CC BY
65
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА Том 151, кн. 1 Физико-математические пауки 2009
УДК 57.083.12
НАНОМОДИФИЦИРОВАННЫЕ БАКТЕРИИ: ДЕТЕКЦИЯ ЕДИНИЧНЫХ КЛЕТОК МЕТОДОМ ПОВЕРХНОСТНО-УСИЛЕННОЙ РАМАНОВСКОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
А.И. Замалеева, М. Кахрамап, М. Чулха, Р.Ф. Фахруллип
Аннотация
В данной работе описан метод модификации клеток папоплепками и серебряными папочастицами для усовершенствования техники поверхпостпо-усилеппой рамаповской спектроскопии. Первоначально клетки покрывали полиэлектролитпыми пленками по-ли(аллиламии) гидрохлорида и/или поли(стиреп) сульфоната, обрабатывали серебряными папочастицами и повторно наносили бислойпую пленку для закрепления папочастиц па поверхности клетки. Методами сканирующей электронной и атомно-силовой микроскопии было показано, что папочастпцы и их агрегаты формируют плотный, равномерный слой па поверхности клеток. Предложенная нами техника обработки клеток папочастицами облегчает визуализацию модифицированных клеток вследствие способности папочастиц отражать свет. В качестве объекта исследования были выбраны клетки Esch.erich.ia соИ, в качестве контроля клетки 31а'рЬ,у1ососси8 соЬ.пп. Выло показано, что спектры папомодифицироваппых бактерий содержат пики, характерные для каждого вида микроорганизма, обусловленные химическим составом клеточной степки бактерий. Выло также установлено, что сигнал рамаповского спектра характеризуется высокой воспроизводимостью. Мы предполагаем, что описанный нами метод позволит идентифицировать единичные клетки разных видов бактерий в смеси.
Ключевые слова: метод послойного папесепия, полиэлектролитпые папоплепки, серебряные папочастпцы, единичная клетка, поверхпостпо-усилеппая рамаповская спектроскопия.
Введение
Высокоточная детекция и идентификация микроорганизмов является актуальной проблемой для биологии и биомедицины. Используемые ныне микробиологические методы не всегда эффективны, особенно в тех случаях, когда необходимо детектировать единичные клетки. Генетические методы (полимеразная цепная реакция и другие) значительно эффективнее, но требуют больших затрат времени, реактивов и дорогостоящего оборудования [1]. Спектроскопические методы сочетают в себе высокую точность и простой процесс подготовки образца к анализу [2. 3]. Широкие возможности открывает спектроскопия комбинационного рассеивания (рамановская спектроскопия), позволяющая определять микроорганизмы по уникальному для каждого вида спектру [4]. Однако для детекции незначительного количества клеток необходимо усилить слабый спектроскопический сигнал. Это достигается путем модификации клеток металлическими наиоча-стицами [5]. В основе усиления сигнала комбинационного рассеивания лежит явление поверхностно-плазмонного резонанса, когда делокализованные поверхностные электроны наночастиц благородных металлов на порядки усиливают сигнала ра-мановского спектра (данная техника анализа называется поверхностно-усиленной
рамановской спектроскопией) [6]. Обычно нанесение наночастиц на поверхность клеток осуществляется непосредственно, путем внесения клеток в суспензию наночастиц [7]. Клетки вступают в контакт с наночастицами, которые хаотически присоединяются к клеточной стенке. Это приводит к агрегации клеток, что делает невозможным идентификацию единичных микроорганизмов. Более того, неравномерное покрытие клеток наночастицами при непосредственном смешивании также неблагоприятно влияет на воспроизводимость анализа [8]. Таким образом, весьма актуальным представляется разработка метода, который позволил бы закрепить наиочастицы на поверхности клеток равномерно и без образования межклеточных агрегатов для эффективной детекции отдельных клеток с помощью поверхиостио-усилениой рамановской спектроскопии.
1. Материалы и методы
В работе использовали следующие реактивы: поли(аллиламингидрохлорид. РАН) (MB 15 кДа) (Sigma. США). поли(стиренсульфонат. PSS) (MB 70 кДа) (Sigma.CHIA). Для приготовления всех растворов использовали бидистиллироваи-ную воду bdH2 О.
