CC BY
15ISSN 0868-5886 НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2016, том 26, № 3, c. 3-9 -ПРИБОРОСТРОЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ ^ -=
УДК 536.629
© Г. В. Котельников, С. П. Моисеева
НАНОКАЛОРИМЕТР ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ ТЕПЛОПРОДУКЦИИ В МИТОХОНДРИЯХ
Измерение трансформации и диссипации энергии в митохондриях калориметрическим методом было осуществлено во второй половине прошлого столетия. Однако до настоящего времени не было создано специализированного калориметра для этой цели. Выбор соединений, обеспечивающих разобщенное дыхание митохондрий без повреждения компонентов дыхательной цепи, для использования в составе фармацевтических композиций лекарственных средств, разработка новых нейропротекторов, новых нефропротекторов, требуют прецизионных измерений тепловыделений митохондрий под действием различных разобщителей окислительного фосфорилирования. В ИБП РАН создан капиллярный дифференциальный нанокалориметр для изучения трансформации и диссипации энергии в митохондриях, который отвечает этим требованиям. Принципиальное достоинство калориметра заключается в том, что он имеет тепловые мосты для термоста-тирования инъекции митохондрий. В них инъекция митохондрий приобретает температуру измерительного объема калориметрических камер в течение нескольких секунд. Митохондрии вводятся тонким слоем по всей длине калориметрической камеры, перемещающейся дозирующей иглой. Это обеспечивает смешивание митохондрий с образцом без больших энергетических затрат и тепловых шумов. Прецизионные измерения тепловой мощности процессов трансформации и диссипации энергии в митохондриях выполняются с абсолютной погрешностью не более 50 нВт.
Кл. сл.: капиллярный нанокалориметр, митохондрия, тепловой шунт, изотермический режим, разобщение
ВВЕДЕНИЕ
В работе [1] еще в 1978 г. на основе изучения тепловой энергии при дыхании митохондрий показано, что "баланс энергии реакций в системе трансформации энергии может непосредственно измеряться калориметрически". Данные результаты базируются на экспериментальном подтверждении равенства измеренной энергии окисления субстрата митохондриями и известной теплотой сгорания использованного субстрата. Данные получены на двух разных субстратах, и на сукцинате и на глутамате. Оценка АТФ-синтеза сделана по разнице измеренной тепловой энергии при сопряженном и разобщенном дыхании митохондрий. Эти важные научные результаты получены с использованием зарождавшегося в 60-е годы метода дифференциального термического анализа, предшественника точной калориметрии. При этом расчет энергии выполнен благодаря использованию оригинальной калибровки для преобразования измеренных температурных перепадов в единицы энергии.
В последующий период стали появляться работы по исследованию теплопродукции митохондрий на лабораторных калориметрических установках, решающих специфические задачи. В работе [2] представлены калориметрические измерения в условиях ограниченного содержания кислорода
в калориметрической камере. В работе [3] выполнен поиск условий, при которых митохондрии риса выделяют больше или меньше энергии. Современные аналоги, например описанные в работах [4, 5], Omega [6], VP-ITC, ÍTC200, Auto ÍTC200 (MicroCal, USA), не предназначены для измерения тепловой мощности в процессах трансформации и диссипации энергии в митохондриях из-за разобщения дыхания митохондрий в процессе длительного, более 10 мин, выравнивания температуры добавки в них до температуры исследуемого образца. Однако современные задачи поиска соединений, обеспечивающих разобщенное дыхание митохондрий без повреждения компонентов дыхательной цепи, для использования в составе фармацевтических композиций лекарственных средств [7], разработка новых нейропротекторов [8-10], новых нефропротекторов [10] требуют новых калориметрических приборов для прецизионных измерений тепловыделений митохондрий под действием различных разобщителей окислительного фосфорилирования.
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПОСТРОЕНИЯ НАНОКАЛОРИМЕТРА
Разработанные теоретические основы построения калориметра касаются ключевых проблем:
метода выделения измерительного объема калориметрических камер; метода выравнивания концентрации добавки в измерительном объеме калориметрической камеры; метода введения добавки в калориметрическую камеру.
