CC BY
54
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2011 БИОЛОГИЯ Вып. 1
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 616.097
НАНОРАЗМЕРНЫЕ ЧАСТИЦЫ УГЛЕРОДА С ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННОЙ ПОВЕРХНОСТЬЮ В АНАЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ
М. Б. Раева, М. С. Бочковаа, П. В. Храмцов ь , А. В. Тюленев ь
3 Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13; mraev@iegm.ru; (342)2446712
ь Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15; biodеаn@psu.ru
Сконструирована модель неинструментальной неферментной тест-системы с применением углеродного диагностикума для определения уровня антител у иммунизированных животных. Данная тест-система обладает рядом преимуществ по сравнению с другими общеизвестными методами иммуноаналитической оценки сероконверсии, такими как преципитация в геле агарозы по Оухтерлони, метод Манчини и/или иммуноферментными методами.
Ключевые слова: неинструментальная тест-система; наноразмерные углеродные частицы; уровень специфических антител; белок G.
Введение
В настоящее время в аналитической практике используют как инструментальные, так и неинструментальные методы иммуноанализа. Для регистрации полученных результатов инструментальные методы требуют использования специальной регистрирующей аппаратуры, в то время, как неинструментальные лишены зависимости от аппаратуры при формализации результатов (Фримель, 1987, Guesdon, Avrameas, 1980, Rayev, Plaksin, Gromakovskaya, 1998, Rayev, Shmagel, 2008). Для разработки методов, свободных от ненструментальной зависимости, применяются различные наноразмерные материалы, такие как: коллоиды золота, эритроциты, липосомы, цветные латексные частицы, неметаллические коллоиды (коллоиды серы, теллура). Основными недостатками таких реагентов являются: низкая хромофорность метки, нековалентный характер химических связей в конъюгате, а также нестабильность самой метки (Плаксин и др., 1997, Roth, Heitz, 1989). В своей работе мы использовали наноразмерные частицы углерода, которые обладают рядом привлекательных свойств по сравнению с перечисленными хромофорами. Частицы углерода чёрного цвета обладают чрезвычайно высокой хромофорностью, а ковалентный характер связей в структуре диагностикума определяет его прочность и стабильность.
Интенсивное развитие технологий, связанных с получением моно- и поликлональных антител, делает все более и более актуальной проблему оцен-
ки уровня специфических иммуноглобулинов как на этапе иммунизации животных, так и на этапе выделения и очистки антител. Отсутствие коммерческих аналитических систем, пригодных для оперативной оценки уровня антител необходимой специфичности, определяет актуальность разработки новых универсальных систем анализа (Гу-палова и др., 1996). Целью настоящей работы является разработка эффективных и в то же время простых неинструментальных тест-систем на основе наноразмерных частиц углерода с функцио-нализированной поверхностью для оценки процессов сероконверсии.
Материалы и методы
Диагностикум (конъюгат) на основе нанораз-мерных частиц углерода получали путем двухэтапного синтеза (Плаксин, Раев, Громаковская, 1997). Суспензию углеродных частиц, полученную в результате сгорания толуола, растирали до мелкодисперсного состояния и вносили в 2%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) в забуфе-ренном физиологическом растворе (ЗФР). Суспендирование производилось при комнатной температуре в течение суток при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Полученную суспензию подвергали ультразвуковой дезинтеграции при частоте 22 кГц. Затем осуществляли активацию суспензоидного углерода раствором глутарового альдегида в течение 40 мин., после чего смесь центрифугировали. Далее проводили хроматографию
© Раев М. Б., Бочкова М. С., Храмцов П. В., Тюленев А. В., 2011
84
на колонке с Sepharose CL-6B для удаления избытка несвязавшегося бычьего сывороточного альбумина и глутарового альдегида. После хроматографической очистки осуществляли концентрирование суспензии активированных углеродных частиц с помощью метода концентрирующей ультрафильтрации в ячейке производства Millipore (США), используя мембрану с пределом исключения 30 кДа. Коньюгирование активированной суспензии проводили с белком G в течение 100 мин. при комнатной температуре и перемешивании, после чего центрифугировали. Заключительным этапом являлась гель-фильтрация на колонке с Sepharose CL-6B для удаления избытка белка G. В готовый конъюгат добавляли БСА (для блокирования непрореагировавших реакционноспособных групп) и глицерин (в качестве стабилизатора и криопротектора). Технология синтеза углеродного конъюгата в конечном итоге позволяет включить единичную углеродную частицу в физически прочную ковалентную структуру. Частица оказывается заключенной в прочный протеиновый «каркас», все структурирующие связи которого ковалентные.
