CC BY
129
УДК 541.182:621.3:616
НАНОБИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ
В.К. ПЛОТНИКОВ*
Нанобиотехнология — это быстро прогрессирующая область научных и технологических возможностей создания новых методов познания биосистем на основе конструирования специфических структур в нанометровом диапозоне. Достижения нанобиотехнологии особенно важны для разработки новых методов биодиагностики, основанной на применениии наночастиц для специфической детекции в биоаналитических и клинических направлени х. Дан краткий обзор работ авторов и литературных данных по синтезу, оптическим свойствам, функциолизации и применени м плазмонно-резонансных наночастиц.
Ключевые слова: нанобиотехнология, наночастицы, биодиагностика, биосистемы.
Революционное развитие методов в молекулярной биологии
В 2 008 г. исполнилось 55 лет науке, которая называется молекулярная биология и которая составля ет основу практически всей современной биологии. Как известно, 1953 г. считается годом рождения молекуля рной биологии когда в журнале «Nature» вышла статья Джеймса Уотсона и Френсиса Крика, объясня ющая строение ДНК как вещества наследственности (двойная спираль) [1]. С тех пор исследованию нуклеиновых кислот как ДНК, так и РНК придаётся особое значение. Положение «самой главной молекулы») от ДНК в настоя щее время переходит к РНК как центральному звену живой материи, обладающему и свойствами матрицы, подобно ДНК, и ферментативными свойствами, подобно белкам [2].
Молекулярная биология непрерывно заимствует методы физики и химии. Последние три дес тилети
ознаменованы новыми технологи ми и методами, которые определили не только прогресс прошедших дес -тилетий, но и ближайшего десяти-лети . Наиболее поразительными методическими достижениями ближайших дес тилетий была разработка методов генной инженерии в 70-е годы, достигших массового распространения в 80-е годы, виртуозного совершенства и практически безграничного применения в 90-е годы ХХ века. 1970-е годы стали эпохой ещё одной методической революции — были созданы два метода секвенировани ДНК (метод Максама-Гилберта и метод Сэнгера), что превратило ДНК и РНК из объекта биологического в объекты, имеющие точную химическую структуру — нуклеотидную последовательность. Важнейшей вехой методической революции в молекул рной биологии было создание метода размножения ДНК в пробирке с помощью цепной полимеразной реакции (ПЦР).
* Государственное научное учреждение Краснодарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства имени П.П. Лукьяненко.
Сейчас очевидно, что перестало быть проблемой установление первичной структуры гена, но всё ещё остаётся проблема, как узнать его функцию и как ею управлять. Первое десятилетие XXI века ознаменовано стремительным прорывом в важнейшую биологическую проблему — регуляцию экспрессии генов с помощью я вления РНК-интерференции и основанных на этом я влении методов «нокаутов» — техники, позволя ющей выводить из стро заранее выбранный ген, а затем смотреть, как это скажется на организме. Суть я вления, механизм которого пока изучен очень слабо, состоит в том, что двуспиральные РНК определённой структуры вызывают распад мРНК мишени — гена, экспрессию которого необходимо подавить. Это широко распространённое в природе явление (по-видимому, от бактерий до млекопитающих) может эффективно исполь-зоватьс дл идентификации новых генов, выя снения их функциональной роли и управления их экспрессией т vitro и т vivo. Необходимо подчеркнуть, что это чисто биологический метод [3, 4, 5].
Кроме того, интегратизм биологии XXI века означает, что ответ на нерешённые в прошлом проблемы будут искать не путём изолированного из-учени отдельных генов или генных продуктов, а через анализ интегральных ответов клетки на то или иное воздействие или состоя ние. Ясно, что ответ клетки на сигнал (например, воздействие биорегул тора на рецептор, появление низкомолекулярного биорегулятора в окружающей клетку среде и т.д.) носит всегда многозвенный характер: отвечает не один ген, а множество, подчас самых неожиданных и внешне не св занных с исходным воздействием.
То обстоятельство, что успехи современной молекул рной биологии не столь решительно сказались в таких областях, как, например, биология
развития, во многом связано именно с тем, что только интегральный подход — анализ тысяч генов, а не единиц действительно ведёт к пониманию закономерностей эмбриогенеза, дифференцировки и других составл ющих биологии развити . В развитии интегратизма, идущему на смену редукционизму, огромную роль призвана играть нова технологи — биологические микрочипы, — позволя ющая на ничтожном пространстве в несколько квадратных сантиметров анализировать тысячи молекул, например, функционирование тысяч генов [6, 7, 8].
Принципиально новые перспективы в исследовании ДНК и РНК и в их практическом использовании по вл -ются в последние 15 лет в свя зи с развитием методов нанобиотехнологий.
Что такое нанобиотехнология?
Термин «нанотехнология») впервые был использован понским учёным
Н. Танигучи в 1974 г. на конференции Японского общества точного машиностроения . Автор хотел обратить внимание специалистов на гр дущий переход к обработке материалов с ультравысокой точностью, прогнозируя , что к 2000 г. эта точность достигнет нанометрового интервала, что потребует применени как новых технологических приёмов, так и соответствующего метрологического обеспечения [9, 10].