теплопроводности меди; Ак — коэффициент теплопроводности материала камеры; — коэффициент теплопроводности материала шунта; Хж — коэффициент теплопроводности жидкости; d — зазор между шунтами.
Метод выделения измерительного объема
Чтобы оценить теоретически точность выделения измерительного объема калориметрических камер в дифференциальном титрационном калориметре, была разработана и исследована тепловая модель калориметрической камеры [11]. По указанной модели предусмотрен идеальный тепловой контакт калориметрических камер с пассивным тепловым шунтом, который имеет идеальный тепловой контакт с изотермическим экраном, температура которого поддерживается постоянной системой автоматического регулирования. Показано, что пассивный тепловой шунт исключает влияние теплового эффекта в зоне этого шунта на величину регистрируемого сигнала тепловой мощности, возникающей в измерительном объеме калориметрических камер. Предложенная техническая реализация теплового шунта сводит практически к нулю влияние теплового эффекта в зоне шунта. Данная погрешность оценивается величиной коэффициента К, рассчитываемого по формуле (1), и равна 0.003 %.
К =
2а ■ Ь ■ г2 + -
• Гпр2 (Хонст + Хм )
2Лш ■ И (Г22 - Г12 )■ Хк + Г2 ■ Хж
1п
+
21 а-Ь ■ г + пЬг 2(Х + Х )
пр 2 пр \ конст м /
1 +
21пр[(Г22 -Г12)■ Хк + Г12 ■ Хж]
(1)
тановленной между камерами; гп
Выравнивание концентрации добавки в измерительном объеме калориметрической камеры
Капиллярные калориметрические камеры были выбраны для титрационного калориметра после оценки эффективности смешивания добавки и образца в такой камере. В качестве критерия было выбрано время выравнивания концентрации добавки в объеме образца в результате концентрационной диффузии, которое определяется по предложенному расчетному соотношению (2):
К
2 (
т = -
2А
1 - ^ V
1п
к у
V, -1
V V .
(2)
где а — коэффициент теплоотдачи; Г\ — внутренний радиус калориметрической камеры; г2 — внешний радиус калориметрической камеры; Ь — высота рабочего объема; И — высота шунта; Кш — радиус шунта; п — число ветвей медь-константановой измерительной термобатареи, ус-
радиус про-
водов ветвей термобатареи; — длина каждой ветви термобатареи; Яконст — коэффициент теплопроводности константана; Лм — коэффициент
где У<1 — объем жгута (дозы титранта); К0 — радиус жгута; Ук — рабочий объем калориметрической камеры; Dk — коэффициент диффузии титранта в образце; к — коэффициент выравнивания концентрации титранта в образце.
Это соотношение подтверждено экспериментально на капиллярном калориметре по зарегистрированному тепловому процессу взаимодействия: никотинамидадениндинуклеотид (восстановленная форма НАДН) и лактатдегидрогеназа (ЛДГ) [12].
Введение добавок осуществляется следующим образом: при введении дозы производится продольное перемещение шприцов на всю длину калориметрических камер винтовым механизмом перемещения, управляемым шаговым двигателем перемещения шприцов. Одновременно с этим производится перемещение поршней винтовым механизмом, управляемым шаговым двигателем перемещения поршней. За счет различной величины перемещений винтовых механизмов шприцами осуществляется дозирование заданного количества реагентов. Управление шаговыми двигателями осуществляется компьютером. При этом добавка распределяется по всей длине рабочего объема калориметрической камеры в виде тонкого жгута. В процессе эксперимента добавка может вводиться многократно.
В калориметре предусмотрено также механическое перемешивание реагентов в калориметрических камерах за счет колебаний дозирующих игл с амплитудой и частотой, выбираемых из условий эксперимента. Этот режим работы исключает образование осадка при исследовании митохондрий.
