CC BY
39
ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 616:615.1-636
В. О. Ежков, Р. Н. Файзрахманов, Е. В. Семакина, Д. В. Ежкова, А. М. Ежкова
НАНОСТРУКТУРНЫЙ САПРОПЕЛЬ: ИЗГОТОВЛЕНИЕ, ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ
СВОЙСТВ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЗОПАСНЫХ ДОЗ ПРИМЕНЕНИЯ
Ключевые слова: сапропель, наноструктурныйсапропель, элементный состав, размер и форма частиц, нелинейные белые
мыши, безопасные, токсичные и летальные дозы.
В статье показано, что ультразвуковое диспергирование сапропеля способствует раздроблению составляющих его конгломератов и уменьшению размера частиц от 4,0 мкм до 45,0-180,0 нм. Установлено, что при этом происходит изменениеформы частиц, структуры и свойств модифицированного сапропеля. При однократном внутрижелудочном введении наноструктурного сапропеля белым мышам выявлены безопасная доза - 0,6 г/кг, токсичная - в диапазоне 1,2-2,4 г/кг, летальная - 3,0 г/кгживой массы (гибель 8 % поголовья).
Keywords: sapropel, nanostructured sapropel, elemental composition, particle size and shape, nonlinear white mice, safe, toxic and
lethal doses.
The article shows that the ultrasonic dispersion sapropel contributes to the fragmentation of its constituent conglomerates and reduce the particle size of 4.0 microns to 45,0-180,0 nm. It is established that there is a change in particle shape, structure and properties of modified sapropel. For a single intragastric administration of nanostructured sapropel white mice found safe dose - 0.6 g / kg, toxic - in the range of 1.2-2.4 g / kg lethal - 3.0 g / kg body weight (the death of 8% of the population).
Актуальность
В последнее десятилетие природные агроминералы широко используются в народном хозяйстве, наиболее активно в химической, фармацевтической отраслях и в агропромышленном комплексе [1].
Для полной реализации уникальных свойств природных агроминералов разрабатываются способы повышения их активности. Одним из таких методов является изготовление материалов с применением методов нанотехнологий [2-5]. В настоящее время все методы получения наноматериалов разделят на две большие группы по типу формирования наноструктур: методы «снизу-вверх» характеризуются ростом наночастиц или сборкой наночастиц из отдельных атомов; методы «сверху-вниз» основаны на «дроблении» частиц до наноразмеров [6, 7].
В основе механизма модификации природных минералов использована возможность дробления конгломератов вещества до частиц наноразмерного диапазона. При этом происходит принудительный разрыв химических связей внутри конгломерата, а составные частицы приобретают дополнительную поверхностную энергию, что способствует изменениями свойств и проявляется усилением активности минералов [8-11].
В связи с чем, целью настоящего исследования стало изготовление из природного сапропеля наноструктурного сапропеля. Получение нового наноматериала послужило предпосылкой для изучения его свойств, и определения безопасных доз применения.
Материалы и методы
Использовали природный минерал - сапропель месторождения озеро Белое Тукаевского района Республики Татарстан. Сапропель проходил этап замораживания в естественных природно-климатических условиях, затем его подвергали многоэтапной сушке до влажности 8,0-12,0% и измельчению (сито № 0.18).
Изготавливали наноструктурный сапропель и изучали строение его и структуру нативного сапропеля в научно-исследовательском
инновационно-прикладном центре «Наноматериалы и нанотехнологии» ФГБОУ ВО «КНИТУ». Активированный сапропель добавляли в деионизированную воду (стабилизатор) в концентрации 10 г на 100 мл воды. Полученную суспензию подвергали ультразвуковому воздействию в приборе УЗУ-0,25 при частоте 18,5 кГц (±10%), удельной мощности - 80 Вт/л, амплитуде колебаний ультразвукового волновода 5 мкм. Длительность воздействия - 30 минут.
Форму и размер частиц наноструктурного сапропеля и макроаналога изучали методом прерывисто-контактной атомно-силовой
микроскопии (АСМ) на сканирующем зондовом микроскопе MultiMode V («Veeco», США)в лаборатории «Спектроскопии, микроскопии и термического анализа» выше названного центра. Методика съемок: нанесением капли препаратов, приготовленных из водных суспензий наноструктурного сапропеля и макроаналога, на подложку из слюды с последующим осаждением на нее. Сканировали различные участки поверхности подложки с размерами 1х1 мкм2, 2х2 мкм2, 5х5 мкм2, 10х10 мкм2, 20х20мкм2
Содержание химических элементов в сапропеле определяли методом атомно-эмиссионной спектроскопии на приборе АЭС ИСП iCAP 6300 DUO («ThermoScientific» США)выше названного центра. Режим анализа: количество спектральных линий - 43, мощность - 1150 Вт.