В качестве форматной аранжировки метода использовали «сэндвич»-вариант дот-блотинга на непористом твердом носителе - плоская поверхность лунок полистирольного планшета для серийных разведений, «Linbro», - с которыми комплексиро-вали антиген, специфические антитела к которому являлись определяемым лигандом. В качестве детектирующего реагента использовали конъюгат -белок G, ковалентно связанный с частицами коллоидного углерода. Белок G обладает относительной специфичностью к иммуноглобулинам класса G человека и ряда животных: козы, кролика, мыши, овцы и др. (Гупалова и др., 1996, Плаксин, Раев, Гро-маковская, 1997, Rayev, Shmagel, 2008). Вследствие этого полученный на его основе конъюгат является универсальным детектирующим реагентом для определения вышеперечисленных антител и позволяет качественно и полуколичественно выявлять иммуноглобулины G любой специфичности, в зависимости от антигена, сорбированного на твердой фазе.
У иммунизированных альфа-фетопротеином человека (АФП) коз в сыворотке определяли уровень специфических иммуноглобулинов G к АФП человека. Иммуноанализ проводили на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок полистирольного планшета), куда сорбировали АФП человека (10 мкг/мл) в виде пятен из капель объемом 5 мкл из 0.05 М карбонат-бикарбонатного буфера рН 9.6. В качестве отрицательного контроля вместо АФП наносили бычий сывороточный альбумин (10 мкг/мл) и овальбумин (10 мкг/мл). Для оценки специфичности предлагаемой системы на твердой фазе сорбировали иммуноглобулин G козы (10 мкг/мл) и человека (10 мкг/мл), нанесение и иммобилизацию которых осуществляли аналогично АФП. Затем твердофазные носители отмывали ФСБ-Т и вносили конъюгат в рабочем разведении, который удаляли
через 15 мин., а лунки отмывали ФСБ-Т.
У кроликов, иммунизированных АФП, в сыворотке определяли уровень специфических иммуноглобулинов G к АФП человека. На поверхность полистирольного планшета сорбировали АФП человека (10 мкг/мл). В качестве отрицательного контроля вместо АФП наносили бычий сывороточный альбумин (10 мкг/мл). В качестве положительного контроля наносили моноклональные антитела мыши к АФП (50 мкг/мл). Анализ проводили аналогично вышеуказанной методике.
Оценку результатов осуществляли визуально по черному окрашиванию зоны специфического связывания конъюгированного с углеродом белка G и козьих антител, комплексированных с АФП на поверхности твердой фазы. Определение количества специфических антител в сыворотке производили по последней лунке с четко визуализируемыми зонами черного окрашивания в местах формирования специфических комплексов.
Параллельно для сравнения по основным параметрам предлагаемой тест-системы с другими методами анализа количество специфических антител козы к АФП в исследуемых сыворотках определяли с помощью ИФА. На полистирольный планшет для ИФА («Медполимер») сорбировали АФП (10 мкг/мл) при 4°С в течение 24 ч. или 2 ч. при 37°С. После отмывки ФСБ-Т в лунки планшета вносили сыворотку иммунизированных коз в описанных ранее разведениях и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. при постоянном встряхивании. В качестве положительного контроля в лунки вносили очищенные козьи антитела против АФП человека, аффинно выделенные из сыворотки иммунизированных коз (ЗАО «ИНМТ») в концентрациях, описанных выше. Для контроля специфичности системы вместо АФП в лунках сорбировали БСА (10 мкг/мл) при тех же условиях. Детекцию результатов проводили с использованием коммерческого конъюгата антител против иммуноглобулинов G козы, меченных пе-роксидазой хрена («Sigma»). Конъюгат в рабочем разведении добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 60 мин. при 37°С при постоянном встряхивании. После промывки планшета ФСБ-Т в лунки вносили субстрат для пероксидазы хрена (3-нитрометилбензидин) и наблюдали развитие синего окрашивания. Реакцию останавливали добавлением раствора 1Н соляной кислоты. Учет результатов проводили на планшетном спектрофотометре An-thos htIII (Австрия) при длине волны 450 нм.
По полученным результатам строили калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации антител к АФП в пробе.