Однако, принципиальное значение малоразмерных объектов было отмечено значительно раньше — в 1959 г. лауреатом Нобелевской премии физи-ком-теоретиком Ричардом Фейнманом. При обсуждении проблем миниатюризации в лекции «Внизу полным-полно места: приглашение в новый мир» подчёркивалась актуальность работ в области сжатия информации, создани миниатюрных компьюте-
ров, овладение молекулярной архитектурой. Фейнман затрагивал также проблемы смазки в малых узлах тре-
ния, oбpaщaл внимание на нeoбxo-димocть учёта квaнтoвыx эффeктoв в нeбoльшиx квaнтoвыx aнcaмбляx, указывал на вaжнocть пoнимaния мoлeкyля pнo-биoлoгичecкиx явлєний. Бoльшиe нaдeжды Фейнман вoзлaгaл на xимичecкий cинтeз, oтмeчaя пpи
этом, что затоны физики нє зaпpe-щают кoнcтpyиpoвaниe на aтoмнo-мoлeкyля pнoм ypoвнe [10].
В нacтoящee вpeмя пoд нaнoтexнo-лoгиями пoдpaзyмeвaeтcя кoнcтpyи-poвaниe мoлeкyл или частиц paзмe-poм oт 10-9 дo 10-6 м. Taкoвы paзмe-pbi бeлкoв, ДНК и РНК, антител, виpy-coв. Бaктepии и клєтки чeлoвeкa (зoнa 10-6 - 10-3 м) нє oтнocя тcя к нaнoчa-cтицaм. Этo микpoмиp. Haнoбиoтex-нoлoгии пpeдпoлaгaют кoнcтpyиpoвa-ние, а не бaнaльнoe пpимeнeниe пepe-чи^леннь^ мoлeкyл и чacтиц [10-12].
Haнoбиoтexнoлoгия, как её oпpe-деляет ^вет РАН пo нaнoтexнoлo-гия м, — это кoнcтpyиpoвaниe нoвыx мaтepиaлoв и ycтpoйcтв на ocнoвe ecтecтвeнныx или cинтeтичecкиx ма-кpoмoлeкyл, кoнcтpyиpoвaниe нoвыx биoлoгичecкиx cтpyктyp на ocнoвe cинтeтичecкиx биoпoлимepoв. Moлe-куля pныe биoлoги имеют дeлo c o6^ ектами пopядкa нecкoлькиx нaнoмe-тpoв: вce виpycы, белки, pибocoмы, мoлeкyлы ДНК и РНК топадают в этoт paзмep. Академик В.В. Вла^в o^ метил, чтo «paбoтaя c нyклeинoвыми киcлoтaми и белками, мы вceгдa, пo cyти, занимали^ нaнoбиoтexнoлoги-ей, тoлькo не иcпoльзoвaли этoт не-дaвнo пoявившийcя тepмин. Haвepнoe, пpaвильнo будет cкaзaть, что тока мы на дaнныx oбъeктax зaнимaeмcя фундаментальными иccлeдoвaния ми (это называется мoлeкyля pнoй бто-лoгиeй), нo ecли иccлeдoвaния opиeн-тиpoвaны на пoлyчeниe кoнкpeтнoгo peзyльтaтa, на издание тexнoлoгии, тo этo нaнoтexнoлoгия»> [14].
Moлeкyля pнo-биoлoгичecкиe o6^ екты oблaдaют pядoм зaмeчaтeльныx cвoйcтв. Bo-пepвыx, oни cпocoбны из-биpaтeльнo взaимoдeйcтвoвaть дpyг
c дpyгoм; нaпpимep, белки oблaдaют cпocoбнocтью cвя зывaтьcя c дpyгими oпpeдeлёнными белками и opгaничe-cкими мoлeкyлaми. Bceм извecтнo,
что две цеточки ДНК oбpaзyют дву-cпиpaльнyю cтpyктypy. Mexaнизм из-биpaтeльнoгo взaимoдeйcтвия биoмo-лекул pacшифpoвaн, мoлeкyлы эти мoжнo пoлyчaть в бoльшиx толиче-cтвax биoтexнoлoгичecкими мeтoдaми и на иx ocнoвe coздaвaть нoвыe мате-pиaлы. В cтpyктype этиx мaтepиaлoв мoгyт быть вмoнтиpoвaны c выcoкoй cтeпeнью yпopя дoчeннocти любые вещества и нaнooбъeкты, нaпpимep, мeтaлличecкиe нaнoчacтицы.
Haнoбиoтexнoлoгии мoжнo пpимe-нять не тoлькo для издания нoвыx мaтepиaлoв. На ocнoвe биoмoлeкyл вoзмoжнo coздaниe «биoмaшин», paз-личныx ycтpoйcтв и ceнcopoв. В oблa-cти paзpaбoтки мoлeкyля pныx машин aктивнo вeдyтcя иccлeдoвaтeльcкиє paбoты. Дoкaзaнo, чтo мoжнo cдeлaть движyщиcя нaнocтpyктypы, «ша-
гающие poбoты», выпoлнeнныe из мo-лекул ДНК. Они cпocoбны двигaтьcя в oпpeдeлённoм нaпpaвлeнии то мo-лекуле ДНК пpи тодведении к ним энepгии. Чтo кacaeтcя нaнoceнcopoв (HK-зaвиcимыx пepeключaтeлeй, мo-лекуляpныx ceнcopoв, ceнcopoв на ocнoвe гибpидныx кoнcтpyкций, тото-pыe cocтoят из нyклeинoвыx киcлoт и белка), oни уже нaxoдя т шиpoкoe пpи-менение в мoлeкyля pнoй диaгнocтикe. Coздaнo мнoжecтвo диaгнocтичecкиx cиcтeм для медицины, ocнoвaнныx на oлигoнyклeoтидax, caмocoбиpaю-щиxcя в кoмплeкc на aнaлизиpyeмoй ДНК, пoлyчeны патенты на такие га-cтeмы и ДНК-чипы. Рaзpaбoтaны на-нopaзмepныe нeopгaничecкиe CTpy^y-pы — «квaнтoвыe капли», кoтopыe за cчёт квaнтoвыx эффeктoв oкpaшeны в paзличный цвет и иcпoльзyютcя как cпeктpaльныe метки для диaгнocтичe-cкиx cиcтeм.