Опыты по исследованию безопасности проводили на половозрелых нелинейных белых мышах массы тела 24,9±1,84 г (виварий ФГБУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория», г. Казань). При проведении экспериментов руководствовались
Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с
использованием животных [12].
Исследования возможных токсических свойств наноструктурного сапропеля осуществляли согласно Методическим указаниям Роспотребнадзора 1.2.2520-09 по оценке безопасности наноматериалов и «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых
фармакологических веществ» [13-15].
Цифровые показатели, полученные при выполнении работы, анализировали по стандартным программам вариационной статистики согласно пакету программ MicrosoftOfficeExcel-2007.
Результаты исследований и обсуждение
Использование сапропеля в качестве кормовой добавки сельскохозяйственным животным настоятельно диктует необходимость проведения исследований биологической и токсической безопасности. При микроскопическом исследовании нативного сапропеля не выявлены патогенные микроорганизмы - сальмонеллы, протей, энтеробактерии, стафилококки и др., а так же яйца гельминтов. При исследовании химического состава отмечали широкий спектр биогенных макро- и микроэлементов. В его составе не установлено присутствие высоко опасных элементов: кадмия, олова и мышьяка (табл. 1).
Таблица 1 - Содержание химических элементов в сапропеле, мг/л
№ Элемент Содержание № Элемент Содержание
1 Са 2,40 11 Ti 0,011
2 Fe 0,68 12 Ba 0,008
3 Al 0,390 13 Zn 0,0023
4 Mg 0,350 14 Ni 0,0023
5 Sr 0,077 15 V 0,002
6 K 0,048 16 Li 0,001
7 P 0,047 17 Cr 0,0015
8 Mn 0,046 18 Cu 0,0014
9 Na 0,020 19 Co 0,0005
10 Si 0,018 20 Pb 0,0005
При исследовании структуры сапропеля наблюдали частицы различных размеров от 405,0 до 2490,0 нм, среди них встречались единичные
крупные конгломераты, величина которых достигала 4,0 мкм (рис. 1).
Установлено, что средний размер частиц сапропеля составил 1340,0 нм. На площади исследования 20х20 мкм2 наблюдали 17-22 частицы, при этом из них самые крупные - 6-7 частиц (32,035,0%) имели размер более 2,0 мкм, средние - 5-6 частиц (27,0-32,0 %) были величиной 1,5-2,0 мкм, и мелкие - 9-11 частиц (36,0-41,0%) были менее 1,0 мкм. Распределение частиц по размерам, колеблющимся в диапазоне от 405,0 до 3490,0 нм, с учетом их неспецифической формы представлено на гистограмме (рис. 2).
По форме крупные частицы сапропеля были в виде сдвоенных обтекаемых конусов. Установлено четко выраженное рельефное сечение вдоль по центру левого конуса и однотипные рельефные неровности правого конуса. Частицы средних размеров, состояли из трех объединенных обтекаемых конусов. Наименьшие по размеру частицы были аморфной формы. Четкая организация строения сапропеля отсутствовала.
Рис. 1 - АСМ изображение сапропеля, топография поверхности, размер частиц 405,02490,0 нм
1, •.Lull 1 in 11 Ii...... Inlli 11.11. i
stra 1 trat) 1 stra г otra г stra з tura
size, nm
Рис. 2 - Гистограмма распределения частиц сапропеля по размерам в диапазоне от 405,0 до 3490,0 нм, средний размер - 1340,0 нм
При исследовании строения наноструктурного сапропеля наблюдали частицы величиной от 45,0 до 180,0 нм (рис. 3). На площади исследования 20х20 мкм2обнаружено 120-140 частиц наноструктурного сапропеля. В поле зрения выявляли 36-48 крупных частиц (30,0-34,0%) размером 100,0-180,0 нм, по форме они были подобны макроаналогам, однако, имели более обтекаемые формы тетраэдра со сглаженными углами. Кроме этого наблюдали более 80 мелких частиц (63,0-67,0%) в поле зрения, которые имели размер менее 100,0 нм и располагались хаотично. Специфическим отличием
в строении наноструктурного сапропеля от макроаналога стало, то, что крупные частицы наносапропеля были организованы в группы по три частицы с удалением их друг от друга на одинаковые расстояния. Крупные частицы наноструктурного сапропеля имели выраженную форму тетраэдра с хорошо различимыми гранями, мелкие частицы были обтекаемыми бесформенными. С учетом неспецифической формы установлено, что средний размер частиц наноструктурного сапропеля составил 90,0 нм (рис. 4).