Результаты и их обсуждение
Благодаря использованию в работе конъюгата, в котором в качестве аффинного компонента использован G белок стрептококка, обладающий способностью связываться с практически любыми
иммуноглобулинами класса G человека и большинства животных, стало возможным сконструировать тест-систему для определения уровня антител к АФП у животных на непористой твёрдой фазе. Такие тест-системы позволяют следить за титром антител при иммунизации животных. Чувствительность предлагаемой тест-системы «сэндвич» дот-блотинга на полистирольной поверхности позволяет выявлять антитела к АФП у коз в концентрации до 1 нг/мл. На рис. 1 представлены результаты эксперимента, из которых следует, что последнее разведение исследуемой сыворотки, где зона специфического связывания конъюгированного с углеродом белка G и козьих антител, ком-плексированных с АФП на полистирольной поверхности хорошо различима, является 1:105.
специфических антител к АФП в сыворотке козы, иммунизированной АФП
На поверхность каждой лунки сорбировали АФП человека (10 мкг/мл) - в центр, иммуноглобулин О козы (10 мкг/мл) - сверху справа и человека (10 мкг/мл) - сверху слева, БСА (10 мкг/мл) - внизу слева и овальбумин (10 мкг/мл) - внизу справа. В лунки вносили сыворотку козы, иммунизированной АФП, в ряде последовательных разведений, кратных 10. В исследуемой сыворотке последнее разведение, где зона специфического связывания конъюгированного с углеродом белка О и козьих антител, комплексированных с АФП на полистироль-ной поверхности хорошо различима, является 1:105 Стрелка указывает последнюю точку в ряду серийных разведений. Предлагаемая системы анализа позволяет полуколичественно оценить, что концентрация специфических антител в исследуемой сыворотке составляет 0.1 мг/мл
Таким образом, предлагаемая система анализа позволяет полуколичественно оценить концентрацию специфических иммуноглобулинов в исследуемой сыворотке, равную 0.1 мг/мл. Для оценки специфичности сконструированной системы ис-
пользовали данные отрицательного контроля. О высокой специфичности тест-системы говорят результаты экспериментов, согласно которым не обнаружено перекрестной реакции с БСА и овальбу-мином (отсутствие окрашивания в зонах сорбции контрольных белков) при окрашивании всех зон с нанесенным иммуноглобулином О козы и человека. Полученные результаты показывают, что разработанный метод анализа обладает высокой специфичностью и характеризуется отсутствием возможности неспецифического взаимодействия конъюгата, что предусмотрено процедурой анализа и технологией синтеза диагностикума (Г упалова и др., 1996; Rayev, Shmagel, 2008).
На рис. 2 представлены результаты иммуноанализа по определению титра антител к АФП у кро ликов.
АФП мАТ к АФП
\ ^ ! БСА 1: 256 1:512 1:1024
1:2048 1 4096 1:8192 1:16384 1:327 6 8
/ 1.65536 1:131072 1:262144 1:524288 1:1048576
Рис. 2. Определение количества специфических антител к АФП в сыворотке кролика, иммунизированного АФП
На поверхность каждой лунки сорбировали АФП человека (10 мкг/мл) - сверху слева, моноклональные антитела мыши к АФП (50 мкг/мл) - сверху справа, БСА (10 мкг/мл) - внизу в центре. В лунки вносили сыворотку козы, иммунизированной АФП, в ряде последовательных разведений, кратных 2. В исследуемой сыворотке последнее разведение, где зона специфического связывания конъюгированного с углеродом белка О и козьих антител, комплексирован-ных с АФП на полистирольной поверхности хорошо различима, является 1:65000. Стрелка указывает последнюю точку в ряду серийных разведений. В первой лунке: внешний отрицательный контроль - РВБ с твином; во второй лунке - сыворотка неиммунизи-рованного кролика
Результаты эксперимента показывают отсутствие ложноположительных результатов во внешних и внутренних отрицательных контролях, что демонстрирует хорошую специфичность разработанной системы. Чувствительность системы определения антител методом преципитации в геле по Оухтер-лони обычно не превышает 1/128, в то время как чувствительность сконструированной твердофазной системы соответствует 1/65000, что в 500 раз выше. Классический и широко используемый в аналитической практике метод преципитации в геле по Оухтерлони достаточно трудоемок, длителен, отя-
гощен относительно высокой степенью субъективизма при оценке результатов, что вносит существенные неудобства в его применение.
Таким образом, разработанный нами вариант тест-системы с применением наноразмерных углеродных частиц является универсальным и позволяет качественно и полуколичественно детектировать антитела человека, коз, кролика и т.д. любой специфичности в сыворотке и любых других биологических субстратах, а также выявлять примеси иммуноглобулинов О, контаминирующих препараты, получаемые из сыворотки крови. Предмет описываемой разработки продиктован явной необходимостью иметь в арсенале аналитических методов возможность быстрого, простого, доступного в экономическом плане и в то же время высокочувствительного и, естественно, специфичного, способа контроля за контаминацией и ее динамикой в ходе выделения и очистки отдельных белковых компонентов крови, таких как, например, аль-фа-фетопротеин. Известно, что в ходе аффинной очистки белков крови, особенно обладающих транспортными функциями, наибольшая из неприятностей - это контаминация иммуноглобулинами О. Отсюда и направленность в решении проблем, а именно: создание простой, оперативной и надежной тест-системы для определения в препаратах крови, и что весьма привлекательно - не требующей какого бы то ни было аппаратного обеспечения.