Рaзpaбoтaны opигинaльныe биo-ceнcopы для визуализации oпpeдe-лённыx виpycныx РНК. Пpeимyщecт-
вами новых нанобиосенсоров вл -ютс : селективность по отношению к РНК; высокая чувствительность; стабильность биосенсоров in vitro и in vivo. Крайне важными направленими вл етс создание из ДНК новых материалов, различных двухмерных и трёхмерных структур. На их основе могут быть получены совершенно новые материалы дл электроники. Ведутс работы по получению химически модифицированных нуклеиновых кислот, которые необходимы для получени таких материалов.
Важнейшей задачей нанобиотехнологии вл етс создание средств доставки терапевтических препаратов в определённые виды клеток. В частности, необходимо создание методов введени в клетки ДНК и РНК дл развити генотерапии. В этом отношении разработаны новые подходы к доставке РНК и ДНК, основанные на биотехнологических подходах. Дл стимул ции св зывани нуклеиновых кислот с клетками предложено формировать из них комплексы, пред-ставл ющие собой наноразмерные частицы. Такие частицы формиру-ютс за счёт нековалентных взаимодействий нуклеиновых кислот между собой и катионными полимерами. Частицы эффективно связываются с клеточной поверхностью, что способствует их успешному поглощению клеткой. Эти исследования открывают возможность создания действенных методов генотерапии.
Одним из развитых направлений нанотехнологий вл ютс биочипо-вые технологии, без которых современная биология и медицина уже не могут существовать. Биочиповая технологи — современна нанотехнологи анализа генетического материала, позволя ющая проводить скрининг сложных смесей нуклеиновых кислот. Это индустри высоких технологий, базирующа с на современных достижениях химии, биологии, физики, микроэлектроники, информатики и
других отраслей знаний. Биочип пред-ставля ет собой пластинку, несущую на своей поверхности множество различных зондов — фрагментов нуклеиновых кислот или олигонуклеотидов, размещённых в определённом пор д-ке. С помощью такого чипа можно наблюдать за структурой (геномика) и функционированием (функциональна геномика) всех генов в организме человека — всё это уже делается в лаборатори х. Практически дл медицинских целей необходимы упрощённые варианты чипов: дл обнаружения разных вирусов и патогенных микроорганизмов [10, 13].
По прогнозу национального фонда науки США к 2015 г. годовой оборот рынка наноиндустрии достигнет 1 трлн долл.
В насто щее врем провод тс
интенсивные исследовани в области разработки пищевых нанотехнологий по следующим основным направлениям: производство наночастиц, нанонитей и нанокапсул, нанокомпозиций дл пищевых продуктов заданного состава с необходимыми органолептическими показателя ми, новых упаковочных материалов с использованием нанотехнологий, обеспечивающих высокую сохран емость и безопасность готового продукта. На россий-ком рынке представлены разработки в виде незагр зн ющихс тканей и упаковок, позволяющих дольше со-хран ть исходные качества с.-х. продукции.
Перспективным направлением в-ляется использование фильтров и мембран на основе наноматериалов для очистки воды, соков, пива, вина и воздуха, опреснения морской воды. Наноагрегаты серебра используют в элементах дл изготовлени бактерицидных фильтров.
В растениеводстве применение нанопрепаратов, совмещённых с бакте-риородопсином, обеспечивает повышение урожайности в 1,52 раза и устойчивости к неблагопри тным усло-
ви м почти всех продовольственных (картофель, зерновые, овощные, плодово- годные) и технических (хлопок, лён) культур. Нанотехнологии примен ютс в послеуборочной обработке подсолнечника, табака и картофеля , а также при хранении овощей и фруктов в регулируемой газовой среде [14].
РНК-маркёры на основе наноколоний
Около 15 лет назад в Интитуте белка РАН А.Б. Четвериным с сотрудниками экспериментально была показана способность молекул РНК формировать молекул рные колонии на гел х или других твёрдых средах, если на этих средах им были предоставлены услови дл репликации (все четыре рибонуклеотидтрифосфа-та, катионы магния (М£++) и фермент РНК-зависима РНК-полимераза).
Дальнейшие исследования этой же группы исследователей показали, что молекулы РНК при столкновении в водной среде могут спонтанно обмениваться частями, т.е. обладают способностью к неэнзиматической рекомбинации. Возможность легкого распространени молекул РНК через среду, в т.ч. атмосферную, также была продемонстрирована в пр мых экспериментах [2].