Таблица 2- Схема опыта, дозы и количества внутрижелудочно вводимых компонентов мышам
1-¥- мыши получали наноструктурный сапропель
В первые минуты эксперимента у мышей всех групп из-за введения атравматического зонда с растворами препаратов отмечали общее угнетение, малоподвижность и безразличное отношение к корму и воде.
В течение первого часа у мышей ИУ групп (доза препарата 1,2-3,0г/кг живой массы) появились клинические признаки интоксикации,
интенсивность проявления которых носила дозозависимый характер.
К 4-5 часу от времени введения препарата у мышей, получивших наноструктурный сапропель в дозе 3,0 г/кг живой массы, симптомы интоксикации нарастали и имели наивысшую степень проявления. У них отмечали цианоз и анемию видимых слизистых оболочек, конечностей, ушей, морды и хвоста. Более 50% поголовья имели симптомы диспепсии и загрязненные каловыми массами участки тела. Животные отказывались от воды и корма, группировались, не реагировали на внешние раздражители. На седьмой час после введения препарата наблюдали осторожное передвижение мышей в клетке. У них проявлялся интерес к внешним раздражителям, и отмечали потребность в туалете тела. Спустя восемь часов наблюдали возникновение водной, затем кормовой возбудимости. Гибель одной особи регистрировали через шесть часов после введения наноструктурного сапропеля. При патологоанатомическом вскрытии наблюдали мелкоточечные кровоизлияния и гиперемию слизистой желудка и
двенадцатиперстной кишки. Печень и почки были несколько увеличены в объеме, имели напряженную капсулу, дряблую консистенцию. В печени отмечали единичные диапедезные кровоизлияния. Макрокартина вскрытия характеризовалась признаками острого токсического отравления.
Введение препарата в дозе 2,4 г/кг способствовало изменению общего поведения мышей и проявлению признаков интоксикации средней степени тяжести. Клиническая картина проявлялась цианозом слизистых, диспепсией, группировкой мышей. Продолжительность
Рис. 3 - АСМ изображение наноструктурного сапропеля, топография поверхности, размер частиц 45,0-180,0 нм, организация структуры вещества в группы по три частицы
Рис. 4 - Гистограмма распределения частиц по размерам в диапазоне от 45,0 до 180,0 нм, средний размер - 90,0 нм
Для изучения острой оральной токсичности наноструктурного сапропеля были сформированы семь групп белых мышей, которым однократно внутрижелудочно при помощи атравматического зонда вводили водную суспензию наноструктурногосапропеля в разных дозах. В качестве исходной дозы для исследований использовали наименьшее значение оптимальных доз применения макроаналога в виде кормовой добавки сельскохозяйственным животным и птице -3,0-5,0г/кг живой массы [16]. Последующие дозы уменьшали на 20, 40, 60 и 80%. В качестве контроля-сравнения использовали мышей, которым вводили водную суспензию сапропеля, в качестве биологического контроля - мышей, получивших деионизированную воду. Наблюдали в течение 14 суток. Дозы вводимых веществ и показатели гибели животных представлены в таблице 2.
Группы мышей (п = 12) Дозаса про-пеля, г/кг Кол-во сапропеля,г/ мышь Кол-во воды, мл Число погибших мышей
I 3,0 0,075 0,5 1
II 2,4 0,060 0,5 0
III 1,8 0,045 0,5 0
IV 1,2 0,030 0,5 0
V 0,6 0,015 0,5 0
VI сапропель 3,0 0,075 0,5 0
VII деионизиро-ванная вода - - 0,5 0
клинического проявления составляла до 4-5 часов. На шестой час после введения препарата в этой дозе у животных отмечали возникновение водной и кормовой возбудимостей.
Менее выраженными были симптомы интоксикации у мышей, получивших препарат в дозе 1,8 г/кг. Признаки отравления нарастали к 2-3 часу после введения, при этом животные сохраняли подвижность, реакции на внешние раздражители были замедлены. Клинически у мышей отмечали цианоз видимых слизистых, проявление диспепсии у 16% поголовья.