Предлагаемый вариант дот-иммуноанализа по основным параметрам выгодно отличается от существующих систем для инструментальных и неинструментальных методов анализа и обладает рядом преимуществ. Значительное сокращение времени анализа за счет уменьшение числа этапов, а также отсутствие необходимости в аппаратном обеспечении упрощает процедуру исследования и дает возможность использовать ее в качестве экспресс-метода. Отсутствие стадии субстратного проявления делает процедуру анализа более безопасной для пользователя. Ковалентный механизм конъюгиро-вания аффинных соединений с меткой обеспечивает надежность и стабильность детектирующей системы. Следует подчеркнуть, что описанный способ получения конъюгатов, приводящий по сути к функционализации поверхности химически интакт-ных частиц, является универсальным и позволяет получать неферментные диагностикумы, где в качестве анти-аналитов возможно применение таких со-
единений, как белок А, стрептавидин, поли- и моноклональные антитела, белки, пептиды, практические любые соединения, имеющие свободные аминогруппы и обладающие способностью к специфическому взаимодействию (Гупалова и др., 1996, Плаксин, Раев, Громаковская, 1997). Универсальность самой технологии порождает возможность при помощи только одной схемы синтеза получать весьма широкий спектр конъюгатов и конструирования очень широкого ряда конкретных тест-систем совершенно различной направленности (от диагностики особо опасных инфекций до оценки соматических состояний и/или научно-исследовательских лабораторных анализов) на основе весьма ограниченного числа или даже одного диагностического реагента (конъюгата).
Библиографический список
Гупалова Т.В. и др. Получение и свойства рекомбинантного белка G // Вестн. РАМН. 1996. Т. 3. С. 44-50.
Плаксин Д.Ю., Раев М.Б., Громаковская Е.Т. Способ стереоспецифического анализа и способ получения конъюгата для стереоспецифическо-го анализа: пат. Рос. Федерация. № 20899212; опубл. 10.09.1997.
Фримель Г. Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. 430 с.
Guesdon J-L., Avrameas S. Sensitive titration of antibodies and antigens using erythroimmunoassay // Ann. Immunol. 1980. Vol. 131. P. 389-396.
Rayev M., Plaksin D., Gromakovskaya E. Multipurpose noninstrumental stereospecific assay based on water-insoluble color dyes // The FASEB Journal. 1998. 12. A915, USA.
Rayev M.B., Ambrosov I.V., Briko N.I. A Novel Method for the Serodiagnosis of Group A Streptococcal Antibodies. Streptococci and the Host. Ad. Thea Horaud at al. // Advances in Experimental medicine and biology. 1997. Vol. 418. P. 327-329. Rayev M., Shmagel K. Carbon-protein covalent conjugates in noninstrumental immunodiagnostic systems // Journal of Immunological Methods. 2008. Vol. 336, №1. P. 9-15.
Roth J., Heitz P. U. Immunolabeling with the Protein A - Gold Technique: An Overview // Ultrastruc-tural Pathology. 1989. Vol. 13. P. 467-484.
Поступила в редакцию 09.12.2010
Nanosised carbon particles with functionalized surface in analytic systems
M. B. Rayev, doctor of biology, senior scientist M. S. Bochkova, candidate of biology, engineer
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str, Perm, Russia, 614081; mraev@iegm.ru; (342)2446712 P. V. Khramtsov, student A. V. Tulenev, student
Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia,614990; biodean@psu.ru
The model of non-instrumental non-enzymatic test-system is constructed that uses carbon diagnosticum for the determination of the antibody level in immunized animals. This test-system possesses a number of benefits as compared with other well-known methods of immunoanalytical evaluation of seroconversion, such as agarose gel precipitation by Ouchterlony, Mancini’s method and/or immunoenzyme methods.
Key words: non-instrumental test-system; nanosized carbon particles; specific antibody level; G protein.
Раев Михаил Борисович, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник
Бочкова Мария Станиславовна, кандидат биологических наук, инженер ГУ РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
Храмцов Павел Викторович, студент
Тюленев Алексей Валерьевич, студент
ГОУВПО «Пермский государственный университет»