В теоретическом отношении это открытие в контексте мировой научной концепции о рибозимах («РНК-мир») способствует возможности в корне пересмотреть теорию происхождения жизни на Земле. Смешанные колонии РНК на твёрдых или полутвёрдых но-сител х могли быть первыми эволю-цинизирующими бесклеточными ансамбля ми, где одни молекулы выпол-ня ли генетические ф ункции (репликацию молекул РНК всего ансамбл ), а другие формировали необходимые дл успешного существовани структуры (например, такие, которые адсорбировали нужные вещества из окружающей среды) или были рибозимами,
ответственными за синтез и подготовку субстратов дл синтеза РНК. Эта коммунальная форма существования мира РНК — своего рода «Сол рис»
С. Лема — должна была очень быстро эволюционировать. В ходе этой молекул рной эволюции первую функцию РНК передала ДНК, а вторую — белкам. Что же стало с РНК после распада коммуны?
Хотя коммуна распалась, мир РНК сохранился в каждой клетке каждого живого организма. Основой современной жизни я вля ется наследуемый биосинтез белков, который определя -ет все признаки ныне существующих организмов. В качестве центрального звена этого процесса биосинтеза белков выступает совокупность взаимодействующих друг с другом молекул РНК различных типов, прежде всего рибосомной РНК, формирующей аппарат белкового синтеза, тРНК, доставл ющей в рибосому активированные аминокислоты дл построения полипептидных цепей белков, и мРНК, несущей в своей нуклеотидной последовательности программу дл синтеза белка. Кроме этих трёх основных представителей внутриклеточного мира РНК обнаружен целый р д некодирующих РНК (нкРНК).
Оказалось, что нкРНК выполня ют множество функций с использованием не известных ранее механизмов: нкРНК участвуют в регул ции транскрипции генов, сплайсинге и регуля -ции деградации РНК. Они вовлечены в трансля цию и её регуля цию, в процессинг и модификацию рибосомной РНК, в защиту от вирусных инфекций и мутагенной активности мобильных генетических элементов, а также в р д других процессов. РНК вно потеснили белки на пьедестале главных молекул, обеспечивающих жизнедея -тельность клеток [15].
Можно сказать, что совокупность молекул РНК — мир РНК — по-прежнему составляет ядро жизни. Современная жизнь — это РНК,
передавша часть свих генетических функций рождённому ею же полимеру — ДНК и синтезирующа белки дл всеобъемлющего эффективного функционирования содержащих её компонентов — клеток и многоклеточных организмов.
С практической стороны наноколонии РНК в насто щее врем состав-л ют один из классов РНК-маркёров. Так как практически каждая наноко-лони происходит из одной матричной молекулы, с помощью наноколоний можно обнаружить и иденти-фировать одиночные молекулы ДНК и РНК, в т.ч. — с диагностическими цел ми. В насто щее врем наноколонии примен ютс в нашей стране и за рубежом для различных научных и прикладных задач. Важнейшим направлением исследований вл етс разработка ранней диагностики онко-лологических заболеваний.
В России от разных видов рака умирает около 300 000 человек в год, что представл ет большую демографическую, экономическую, социальную проблему. Лечение осложняется тем, что у большинства больных болезнь диагностируется уже на поздних стадия х [16]. С развитием экономики проблема может только усугубляться , так как частота онкологических заболеваний растёт по мере ухудшени экологической обстановки и увеличения продолжительности жизни населения. Эффективность ле-чени рака зависит от своевременности диагностики. Однако до сих пор проблема ранней диагностики рака не решена.
Наноколонии РНК позвол ют создать технологию молекул рной диагностики рака на стадии, когда его ещё невозможно обнаружить существующими методами. Диагностировать болезнь предполагаетс путём обнаружения в клинических образцах (например, в крови, в моче или в мокроте) молекул определённых индикаторных («маркёрных») РНК,
которые присутствуют во всех раковых клетках независимо от вида рака. Примером такого универсального маркёра вл етс мРНК белковой субъединицы теломеразы — фермента, отвечающего за синтез концевых участков хромосом (теломер). Эта мРНК присутствует и в нормальных стволовых клетках, которые, подобно раковым клеткам, способны к неограниченному делению. Однако в отличие от раковых клеток стволовые клетки наход тс в своих нишах и не распространяются по организму. Поэтому присутствие теломераз-ной мРНК там, где стволовых клеток быть не должно (например, в плазме или в клетках крови), может служить указанием на наличие злокачественного процесса. Существуют также РНК, которые могут служить групповыми маркёрами всех видов рака кишечника, молочной железы, печени. Попытки использовать РНК-маркёры дл молекул рной диагностики рака были и раньше, но из-за ограниченной чувствительности и недостаточной специфичности стандартной ПЦР (полимеразной цепной реакции) они закончились неудачей.
Следует отметить исключительно высокий потенциал наноколоний дл диагностики любых заболеваний, дл которых существуют РНК- или ДНК-маркёры, в т.ч. инфекционных и генетических, а также мониторинга окружающей среды, решения задач судебной медицины, обнаружения
следовых количеств генетически модифицированных организмов. Более того, наноколонии могут быть использованы для детекции молекул, отличных от РНК или ДНК. Например, молекула белка (в т.ч. белка-маркёра рака) может быть обнаружена путём размножения суррогатной ДНК-мишени, образованной лигированием фрагментов ДНК, способных одновременно св зыватьс с данной молекулой белка посредством специфических лигандов (например, антител).