Объектами исследования явились клетки Escherichia coli. Клетки бактерий Staphylococcus cohnii использовали в качестве контроля. Культивирование микроорганизмов проводили при 37° С в течение 24 ч на питательной агаризованной среде.
1.1. Синтез серебряных наночастиц [9]. 45 мг нитрата серебра растворяли в 250 мл дистиллированной воды, доводили до кипения. Затем в кипящий раствор нитрата серебра в круглодонной колбе вливали по капле 40 мл цитрата натрия с концентрацией 1 мг/мл при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Смесь кипятили 10 мин до выпадения осадка. Затем наиочастицы фильтровали с использованием мембранных фильтров с диаметром пор 220 нм. Последним этапом раствор наночастиц диализовали в бидистиллированной воде в течение недели и фильтровали через фильтры диаметром 0.22 мкм.
1.2. Метод модификации клеток. В работе использовали 2 метода модификации клеток. Первый из них включал следующие этапы.
Первоначально клетки покрывали противоположно заряженными полиэлектролитами РАН и PSS путем послойного нанесения, затем обрабатывали серебряными (nanoAg) наночастицами, стабилизированными цитратом натрия. На последнем этапе на поверхность клеток наносили бислойную пленку PAH/PSS для закрепления наночастиц и уменьшения агрегации клеток. В результате была получена следующая структура покрытий клеток микроорганизмов: РАН/PSS/РАН/nanoAg/PAH/PSS.
Второй метод осуществлялся аналогично описанному выше методу, но без использования отрицательно зараженного полиэлектролита PSS. В результате получали клетки микроорганизмов, модифицированные многослойной пленкой РАН/nanoAg/PAH.
1.3. Сканирующая электронная микроскопия. Для получения изображений наиомодифицироваиных клеток с высоким разрешением использовали сканирующий электронный микроскоп Carl Zeiss Evo-40 (Германия). Образцы помещали в камеру электронного микроскопа и получали изображение при напряжении электронного луча 10 кУ. Были получены типичные изображения клеток при увеличении 20000 25000 раз.
Подготовка образцов заключалась в следующем: 5 мкл суспензии клеток наносили на обезжиренную поверхность покровного стекла и высушивали в термостате при 37 °С в течение 12 ч. Затем покровные стекла помещали в прибор для напыления (Baltec SCD 005) и наносили тонкий слой золота (~ 10 нм) на поверхность стекол.
1.4. Атомно-силовая микроскопия. Эксперименты выполнялись на атомно-силовом микроскопе Park Systems (Япония) с использованием бесконтактных кремниевых кантнлеверов с радиусом кривизны острия меиее 10 им. Сканирование проводилось в бесконтактном режиме ACM.
Подготовка образцов заключалась в следующем: 10 мкл суспензии клеток наносили на обезжиренную поверхность покровного стекла и высушивали в термостате при 37 °С в течение 1 ч. При сканировании наночастиц 10 мкл раствора наночастиц наносили на поверхность слюды и высушивали в термостате при 37 °С в течение 1 ч.
1.5. Поверхностно-усиленная рамановская спектроскопия. Спектры были получены с помощью автоматизированного рамановского микроскопа Renishaw InVia Reflex (Renishaw Pic.. Англия), оснащенного диодом (830 нм) и аргоновым лазером (514 нм). Образцы помещали в камеру рамановского микроскопа. фокусировались при помощи микроскопа отраженного света и через 10 с получали спектр при интенсивности лазерного луча 0.2 ^ 6 mW. В работе использовали объектив с увеличением х 50, числовой апертурой - 0.6. Подготовка образцов осуществлялась следующим образом: 20 мкл суспензии модифицированных клеток наносили на поверхность подложек, изготовленных из фторида кальция, и высушивали под струей азота.
2. Результаты и обсуждение
Подготовка образца живых клеток для получения рамановского спектра является одной из ключевых стадий спектрометрической идентификации микроорганизмов и во многом ограничивает детекцию единичных клеток. Наночастицы благородных металлов должны находиться в непосредственном контакте с клеточной стенкой, н в то же время нежелательно проникновение наночастиц внутрь клетки. Ранее было показано, что процедура обработки клеток наночастицами в результате неопосредованного смешивания приводит к формированию большого количества агрегатов клеток, что делает невозможным детекцию единичных клеток и существенно понижает воспроизводимость анализа [10].