I
х
г
2
1
X
Метод введения дозирующей иглы в калориметрическую камеру нанокалориметра
Открытые калориметрические камеры были применены впервые в созданном дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-1 [13]. Данное техническое решение, хорошо зарекомендовавшее себя в научной практике, применено в нанокалориметре. Введение добавки в калориметрические камеры осуществляется через открытые концы камер дозирующими шприцами. В нанокалориметре предусмотрена система тепловых шунтов, проходя через которые добавка принимает температуру исследуемого образца, что позволяет вводить добавку, имеющую температуру, соответствующую температуре хранения, т. е. без какого-либо предварительного термостатирования. При этом скорость введения может достигать величины 13.7 мм/с, что позволяет выполнить операцию введения добавки в нанокалориметр в течение 5 с. В работе [14] приведено теоретическое обоснование данного режима нанокалориметра. Экспериментально подтверждено, что указанный режим введения добавки не вносит паразитного тепла в измерительный объем калориметрической камеры, что позволяет при измерениях трансформации и диссипации энергии в митохондриях вводить в калори-
метрические камеры митохондрии в виде добавки. Это обстоятельство позволяет регистрировать мощность теплового эффекта без задержки во времени с момента введения митохондрий в калориметрическую камеру и является важным достоинством нанокалориметра, обеспечивающим прецизионные измерения тепловой мощности трансформации и диссипации энергии в митохондриях. В случае постановки эксперимента, при котором митохондрии загружаются непосредственно в калориметрическую камеру и выдерживаются в ней до достижения заданной температуры, точность измерений может снижаться из-за того, что изменяется жизнеспособность митохондрий при длительном пребывании при температуре порядка 26 оС. Однако количественной оценки указанного процесса в литературе не встречается. Возможности нашего нанокалориметра позволяют выполнить такую оценку. Реагенты, используемые для испытания прибора, получены из Sigma.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ КАЛОРИМЕТРИЧЕСКОГО БЛОКА
НАНОКАЛОРИМЕТРА
Калориметрический блок нанокалориметра представлен на рис. 1. На нем показаны элементы, в построении которых учтены требования предыдущего теоретического раздела статьи.
Рис. 1. Калориметрический блок нанокалориметра для измерения теплопродукции в митохондриях. 1 — пассивный тепловой шунт; 2 — активный тепловой шунт; 3, 4 — калориметрические камеры; 5 — пайка серебряным припоем; 6, 7, 8 — термостатирующие экраны; 9 — держатель; 10, 11 — дозирующие иглы
Тепловые шунты 1 и 2 соединены с капиллярами 3 и 4 с обеспечением надежного теплового контакта за счет пайки 5 серебряным припоем, а тепловой контакт пассивного шунта 1 с экраном 6 обеспечивается механическим сжатием деталей. Надежный тепловой контакт между камерами 3 и 4 и тепловыми шунтами 1 и 2 обеспечивает точное выделение рабочего объема, благодаря тому что тепло из зоны пассивного шунта 1 не попадает в измерительный объем калориметрических камер. Это тепло отводится в корпус теплового шунта 1 и далее на термостатирующую оболочку, состоящую из экранов 6-8. Таким образом, в измерительный сигнал вклад дает только тепло, выделяющееся в измерительном объеме. Теплообмен между калориметрическими камерами и экраном 6 отсутствует, поскольку температуры калориметрических камер 3, 4 и экрана 6, в котором они замкнуты, равны. Данное решение не требует использования отдельного регулятора температуры калориметрических камер для регулирования их температуры, что исключает в измерительном сигнале возникновение тепловых шумов, связанных с работой указанной системы регулирования.