Подобным же образом с помощью наноколоний можно обнаружить одиночные молекулы любого вещества (например, наркотика или допинга), достаточно сложные для формирования на своей поверхности, по крайней мере, двух участков специфического свя зывания лигандов [16].
Золотые наночастицы
для генетико-физиологической диагностики
Во всех описанных направлени х нанобиотехнологических разработок перспективным вл етс использо-
вание коллоидного золота. Золото — один из первых открытых человеком металлов. Первые сведени о коллоидном золоте (КЗ) обнаружены в трактатах китайских, арабских и индийских учёных, которые уже в 111-Х веках синтезировали КЗ и использовали его, в частности, в лечебных цел х. Научное исследование проблем получени и использовани КЗ началось в середине Х1Х века, когда в научную литературу был введён термин «коллоидный раствор». В 1857 г. вышла статья Майкла Фарадея, котора стала основополагающей научной работой, посвящённой изучению способов синтеза и свойств КЗ. В этой статье Фарадей впервые описал агрегацию КЗ в присутствии электролитов, защитный эффект желатины и других высокомолекул рных соединений, свойства тонких плёнок высушенного КЗ. Приготовленные им растворы КЗ хран тс в Лондонском королевском институте до насто ще-го времени [12].
Что такое плазмонный резонанс? Высокая электронная плотность, способность рассеивать и излучать вторичные электроны, характерное поглощение и рассея ние в видимой области светового спектра электромагнитных излучений, интенсивная красная окраска золотосодержащего маркёра позволя ют легко обнаруживать золотые частицы с применени-
ем paзличныx методик иccлeдoвaния (микpocкoпия, фoтoмeтpия, пpoтoч-ная цитoмeтpия и дp.). Kpoмe того, вoзмoжнocть пoлyчeния зoлeй зoлoтa c paзличными paзмepaми частиц и иx узким pacпpeдeлeниeм oбecпeчивaeт выcoкoe paзpeшeниe и пoзвoля ет пpo-вoдить мечение то двум и бoлee антигенам или иным лигандам.
Cpeди нaнopaзмepныx cтpyктyp, фyндaмeнтaльнoe иccлeдoвaниe ад-тopыx ceйчac aктивнo paзвивaeтcя, бoльшoй интepec вызывают класте-pы (oт лат. cluster — гpoздь) — o6-paзoвaния, в кoтopыx чиcлo aтoмoв вapьиpyeт oт единиц дo дecяткoв и coтeн тыcяч. Kлacтepы занимают пpo-мeжyтoчнyю oблacть между oтдeль-ными aтoмaми и твёpдыми телами и cooтвeтcтвeннo пpoявляют cвoйcтвa, oтличныe oт тex и дpyгиx. Физиче-cкиe xapaктepиcтики клacтepoв cy-щecтвeннo зaвиcят oт вида вxoдя rn^x в ниx aтoмoв и иx чиcлa. Cpeди кла-cтepoв пpocтыx вeщecтв ocoбoe мecтo занимают металличежие клacтepы (типичный пpимep — зoлoтыe на-нoчacтицы). Пpиcтaльнoe внимание к ним oбъяcняeтcя, c oднoй cтopoны, ocoбeннocтя ми иx элeктpoннoй струк-тypы, a c дpyгoй — oтнocитeльнoй пpocтoтoй иx пoлyчeния для экcпepи-мeнтaльныx иccлeдoвaний.
Haчaлoм coвpeмeннoгo этапа paз-вития физики мeтaлличecкиx класте-poв мoжнo cчитaть экcпepимeнтaль-нoe oткpытиe у ниx в 1993 г. oбoлoчeч-нoй cтpyктypы aтoмoв. Пpaктичecки oднoвpeмeннo c пepвыми экcпepи-ментальными peзyльтaтaми cyrn;eCT-вoвaниe элeктpoнныx oбoлoчeк в мнo-гoaтoмныx клacтepax былo oпиcaнo тeopeтичecки. В ocнoвy тeopeтичe-cкoгo пoдxoдa былo пoлoжeнo cвoй-cтвo валентные элeктpoнoв металла пoкидaть cвoи атомы (дeлoкaлизoвы-вaтьcя) и oбpaзoвывaть зoнy пpoвo-димocти. Oкaзaлocь, что имeннo эти oбoбщecтвлённыe элeктpoны oтвeтcт-венны за пoдoбнyю энepгeтичecкyю CTpy^ypy клacтepa. Бoлee тoгo, иx
поведение определ ет большинство необычных «коллективных») свойств кластеров.
Делокализованные электроны в металлическом кластере определ ют не только их структуру, но и характер поведени кластера в процессах взаимодействи с внешними пол ми. Так, в результате исследований процессов взаимодействи металлических кластеров с электромагнитным полем, которые интенсивно проводятся в последние годы, было обнаружено, что в спектрах поглощения электромагнитной энергии наблюда-ютс гигантские максимумы — резонансы. Эти резонансы св заны с возбуждением коллективных колебаний электронной системы, аналогичных колебани м электронного газа в плазме и макроскопических металлических телах. Такие колебани нос т названи плазмонных, а резонанс — поверхностным плазмонным резонансом. Причём амплитуда и частотный диапазон плазмонного резонанса в кластерах отличаютс от таковых в макроскопических кристаллах.