В данной работе клетки покрытвались наночастицами таким образом, что клеточные стенки были предварительно инкапсулированы в оболочки, состоящие нз полиэлектролитных нанопленок. Метод нанесения иротивоположно-заря-жениых полимеров широко используется для модификации планариых поверхностей н частиц [11 15]. Мы использовали в качестве поликатиоиа поли(алли-ламин)гидрохлорид, а в качестве полианиона поли(стирен)сульфонат. Серебряные наночастицы синтезировали цитратиым методом. Было показано, что суспензия наночастиц обладает высокой коллоидной стабильностью. По гистограммам распределения наночастиц по высоте (рис. 1). полученных при помощи атомносиловой микроскопии, были установлены средние размеры наночастиц: 45 ± 7 нм. В результате формирования чередующихся слоев пленок и наночастиц суспензии клеток приобретали характерную бурую окраску (типичную для серебряных наночастиц), что детектировалось невооруженным глазом.
ит
Рис. 1. а) АСМ-изображение серебряных наночастиц, б) гистограмма распределения серебряных наночастий по высоте
Рис. 2. Электронные микрофотографии бактерий Е. соИ: а) интактные клетки, б) модифицированные серебряными наночастицами
Рис. 3. АСМ-изображения клеток Е. соИ: а) интактная, б) модифицированная серебряными наночастицами
Рис. 4. Микрофотографии микроскопии отраженного света бактерий Е. соИ: а) интактные клетки, б) модифицированные серебряными наночастицами
400
900 1400 1900
волновое число(см-1)
400
900 1400
в&лное&в ЧИСЛО I СМ-1 I
1900
Рис. 5. Рамановский спектр клеток Е. соИ в зависимости от типа модификации: а) PAH/nanoAg/PAH, б) PAH/PSS/PAH/nanoAg/PAH/PSS; 1) интактные, 2, 3) модифицированные клетки
ч 12000 Н
■Ё юооо ■ Я 8000 н
о 6000 г
е 4000 н
5 2000
400 900 1400
волновое ЧИСЛО №1.1-11
1900
Рис. 6. Рамановские спектры модифицированных клеток Е. соИ (1) и 5. соНпп (2)
Далее поверхность бактерий Е. coli была исследована методом сканирующей электронной микроскопии, которая позволяет изучить модифицированную поверхность с высоким разрешением. На электронных микрофотографиях бактерии Е. coli (рис. 2). модифицированной пленками и наночастицами. четко видны агрегаты металлических наночастиц, изменяющих однородную, ровную поверхность клеток.
Атомно-силовая микроскопия показала формирование плотного и равномерно распределенного слоя наночастиц на поверхности клеток. Как показано на рис. 3. модифицированная клетка Е. coli характеризуется шероховатой поверхностью. обусловленной присоединением отрицательно заряженных наночастиц к положительно заряженной пленке. При этом нанесение дополнительных пленок поверх наночастиц позволяет зафиксировать их на поверхности клеток, предотвратив механическое удаление наночастиц при манипуляциях с образцом. Для сравнения показана нсмодифицированная клетка, поверхность которой относительно ровная и гладкая.
Автоматизированная система рамановского микроскопа представляет собой комбинацию микроскопа отраженного света и спектрометра комбинационного рассеивания. Как видно из рис. 4. после обработки ианочастицами клетки приобретают металлический блеск, характерный для серебра. Этот факт объясняется способностью ианочастиц при высушивании агрегировать и отражать видимый свет. Была также замечена тенденция к уменьшению количества агрегатов, модифицированных нанопленками и ианочастицами клеток, по сравнению с интактными (рис. 4. б). Благодаря этим двум свойствам стало возможным сфокусироваться на отдельных клетке и получить спектр единичной клетки Е. coli.