Введение наноструктурногосапропеля в дозе 1,2 г/кг способствовало возникновению слабовыраженных признаков интоксикации. Длительность клинического проявления симптомов отравления продолжалась в течение 1-2 часов и носила обратимый характер. Животные сохраняли активность, единичные особи проявляли пищевую и водную возбудимость.
Внутрижелудочное введение водных суспензий наноструктурного сапропеля в дозе 0,6 г/кг и сапропеля в дозе 3,0 г/кг не вызывали изменений клинико-физиологического состояния мышей. Отклонений в поведении опытных животных не наблюдали, они активно реагировали на внешние раздражители, водная и кормовая возбудимости были сохранены. Состояние мышей этих групп было подобно таковому у контрольных аналогов. При диагностическом вскрытии (п=3) через 12 часов после введения препаратов отмечали активацию секреции слизи и усиление пристеночного пищеварения желудка и кишечника. Дальнейшими наблюдениями в течение эксперимента не выявляли изменений в этологии и клинико-физиологическом состоянии мышей получивших наноструктурный сапропель в дозах 0,6-3,0 г/кг живой массы.
Заключение
Структура нативного сапропеля представлена конгломератами слипшихся частиц размером 0,43,49 мкм, со средним размером - 1,34 мкм. Ультразвуковое диспергирование сапропеля обусловило уменьшение размера частиц агроминераладо 45,0-180,0 нм и способствовало изменению структуры, формы частиц и токсических свойств наноструктурного сапропеля. При его однократном внутрижелудочном введении в дозе 3,0 г/кг живой массы белых мышей отмечали гибель 8% поголовья. В дозах 1,2-3,0 г/кг проявлялись симптомы интоксикации с нарастанием признаков при увеличении дозы. В дозе 0,6 г/кг живой массы наноструктурныйсапропель не оказывал отрицательного влияния на белых мышей, и был сопоставим по своему действию в организме с нативным сапропелем в оптимальной дозе 3,0 г/кг живой массы.
Авторы выражают признательность профессору, д.х.н.Е.С. Нефедьеву и доценту, к.х.н. И.Р. Низамееву за проведение аттестации сапропеля и наноструктурного сапропеля.
Литература
1. Р.Х. Абузяров, Ф.Г. Ахметов, П.А. Аблямитов, А.И. Буров, С.П. Васильев, М.К. Гайнуллина, Д.Х. Гатауллин, У.Г. Дистанов, Г.О. Ежкова, М.С. Ежкова, Л.П. зарипова, З.Т. Закиров, А.В. Иванов, Ф.И. Идиатуллин, Т.Х. Ишкаев, Д.А. Кикило, Т.П. Конюхова, О.А. Котылев, Р.М. Миннуллин, А.К. Садретдинов, М.Я. Тремасов, А.Н. Тюрин, А.В. Якимов, О.А. Якимов, Агроминеральные ресурсы Татарстана и перспективы их использования, / Под ред. д.с./х.н. А.В. Якимова. Фэн, Казань, 2002. 272 с.
2. А.Х. Яппаров, Ш.А. Алиев, И.А. Яппаров, А.М. Ежкова, В.О. Ежков, Н.Ш. Хисамутдинов, И.А. Дегтярева, Н.Л. Шаронова, Л.М.-Х. Биккинина, И.Х. Габдрахманов, Е.С. Нефедьев, М.С. Ежкова, Д.А. Яппаров, А.А. Лукманов, Нанотехнологии в сельском хозяйстве: научное обоснование получения и технологии использования наноструктурных и нанокомпозитных материалов / Под ред. д.с./х.н. А.Х. Яппарова. Центр инновационных технологий, Казань, 2013. 252 с.
3. В.О. Ежков, А.Х. Яппаров, Е.С. Нефедьев, А.М. Ежкова, И.А. Яппаров, А.П. Герасимов, Наноструктурные минералы: получение, химический и минеральный составы, структура и физико-химические свойства, Вестник Казанского технологического университета, 17, 11, 41-45 (2014).
4. А.Х. Яппаров, Ш.А. Алиев, И.А. Яппаров, А.М. Ежкова, И.А. Дегтярева, В.О. Ежков, Н.Ш. Хисамутдинов, Н.Л. Шаронова, Л.М.-Х. Биккинина, Е.С. Нефедьев, М.С. Ежкова, Д.А. Яппаров, Л.В. Коваленко, Г.Э. Фолманис, М.А. Федотов, Научное обоснование получения наноструктурных и нанокомпозитных материалов и технология их использования в сельском хозяйстве /Под общ.ред. А.Х. Яппарова и Л.В. Коваленко. Центр инновационных технологий, Казань, 2014. 304 с.