Если частицы формируют агрегаты, соответствующий плазмонный пик сдвигаетс в сторону длинных волн или ушир етс в результате диполь-дипольного взаимодействи индуцированных светом дипольных моментов частиц в агрегате. Таким образом, оптические возбуждения в агрегате из металлических наночастиц имеют коллективную природу (делокализованы по многим мономерам). Поэтому полоса поглощени в области плазмонного резонанса электронов проводимости частиц измен етс специфическим
образом. Локальные оптические пол , действующие на металлическую частицу во фрактальном агрегате, могут значительно превышать среднее поле, что приводит к гигантским нелинейным эффектам. Принципиально важно отметить, что на оптический отклик от наночастиц или их агрегатов (особенно упор доченных) су-
щественно влия ют размер и форма частиц, межчастичное расстояние, а также свойства их локального диэлектрического окружения . Это даёт возможность управлять «настройкой») сенсоров [12].
Как используетс коллоидное золото в целях диагностики? В России нанобиотехнологи на основе коллоидного золота развиваетс в основном в институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (г. Саратов) и Саратовском государственном университете, где была разработана технологи синтеза золотых наносфер с диаметром от 3 до 100 нм и их функционализаци биоспеци-
фическими макромолекулами, защищённая патентом РФ (№2013374). Номенклатура биомолекул-зондов, используемых дл синтеза маркеров, включает антитела и миниантитела, однонитевые нуклеотиды, ферменты, лектины, биотин и биотинилирован-ные производные биомолекул.
Конъюгаты наночастиц коллоидного золота с биоспецифическими макромолекулами широко примен ютс в иммунохимических исследовани х с использованием световой и электронной микроскопии, твёрдофазного иммуноанализа. Благодар своим свойствам препараты коллоидного золота превосход т аналоги (конъюгаты с ферментными, изотопными, флуоресцентными метками) по чувствительности, простоте, быстроте и стоимости. В последние годы наблюдаетс я вный «бум»> в количестве публикаций по использованию металлических наночастиц (прежде всего золота и серебра) дл детекции биоспецифических межмолекулярных взаимодействий, в т.ч. в различных устройствах типа биочипов и биосенсоров [12, 16].
На пути к широкомасштабному использованию РНК-маркёров в растениеводстве. Особую актуальность методы и подходы нанонауки приобрели в познании механизмов регул -ции генной экспрессии у растений,
что является одной из центральных проблем современной молекулярной биологии. От состояния изученности этой проблемы зависят успехи использования достижений молекуля р-ной биологии (различного рода молекуля рные маркеры, трансгенные растения ) в решении важнейших задач растениеводства.
Однако до 90-х годов XX века результаты исследований здесь были достаточно скромными. Причина тому — сложность систем регуляции у эукариот и недостаток модельных объектов, изучение которых позволило бы эффективно разобраться в принципах саморегул ции растительного организма. Но в конце прошлого столетия был открыт ряд я влений, не только позволивших продвинутьс в понимании этих проблем, но и сделавших возможным применение на практике знаний о механизмах регу-ля ции экспрессии генов. Все эти я вле-ни были св заны с посттранскрип-ционной регул цией экспрессии генов эукариот на уровне регул ции времени жизни (стабильности) РНК клетки.
Рибонуклеиновые кислоты явля-ются центральным звеном живой материи, так как обладают свойствами матрицы, подобно ДНК, и ферментативными свойствами, подобно белкам-энзимам (рибозимы). Эти особенности в значительной степени определ ют-ся наличием (до 4-6%) в составе молекул РНК катионов магния (Mg++), т.е. реально РНК существует в клетке только в виде магниевой соли рибонуклеиновой кислоты. Катионы магни вл ютс структурообразующими
ионами и в то же время факторами, определ ющими рибозимные свойства РНК [4, 5].
В основу наших исследований положено я вление генетико-физиологической детерминации магнийзависи-мого распада мРНК злаков in vitro — система ommp, которая я вля ется оригинальной разработкой лаборатории молекул рной биологии Краснодар-
ского НИИСХ имени П.П. Лукья нен-ко. Система ommp — это простейшая система in vitro, адекватно отража-юща относительную стабильность
мРНК в живой клетке (in vivo) и состоя щая только из трех компонентов: РНК + вода + Mg++. Как известно, РНК в клетке находитс в виде магниевой соли и содержит до 5% магния (Mg++). Если РНК выделять из растительной ткани в присутствии катионов магни и в услови х, способствующих сохранению этих катионов в составе молекулы РНК, то распад последней в системе ommp происходит аналогично соответствующему процессу in vivo и отражает особенности взаимодействи генотип - среда. На протяжении последних сорока лет многие исследователи отмечали способность выделенной из клетки РНК разрушатьс в присутствии катионов металлов. Но от внимани исследователей ускользал тот факт, что разрушение происходит по тем же законам, что и в живой клетке, отражая генетические особенности и физиологическое состоя ние организма [17].