Конструкция калориметрического блока предусматривает соосность установленных на держателе 9 дозирующих игл 10, 11 и калориметрических камер 3, 4, что исключает удары дозирующих игл о стенки камер, сопровождающиеся возникнове-
нием тепловых шумов, снижающих отношение сигнал/шум при измерениях тепловой мощности. При этом обеспечивается соответствие времени перемешивания реагентов за счет концентрационной диффузии расчетному времени. Перемешивание за счет концентрационной диффузии реагентов в калориметрической камере эффективно. Например, тестирование калориметра по связыванию Ва2+ с 18-Crown-6 с использованием только указанного перемешивания дает точное значение параметров связывания [15], необходимая при этом высокая воспроизводимость базовой линии обеспечивается благодаря работе тепловых шунтов, минимизирующих паразитные тепловые потоки в измерительный объем калориметрических камер.
ТЕСТИРОВАНИЕ НАНОКАЛОРИМЕТРА ПО ВЗАИМОДЕЙСТВИЮ BA2+—18-CROWN-6
Масштабный коэффициент шкалы мощности определен по первому пику термограммы связывания Ва2+—18-Crown-6 [1б], которая приведена на рис. 2. При этом энергия пика равна 5229 мкДж. Указанная энергия содержится в сигнале прямоугольной формы с высотой 4526.26 нВ и продолжительностью 96 с, что дает масштабный коэффициент мощности, равный 83 нВ / мкВт.
В
сТ
о
а
о н о а о
и
о «
о ч а
<и н
20000•
15000-
10000-
5000-
И
и «
С0
1Щ1
500
1000
1500
2000
2500
3000
Время, с
Рис. 2. Термограмма связывания Ва +—18-Crown-6. Образец — 156 мкл 18-0^п-6 (0.01 М); добавка — 1.6644 мкл Ва2+ (0.1 М). Температура: 25 °С. Перемешивание: колеблющаяся игла 18.5 Гц
ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАНОКАЛОРИМЕТРА
Масштабный коэффициент шкалы мощности —
Измерение исследуемых процессов трансформации и диссипации энергии в митохондриях с абсолютной погрешностью не более —
Измерительный объем калориметрической камеры —
Объем добавки суспензии митохондрий (титранта) — Изотермический режим работы нанокалориметра: рабочий диапазон температур — Механическое перемешивание реагентов в калориметрических камерах колеблющимися дозирующими иглами с частотой
83 нВ / 1мкВт;
50 нВт;
156 мкл;
от 1 до 10 мкл;
от 15 до 50 оС;
— от 1 до 20 Гц.
Разработанный нанокалориметр представляет собой модификацию калориметра КТД-2156 [14]. Нанокалориметр отличается повышенной чувствительностью за счет созданного для него высокочувствительного калориметрического блока (ЮФВК.418227.001СБ). Это обеспечило соответствие нанокалориметра современным требованиям,
необходимым для измерения тепловой мощности процессов диссипации и трансформации энергии в митохондриях.
РЕЗУЛЬТАТЫ КАЛОРИМЕТРИЧЕСКИХ ИЗМЕРЕНИЙ
Для калориметрических измерений митохондрии печени крысы линии Wistar выделяли методом дифференциального центрифугирования по стандартной методике. Среда выделения содержала 0.3 М сахарозы, 10 мМ HEPES (рН 7.4), 1 мМ EGTA. Митохондрии отмывали в среде выделения без EGTA. Среда инкубации содержала 125 мМ KCl, 3 мМ KH2PO4, 1 мМ MgSO4, 10 мМ HEPES рН 7.4 [17].
На рис. 3 приведены кривые, представляющие собой временную зависимость тепловой энергии, полученной в результате интегрирования сигналов тепловой мощности: кривая 1 — при введении 6.6 мкл размороженной суспензии митохондрий в среде выделения в измерительный объем калориметрической камеры 156 мкл со средой инкубации и сукцинатом (5 мМ); кривая 2 — при введении 6.6 мкл размороженной суспензии митохондрий в среде выделения в измерительный объем калориметрической камеры 156 мкл со средой инкубации и гидроксибутиратом (8 мМ). Температура калориметрических камер — 26 °С.