5. А.М. Ежкова, А.Х. Яппаров, В.О. Ежков, Л.М.-Х. Биккинина, И.А. Яппаров, А.П. Герасимов, Разработка наноструктурного фосфорита: исследование безопасности применения, Доклады академии наук, 467, 2, 242-245 (2016).
6. Нанотехнологии. Азбука для всех / под ред. Ю.Д. Третьякова. ФИЗМАТЛИТ, Москва, 2010. 368 с.
7. В.М. Таланов, Г.П. Ерейская, Ю.И. Юзюк, Введение в физику и химию наноструктур и наноструктурированных материалов. Академия Естествознания, Москва, 2008. 389 с.
8. А.П. Герасимов, В.О. Ежков, А.М. Ежкова, И.А. Яппаров. Влияние наноразмерного фосфорита на метаболизм и росто-весовые показатели птицы мясной продуктивности, Вестник Казанского технологического университета, 17, 7, 213-217 (2014).
9. В.О. Ежков, Л.М.-Х. Биккинина, М.А. Поливанов. Влияние наноструктурной водно-цеолитной суспензии на продуктивность гречихи, Вестник Казанского технологического университета, 16, 19, 241-245 (2013).
10. Н.Л. Шаронова, А.Х. Яппаров, Н.Ш. Хисамутдинов, А.М. Ежкова, И.А. Яппаров, В.О. Ежков, И.А. Дегтярева, Э.В. Бобынин, Наноструктурная водно-фосфоритная суспензия - новое перспективное удобрение, Российскиенанотехнологии, 10, 7-8, 119-126, (2015).
11. A.M. Ezhkova, A.Kh. Yapparov, V.O. Ezhkov, I.A. Yapparov, N.L. Sharonova, I.A. Degtyareva, N.Sh. Khisamutdinov, L.M. -Kh. Bikkinina, Fabrication of nanoscalebentonite, study of its structure and toxic properties, and determination of safe doses, Nanotechnologies in Russia, 10, 1-2, 120-127 (2015).
12. Международные рекомендации (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (разработаны и опубликованы в 1985 г. Советом международных научных организаций).
13. Е.В. Арзамасцев Методические рекомендации по изучению общетоксического действия фармакологических средств. Утверждены Управлением государственного контроля лекарственных средств и медицинской техники Минздрава России 29 декабря 1997 г. М., 1997.
14. МУ 1.2.2520-09. Гигиена, токсикология, санитария. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности
наноматериалов: методические указания. Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, 2009.
15. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ /Под ред. чл.-корр. РАМН, профессора Р.У. Хабриева. Изд. 2-е, ОАО «Издательство «Медицина», Москва, 2005. 832 с.
16. П.Ф. Шмаков, Е.А. Чаунина, В.А. Левицкий, Сапропель - природный дар кормовых ресурсов и органо-минеральных удобрений в регионе Западной Сибири, Кормление сельскохозяйственных животных и кормопроизводство, 9, 71-76 (2008).
© В. О. Ежков - д-р вет. наук, проф. каф. пищевой инженерии малых предприятий КНИТУ, egkov-vo@mail.ru; Р. Н. Файзрахманов - канд. с/х наук, доц. каф. экономики и организации предприятий КГАВМ имени Н.Э. Баумана, ramil140679@mail.ru; Е. В. Семакина - асп. каф. пищевой инженерии малых предприятий КНИТУ; Д. В. Ежкова - студ. той же кафедры; А. М. Ежкова - д-р биол. наук, зав. отделом животноводства и ветеринарии, «Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения», egkova-am@mail.ru.
© V. O. Ezhkov - Doctor of Veterinary Sciences, Professor of the Department of Food Engineering of Small Enterprises of KNRTU, egkov-vo@mail.ru; R. N. Faizrakhmanov - Candidate of Agricultural Sciences, Associate Professor, Department of Economics and Organization of Federal state budgetary educational institution of higher education Kazan State Academy of Veterinary Medicine named after NE Bauman, ramil140679@mail.ru; E. V. Semakina - Postgraduate of the Department of Food Engineering of Small Enterprises of KNRTU; D. V. Ezhkova - Student of the Department of Food Engineering of Small Enterprises of KNRTU; A. M. Ezhkova - Doctor of Biological Sciences, Head of the Animal Production and Health Division of Tatar Research Institute for Soil Science and Agricultural Chemistry, egkova-am@mail.ru.