Основным результатом селекции вл етс изменение нормы реакции организма на факторы окружающей среды. Исследование молекул рно-биологических закономерностей фор-мировани эффекта взаимодействи генотип - среда наиболее целесообразно на основе изучени центрального и самого лабильного компонента посттранскрипционной регул ции экспрессии генов — дифференциальной стабильности мРНК различных генов растений и её вариабельности в зависимости от условий окружающей среды с использованием системы ommp, позвол ющей относительно просто in vitro оценивать время полужизни мРНК и пределы её изменчивости. Однако относительна простота метода ommp-системы существенно обесценивается сложностью существующих методов детекции количества ген-специфических мРНК (дот-блот,
Норзерн-блот, количественный ОТ-ПЦР), что я вля ется фактором, ограничивающим развитие исследований в этом направлении. Поэтому имеет принципиальное значение использование для этой цели возможностей, предоставляемых нанобиотехнологией. Достижения в этой области науки уже в настоя щее время позволя ют ставить вопрос о разработке простого, оперативного и высокочувствительного количественного метода определения ген-специфических мРНК растений, основанного на использовании конъюгатов коллоидного золота (КЗ) с ген-специфическими олигодезокси-рибонуклеотидными зондами (оДНК).
В 1996 г. группой американских исследователей [18] был предложен принцип создани конъюгатов наночастиц коллоидного золота (КЗ) с ген-специфическими олигодезоксири-бонуклеотидами (оДНК), несущими на одном из своих концов БН-группы, способные взаимодействовать с золотыми наночастицами (БН-оДНК) с образованием своеобразных молекул р-ных ежей. Применение смеси двух или трёх типов подобных ежей, различающихся специфическими БН-оДНК, комплементарными к разным част м определённой мишени молекулы ДНК, приводит к формированию упорядоченной пространственной структуры в растворе, содержащем все перечисленные компоненты. Это определяет изменение оптических свойств наночастиц коллоидного золота в видимой части спектра (530 нм).
Мы применили этот принцип для оценки количества ген-специфических мРНК. В этих цел х использовали модельную систему на основе мутации регуляторного гена opaque-2, глобально снижающей содержание мРНК запасного белка (зеин 22 кДа) в зерне кукурузы линии Висконсин 64А (около 5% от уровня содержа-ни этой мРНК в зерне кукурузы дикого типа). Дл получени конъюга-
тов КЗ-БИ-оДНК использовали золи КЗ с диаметром частиц 15 нм и три различных 20-звенных тиолирован-ных оДНК (фирма Syntol, Москва), специфичных к трём определенным участкам молекулы мРНК зеина 22 кДа. Смесь равных количеств суммарной высокополимерной РНК из созревающего зерна (20-е сутки после опыления) обычной или opaque-2 кукурузы и конъюгатов КЗ^Н-оДНК инкубировали при $10°С, а затем после оттаивания, изучали зависимость экстинкции при длине волны 530 нм от количества добавл емой РНК. Метод позволял получить хорошее совпадение в оценке количества мРНК зеина 22 кДа в РНК из зерна opaque-2 кукурузы, но «зашкаливал» при применении в исследовании аналогичных количеств суммарной высокополимерной РНК из созревающего зерна обычной кукурузы, что доказывало специфичность метода [19, 20].
Также получена хорошая количественная зависимость содержания в растворе полиадениловой кислоты при гибридизации с КЗ^Н-олиго(дТ). Был синтезирован маркер КЗ-15-Т28 — комплекс наночастиц коллоидного золота (средний диаметр 15 нм) с тиол-модифицированными олиготимидино-выми молекулами (зондами), содержащими 28 нуклеотидов. Описан принцип спектрофотометрического
контрол всех этапов приготовлени маркера и применени спектров поглощения в УФ и видимой областя х дл вы влени реакции гибридизации in vitro.
В частности, показано, что величины поглощени нуклеиновых кислот и наночастиц золота в составе маркера складываютс не аддитивно и в области поглощени нуклеотидов (260 нм), и в области плазмон-ного резонанса коллоидного золота (520 нм). Число олигонуклеотидов, химически св заных с одной наночастицей золота (=140), оценено по
б7
данным спектрального анализа маркера и супернатанта промежуточного продукта. Синтетический маркер специфически окрашивал молекулы-мишени полиадениловой кислоты в дот-гибридизации на мембранном фильтре, но не окрашивал контрольные молекулы полиуридиловой кислоты. При гибридизации маркера с контролем и молекулами-мишенями в растворе спектральные изменения не зарегистрированы.
Применение циклов заморажива-
ния
оттаивания показало наличие
изменений в плазмонном резонансе маркера в присутствии молекул по-лиадениловой кислоты. Эти эффекты объяснены в рамках агрегационной модели, отличной от модели перекрёстных сшивок [21, 22]. Важно отметить, что полиадениловая кислота играет центральную роль в посттран-скрипционной регуляции экспрессии генов, так как вариация длины по-лиадениловой последовательности
на З'-конце молекулы мРНК определяет как её стабильность, так и её трансляционную активность под влиянием изменяющихся факторов среды [4, 5, 6].
Таким образом, нами были получены принципиальные доказательства того, что колориметрический метод с применением наночастиц КЗ-БН-оДНК позволяет оценить количество ген-специфической мРНК в препарате суммарной высокополимерной РНК с чувствительностью, близкой к чувствительности радиоизотопного метода, без синтеза комплементарной ДНК в отличие от метода ОТ-ПЦР, что делает оценку количества индивидуальной мРНК более простой и более дешёвой [22].