Два различных подхода к модификации клеток были применены в данной работе. В первом случае мы использовали пленку, состоящую из PAH/nanoAg/PAH. а во втором PAH/PSS/PAH/nanoAg/PAH/PSS. Рамановские спектры модифицированных и нсмодифицированиых клеток показаны на рис. 5. Видно, что спектр клеток, модифицированных как первым, так и вторым способом, содержит характерные для данного микроорганизма пики, тогда как в спектре немодифицпрован-ных клеток невозможно различить четкие пики. Экспериментальные результаты говорят о том. что наночастицы находятся в непосредственной близости от клеточной стенки, но не проникают внутрь, так как расположение спектральных пиков существенно отличается от картины, полученной при введении коллоидного серебра внутрь клеток кишечной палочки [16]. Подробные сведения о природе возникновения спектральных пиков при характеристике Е. coli с помощью рамаиовской спектроскопии опубликованы ранее [17].
Было показано, что сигнал рамановского спектра модифицированных клеток характеризуется высокой воспроизводимостью независимо от метода модификации. На рис. 5 (2 и 3) представлены рамановские спектры от разных образцов модифицированных клеток Е. coli.
Для того чтобы продемонстрировать возможность применения данного метода для распознавания клеток бактерий, мы получили спектры клеток микроорганизма S. cohnii, обработанного наночастицами и полиэлектролитами. Как видно из рис. 6. спектр стафиллокока существенно отличается от спектра кишечной палочки. Это связано с различным содержанием поверхностных биомакромолекул данных видов бактерий (первый вид является грамотрицательиым. а второй грамположительиым микроорганизмом) [18]. Совпадение ряда пиков вызвано наличием ряда веществ (полисахаридов, белков), одинаково присущих и для Е. coli, и для S. cohnii.
Заключение
Предложенный нами метод в обеих вариациях позволяет эффективно иммобилизовать наночастицы па поверхности клеток бактерий и затем определять их видовой состав методом рамановской спектроскопии. Использование таких методик. как картирование участков поверхности при помощи рамановского микроскопа и визуализация клеток по заданному характеристическому пику, позволило не только детектировать клетки одного вида, но и разделить несколько видов микроорганизмов в смеси. Если применение системы PAH/nanoAg/PAH для модификации является менее ресурсоемким н более быстрым, то использование пленок PAH/PSS/PAH/nanoAg/PAH/PSS позволяет получить высокодисперсные суспензии единичных клеток. Описанный памп метод может быть использован не только для модификации клеток бактерий, но и микромицетов. водорослей, а также в перспективе растений и животных.
Summary
A.I. Zamaleeva, М. Kahraman, М. Culha, R.F. Fakhrullin. Nanomodified Bacteria: Detection of Individual Cells Using Surface-Enhanced Raman Scattering.
The layer-by-layer method of coating bacterial cells with polyelect.rolyt.es and silver nanoparticles for improving the surface-enhanced Raman scattering (SERS) spectra is reported. First., the bacteria cell wall is coated with poly(allylamine) hydrochloride (PAH) and/or poly(st.yrene) sulfonate (PSS) and then with citrate reduced silver nanoparticles. In order to increase the stability of the coating, other layers of PAH/PSS are formed 011 the surface. The SEM and AFM images indicate isolated nanoparticles and aggregates of nanoparticles 011 the bacterial wall. The coating of bacterial cells with silver nanoparticles not. only serves for their preparation for SERS measurement, but also helps to visualize the coated bacterial cells under the ordinary whit.eliglit. microscope objective due to efficient, light, scattering properties of silver nanoparticles. The two bacteria that, differ in shape and cell wall biochemical structure, Escherichia culi and Staphylococcus cohnii, Gram-negative and Gram-positive respectively, are used as models. Reproducible SERS spectra were obtained from single and aggregated silver nanopart.icle-coat.ed cells. These spectra can provide valuable information about, chemical structure of bacterial cell wall. Preliminary results reveal that, the approach could be used for single bacterial cell identification. Key words: layer-by-layer, polyelectrolyte nanofilms, silver nanoparticles, single cell, surface-enhanced Raman scattering.
Key words: layer-by-layer method, polyelectrolyte nanofilms, silver nanoparticles, single cell, surface-enhanced Raman scattering.
Литература
1. Smith C.J., Osborn A.M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology // FEMS Microbiol Ecol. 2009. V. 67, No 1. P. 6 20.
2. Naumann D., Helm D., Labischinski H., Giesbrecht P. The characterization of microorganisms by Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) // Modern Techniques for Rapid Microbiological Analysis. 1991. P. 133 141.