7000-
6000-
- 5000-
о
4000-
« -
s L- 3000-
Ср
(D
И
m 2000-
(0 -
о ч 1000-
а
<D ■
H 0-
-1000
т
т
100
200
300 400
Время, с
500
600
Рис. 3. Тепловая энергия, полученная в результате интегрирования сигналов тепловой мощности при введении в калориметрическую камеру размороженной суспензии митохондрий в зависимости от вида субстрата. Кривая 1 — интегрированная тепловая мощность на субстрате сукцинат; кривая 2 — интегрированная тепловая мощность на субстрате гидроксибу-тират
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Нанокалориметр перспективен для решения современных задач поиска соединений, обеспечивающих разобщенное дыхание митохондрий без повреждения компонентов дыхательной цепи, для использования в составе фармацевтических композиций лекарственных средств, разработки новых нейропротекторов, новых нефропротекторов. Он может быть использован для прецизионных измерений тепловыделений митохондрий под действием различных разобщителей окислительного фосфорилирования.
Работа выполнена при поддержке фонда РФФИ 13-08-00933-а.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Nakamura T., Matsuoka I. Calorimetric studies of heat of respiration of mitochondria // Journal of Biochemistry. 1978. Vol. 84, no. 1. P. 39-46.
2. Gnaiger E., Mendez G., Hand S.C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia // PNAS. 2000. Vol. 97, no. 20. P. 11080-11085. Doi: 10.1073/pnas.97.20.11080.
3. Zhou P.-J., Zhou H.-T., Liu Y., Qu S.-S., Zhu Y.-G., Wu Z. -B. Studies on the energy release of rice mitochondria under different conditions by means of microcalori-metry // Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 2001. Vol. 48, no. 1. P. 1-11. Doi: 10.1016/S0165-022X(00)00123-8.
4. Velázquez-Campoy A., López-Mayorga O., Cabrerizo-Vi Ichez MA. Development of an isothermal titration mi-crocalorimetric system with digital control and dynamic power Peltier compensation. I. Description and basic performance // Review of Scientific Instruments. 2000. Vol. 71, no. 4. P. 1824-1831. Doi: 10.1063/1.1150543.
5. Garcia-Fuentes L., Baron C., Mayorga O.L. Influence of dynamic power compensation in an isothermal titration microcalorimeter // Analytical Chemistry. 1998. Vol. 70, no. 21. P. 4615-4623. Doi: 10.1021/ac980203u.
6. Wiseman Т., Williston S., Brandts J.F., Lin L.-N. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter // Analytical Biochemistry. 1989. Vol. 179, no. 1. P. 131-137.
7. Патент РФ № 2527519, 10.09.2014.
8. Silachev D.N., Khailova L.S., Babenko V.A., Gu-lyaev M.V., Kovalchuk S.I., Zorova L.D., Plotnikov E.Y., Antonenko Y.N., Zorov D.B. Neuroprotective effect of glu-tamate-substituted analog of gramicidin A is mediated by the uncoupling of mitochondria // Biochimica et Biophy-sica Acta. General Subjects. 2014. Vol. 1840, no. 12. P. 3434-3442.
9. Khailova L.S., Silachev D.N., Rokitskaya T.I. et al. A short-chain alkyl derivative of Rhodamine 19 acts as a mild uncoupler of mitochondria and a neuroprotector // Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 2014. Vol. 1837, no. 10. P. 1739-1747. Doi: 10.1016/j.bbabio. 2014.07.006.
10. Plotnikov E.Y., Silachev D.N., Jankauskas S.S. et al. Mild uncoupling of respiration and phosphorylation as a mechanism providing nephro- and neuroprotective effects of penetrating cations of the SkQ family // Biochemistry (Moscow). 2012. Vol. 77, no. 9. P. 1029-1037. Doi: 10.1134/S0006297912090106.
11. Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P., Mezhburd E.V., Krayev V.P. Method of separating the sensitive volume of calorimetric cells in a differential titration calorimeter // Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 2000. Vol. 62, no. 1. P. 39-50. Doi: 10.1023/A:1010150409126.
12. Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P., Mezhburd E.V., Krayev V.P. New isothermal titration calorimeter for investigations on very small samples. Theoretical and experimental studies // Journal of Thermal Analysis and Calo-rimetry. 2002. Vol. 68, no. 3. P. 803-818. Doi: 10.1023/ A:1016165817003.
13. Патент США N 4112734, 12.09.1978.
14. Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P., Mezhburd E.V., Maevsky E.I., Grishina E.V. Studying dispersoid systems method of introducing an injecting needle into calorime-tric chamber of capillary titration calorimeter // Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 2005. Vol. 81, no. 2. P. 255-259. Doi: 10.1007/s10973-005-0775-6.
15. Патент РФ № 2335743, 10.10.2008.
16. Briggner L.E., Wadso I. Test and calibration processes for microcalorimeters, with special reference to heat conduction instruments used with aqueous systems // Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 1991. Vol. 22, no. 2. P. 101-118. Doi: 10.1016/0165-022X(91)90023-P.
17. Гришина Е.В., Хаустова Я.В., Васильева А.А., Маевский Е.И. Возрастные особенности влияния сук-цината на индуцированное окисление липидов митохондрий печени крыс // Биофизика. 2015. Т. 60, № 4. С. 708-715.
Институт биологического приборостроения РАН, г. Пущино, Московская область
Контакты: Моисеева Софья Петровна, spmoiseeva@yandex.ru
Материал поступил в редакцию: 28.04.2016
ISSN 0868-5886
NAUCHNOE PRIBOROSTROENIE, 2016, Vol. 26, No. 3, pp. 3-9
NANOCALORIMETER FOR MEASURING THE HEAT PRODUCTION IN MITOCHONDRIA
G. V. Kotelnikov, S. P. Moiseyeva
Institute for Biological Instrumentation RAS, Pushchino, Moscow Region, Russia
Measurements of energy transformation and dissipation in mitochondria by the calorimetric method were carried out in the second half of the last century. However, to date no specialized calorimeter has been developed for this purpose. Selection of compounds providing uncoupleted mitochondrial respiration without damaging the respiratory chain components, for use in pharmaceutical compositions of drugs, development of new neuroprotectors, nefroprotectors require precise measurements of heat release by different mitochondrial un-couplers of oxidative phosphorylation. A capillary differential nanocalorimeter for studying energy transformation and dissipation in the mitochondria has been created in the IBI RAS . The instrument meets the above requirements. The principal advantage of the nanocalorimeter is that it has thermal bridges for the thermosta-tingthe mitochondria injection. In the thermal bridges mitochondria acquire the desired temperature for a few seconds. Mitochondria are introduced uniformly along the entire length of the calorimeter chamber by means of a dispensing needle. This provides mixing of mitochondria with the sample without great energy consumption and thermal noise. Precision measurements of thermal power of the processes of transformation and dissipation of energy in the mitochondria are carried out at an absolute error less than 50 nW.
Keywords: capillary nanocalorimeter, mitochondria, thermal bridge, isothermal mode, uncoupling
REFERENСES
1. Nakamura T., Matsuoka I. Calorimetric studies of heat of respiration of mitochondria. Journal of Biochemistry, 1978, vol. 84, no. 1, pp. 39-46.
2. Gnaiger E., Mendez G., Hand S.C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. PNAS, 2000, vol. 97, no. 20, pp. 11080-11085. Doi: 10.1073/pnas.97.20.11080.
3. Zhou P.-J., Zhou H.-T., Liu Y., Qu S.-S., Zhu Y.-G., Wu Z.-B. Studies on the energy release of rice mitochondria under different conditions by means of microcalori-metry. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2001, vol. 48, no. 1, pp. 1-11. Doi: 10.1016/S0165-022X(00)00123-8.
4. Velázquez-Campoy A., López-Mayorga O., Cabrerizo-Vi lchez MA. Development of an isothermal titration mi-crocalorimetric system with digital control and dynamic power Peltier compensation. I. Description and basic performance. Review of Scientific Instruments, 2000, vol. 71, no. 4, pp. 1824-1831. Doi: 10.1063/1.1150543.
