биологических процессов с применением атомно-силовой микроскопии».
Список литературы
1. Sibley C.D., Peirano G., Church D.L. // Infect. Genet. Evol. 2012. V. 12(3). P. 505-521.
2. Pleskova S.N., Guschina Y.Y., Zvonkova M.B. // Physics of low-dimensional structures. 2004. P. 77-82.
3. Bolshakova A.V., Kiselyova O.I., Yaminsky I.V. // Biotechnol. Progress. 2004. V. 20. P. 1615-1622.
4. Wahl R., Raff J., Selenska-Pobell S. et al. // Biotechnol. Lett. 2001. V.23. P. 1485-1490.
5. Boyle-Vavra S., Hahm J., Sibener S.J., Daum R.S. // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. V.44. P. 3456-3460.
6. Braga P.C., Ricci D. Imaging bacterial shape, surface, and appendages before and after treatments with antibiotics // Atomic Force Microscopy: Biomedical Methods and Applications (Methods in Molecular Biology) / Eds. P.C. Braga, D. Ricci. Humana Press, 2004. V. 242. P. 179-188.
7. Яминский И.В., Демин В.В., Бондаренко В.М. // Журн. микробиологии. 1997. №6. С. 15-18.
8. Sokolov I.Y., Firtel M., Henderson G.S. // J. Vac. Sci. Technol. 1996. V. 14. P. 674 - 678.
9. Louise Meyer R., Zhou X., Tang L. et al. // Ultramicroscopy. 2010. V. 110 (11). P. 1349-1357.
10. Burian M., Wolz C., Goerke C. // PLoS One. 2010. V. 5(4): e10040.
NANOTECHNOLOGICAL AFM-MORPHOMETRY OF BACTERIAL CELLS S.N. Pleskova, E.V. Dubrovin, I.S. Golubeva, E.N. Gorshkova, E.E. Pudovkina
An algorithm has been developed for AFM nanoscale morphometry of bacterial cells. The analysis of quantitative characteristics has revealed the dependence of bacterial cell morphological parameters on the physicochemical properties of the substrates used. Highly oriented pyrolytic graphite and glass cause minimal deformation of bacterial cells. Nanolithography techniques for surface modification have been developed that allow native bacterial cells to be studied in a liquid environment.
Keywords: atomic-force microscopy (AFM), morphometry, bacteria.