3. Puppels G.J., De Mul F.F., Otto C., Greve J., Robert-Nicoud М., Arndt-Jovin D.J.
Studying single living cells and chromosomes by confocal Raman microspect.roscopy //
Nature (London). 1990. V. 347. P. 301 303.
4. Otto A. Investigations of electrode surfaces in acet.onit.rile solutions using surface-enhanced Raman spectroscopy // Light. Scattering. In Solids. 1984. V. 4. P. 289 296.
5. Premasiri W.R., Moir D.T., Klempner M.S., Krieyer N.. Jones G., Zieyler L.D.
Characterization of the Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) of Bacteria //
J. Phys. Chem. 2005. V. 109. P. 312 320.
6. Chang R.K., Furtak Т.Е. Surface Enhanced Raman Scattering. New York. London:
Plenum Press, 1982. 432 p.
7. Laucks M.L., Sengupta A., Junge K., Davis E.J., Swanson B.D. Comparison of Psycliro-act.ive Arctic Marine Bacteria and Common Mesopliillic Bacteria Using Surface-Enhanced Raman Spectroscopy // Appl. Spect.rosc. 2005. V. 59. P. 1222 1228
8. Kahraman М., Yazici M.M., Gahin F., Bayrak O.F., Qulha M. Reproducible Surface-Enhanced Raman Scattering Spectra of Bacteria on Aggregated Silver Nanoparticles // Appl. Spect.rosc. 2007. V. 61. P. 479 485.
9. Taton T.A., Mirkin C.A., Letsinger R.L. // Science. 2000. V. 289. P. 1757.
10. Jarvis R.M., Brooker A., Goodacre R. Rapid analysis of microbiological systems using SERS // Anal. Cliem. 2004. V. 76. P. 5198 5202.
11. Arida A.I., Al-Tahakha M.M. Encapsulation of ket.oprofen for controlled drug release //
Eur. J. Pliarm. Biopliarm. 2007. V. 66, No 1. P. 48 54.
12. Correa-Duarte M.A., Kosiorek A., Kandulski W., Giersig М., Liz-Marzan L.M. Layer-by-
Layer Assembly of Multiwall Carbon Nanot.ubes on Spherical Colloids // Cliem. Mater. 2005 V. 17, No 12. P. 3268 3272.
13. Multilayer Thin Films / Eds. G. Declier, J.B. Sclilenoff. Wiley-VCH Verlag GmbH &
Co., 2002. 535 p.
14. Diaspro A., Silvano D., Krol S., Cavalleri O., Gliozzi A. Single living cell encapsulation in nano-organized polyelect.rolyt.e shells // Langmuir. 2002. V. 18. P. 5047 5050.
15. Sukhorukov G.B., Donath E., Lichtenfeld H., Knippel E., Knippel М., Budde A., Mohwald
H. Layer-by-layer Self Assembly of Polyelect.rolyt.es on Colloidal Particles // Colloid
Surface A. 1998. V. 137, No 1 3. P. 253 266.
16. Zeiri L., Bronk B., Shabtai V.Y., et al. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy as a Tool for Probing Specific Biochemical Components in Bacteria // Appl. Spect.rosc. 2004.
V. 58. P. 33 40.
17. Kahraman, M. Muge Y. М., Fikrettin Siiahin, Culha M. Convective Assembly of Bacteria for Surface-Enhanced Raman Scattering // Langmuir. 2008. V. 24. P. 894 901.
18. Sengupta A., Mujacic М., Davis E. Detection of bacteria by surface-enhanced Raman spectroscopy 11 J. Anal. Bioanal. Cliem. 2006. V. 386. P. 1379 1388.
Поступила в редакцию 21.01.09
Замалеева Алсу Ильгизовна аспирапт кафедры биохимии Казанского государственного университета.
E-mail: alsul30ksuemail.ru
Мехмет Кахраман аспирапт Стамбульского технического университета, Турция.
E-mail: mkahraman Qyeditepe. edu. tr
Мустафа Чулха кандидат химических паук, доцепт факультета генетики и биоинженерии Университета Едитепе (Yeditepe University), г. Стамбул, Турция.
E-mail: mculhaQyeditepe.edu.tr
Фахруллин Равиль Фаридович кандидат биологических паук, старший преподаватель кафедры биохимии Казанского государственного университета.
E-mail: biosensorQbk.ru