5. Garcia-Fuentes L., Baron C., Mayorga O.L. Influence of dynamic power compensation in an isothermal titration microcalorimeter. Analytical Chemistry, 1998, vol. 70, no. 21, pp. 4615-4623. Doi: 10.1021/ac980203u.
6. Wiseman T., Williston S., Brandts J.F., Lin L.-N. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter. Analytical Biochemistry, 1989, vol. 179, no. 1, pp. 131-137.
7. Patent RF N 2527519, 10.09.2014. (In Russ.).
8. Silachev D.N., Khailova L.S., Babenko V.A., Gu-
lyaev M.V., Kovalchuk S.I., Zorova L.D., Plotnikov E.Y., Antonenko Y.N., Zorov D.B. Neuroprotective effect of glutamate-substituted analog of gramicidin A is mediated by the uncoupling of mitochondria. Biochimica et Biophy-sica Acta. General Subjects, 2014, vol. 1840, no. 12, pp. 3434-3442.
9. Khailova L.S., Silachev D.N., Rokitskaya T.I., Aveti-syan A.V., Lyamsaev K.G., Severina I.I., Il'yaso-va T.M., Gulyaev M.V., Dedukhova V.I., Trendeleva T.A., Plotnikov E.Y., Zvyagilskaya R.A., Chernyak B.V., Zorov D.B., Antonenko Yu.N., Skula-chev V.P. A short-chain alkyl derivative of Rhodamine 19 acts as a mild uncoupler of mitochondria and a neuropro-tector. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics, 2014, vol. 1837, no. 10, pp. 1739-1747. Doi: 10.1016/j.bbabio.2014.07.006.
10. Plotnikov E.Y., Silachev D.N., Jankauskas S.S., Rokitskaya T.I., Chupyrkina A.A., Pevzner I.B., Zorova L.D., Isaev N.K., Antonenko Y.N., Skulachev V.P., Zorov D.B. Mild uncoupling of respiration and phosphorylation as a mechanism providing nephro- and neuroprotective effects of penetrating cations of the SkQ family. Biochemistry (Moscow), 2012, vol. 77, no. 9, pp. 1029-1037.
Doi: 10.1134/S0006297912090106.
11. Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P., Mezhburd E.V., Krayev V.P. Method of separating the sensitive volume of calorimetric cells in a differential titration calorimeter. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 2000, vol. 62, no. 1, pp. 39-50. Doi: 10.1023/A:1010150409126.
12. Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P., Mezhburd E.V., Krayev V.P. New isothermal titration calorimeter for in-
vestigations on very small samples. Theoretical and experimental studies. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 2002, vol. 68, no. 3, pp. 803-818. Doi: 10.1023/ A:1016165817003.
13. Patent USA N 4112734, 12.09.1978.
14. Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P., Mezhburd E.V., Maevsky E.I., Grishina E.V. Studying dispersoid systems method of introducing an injecting needle into calorime-tric chamber of capillary titration calorimeter. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 2005, vol. 81, no. 2, pp. 255-259. Doi: 10.1007/s10973-005-0775-6.
15. Patent RF N 2335743, 10.10.2008. (In Russ.).
16. Briggner L.E., Wadsö I. Test and calibration processes for
microcalorimeters, with special reference to heat conduction instruments used with aqueous systems. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 1991, vol. 22, no. 2, pp. 101-118. Doi: 10.1016/0165-022X(91)90023-P.
17. Gpishina E.V., Xauctova Ya.V., Vacil'eva A.A., Maevck-ij E.I. [Age features of influence of a suktsinat on the induced oxidation of lipids of mitochondrions of a liver of rats]. Biofizika [Biophysics], 2015, vol. 60, no. 4, pp. 708715. (In Russ.).
Contacts: Moiseyeva Sofya Petrovna, spmoiseeva@yandex.ru
Article received in edition: 28.04.2016