Комбинация этого метода с методом ПЦР позволяет резко снизить стоимость анализа методом ПЦР в целях диагностики, так как позволяет оценить количество ампликонов уже после первого (из 25-30) цикла ПЦР при помощи соответствующих конъю-
гатов коллоидного золота [23]. Кроме того, чувствительность (эффективность) самого метода ПЦР может быть резко увеличена (до 10 000 раз) при помощи коллоидного золота, снижающего неспецифическое взаимодействие праймеров-нуклеотидов [25].
В мировой науке высокая чувствительность и селективность молекулярного узнавания, основанная на комплементарных ДНК-ДНК, ДНК-РНК взаимодействиях в совокупности с уникальными оптическими свойствами плазмонно-резонансных наночастиц коллоидных систем благородных металлов, положили начало созданию нового раздела междисциплинарной науки — молекулярной нанотехнологии [24, 25, 26].
Существенный интерес представляет способность одноцепочечных нуклеиновых кислот (преимущественно РНК) предотвращать агрегацию золотых нефункционализированных наночастиц. Это происходит, вероятно, за счёт электростатических взаимодействий между отрицательно заряженными фосфатными группировками нуклеиновых кислот и высокополяри-зованными золотыми наночастицами, что является перспективным в исследовании экспрессии генов и разработки на этой основе новых методов диагностики биологических свойств организмов [27]. Кроме того, наночастицы коллоидного золота могут быть функ-ционализированы на специфическое взаимодействие с определенными катионами, что существенно упрощает методики определения их количества в аналитических пробах [28, 29].
Заключение
На многих объектах показано, что переход от макро- к наноразмерам приводит к появлению качественных изменений физико-химических свойств различных соединений и получению на их основе наносистем. На рубеже ХХ и ХХ1 веков мы являемся свидетелями и
участниками формирования и развития развитие нанонауки отвечает современ-
новой области знаний — нанонауки. ному развитию естествознания.
Нанонаука состоит из нескольких Важно отметить ещё одну особен-
отдельных самостоятельных направле- ность, связанную с развитием нанонау-
ний. Как часто это бывает, выражена ки, — её междисциплинарность. Здесь
тенденция рассматривать раздельно тесно переплетаются интересы, под-
фундаментальные и прикладные на- ходы и методы исследований физики,
правления. Однако современные темпы химии, биологии и материаловедения.
развития научных исследований прак- Успешное развитие различных направ-
тически стирают грани и сроки между лений нанонауки в условиях подобной
открытием новых явлений и их прак- многоплановости предполагает органи-
тическим использованием. Фундамен- зацию сотрудничества учёных разных
тальные исследования должны быть специальностей в рамках единой общей
направлены на решение определённых задачи или программы. Междисципли-
практических задач. Одновременно со- нарность нанонауки требует изменения
вершенно ясно и другое: конкретные и совершенствования обучения и подго-
прикладные применения невозможны товки специалистов для работы в новом
без серьёзных и глубоких, чисто на- направлении, которое будет определять
учных исследований. Возникновение и развитие естествознания в XXI веке.
Библиографический список
1. Watson J.D. A structure of deoxyribose nucleic acids / J.D. Watson, F.H.C. Crick // Nature, 1953. V. 171. P. 737-738.
2. Спирин A.C. Рибонуклеиновые кислоты как центральное звено живой материи // Вестник Российской академии наук, 2003. Т. 73. № 2. С. 117-127.
3. Киселёв Л.Л. Молекулярная биология от 1970 до 2000 и дальше // Биоорганиче-ская химия, 2000. Т. 26. № 10. С. 767-771.
4. Плотников, В.К. Закономерный распад РНК in vivo и in vitro — основа новых методов биотехнологии // Наука Кубани, 2007. № 4. С. 4-15.
5. Плотников В.К. Генетический контроль и экологическая обусловленность стабильности мРНК в клетках эукариот // Известия ТСХА, 2007. Вып. 5. С. 110-119.
6. Патрушев Л.И. Экспрессия генов / Л.И. Патрушев. М.: Наука, 2000.
7. Плотников В.К. Сорт озимой пшеницы Краснодарская 39 — источник открытий в молекулярной биологии растений // Пшеница и тритикале: Сб. науч. ст. Краснодар, 2001. С. 611-616.
8. Плотников В.К. Интегральная молекулярная биология — новая ступень познания явлений жизни // Эволюция научных технологий в растениеводстве: Сб. науч. ст. Краснодар, 2004. Т. 3. С. 22-28.
9. Taniguchi N. On the basic concept of nanotechnology // Proc. Intern. Conf. Eng. Tokyo: Jap.Soc.Prec.Eng, 1974. P. II. P. 18-23.
10. Глазка В.И.,Белопухов С.Л. Нанотехнологии и наноматериалы в сельском хозяйстве / Под ред. чл.-корр. РАСХН В.М. Баутина. М.: Изд-во РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева, 2008.
11. Сергеев Г.Б. Нанохимия / Г.Б. Сергеев. М.: Изд-во МГУ, 2003.
12. Дыкман Л.А. Золотые наночастицы / Л.А. Дыкман, В.А. Богатырёв, С.Ю. Щёголев, Н.Г. Хлебцов. М.: Наука, 2008.
13. Нанонаука в Сибири: наноматериалы, наноэлектроника и нанобиотехнологии [электронный ресурс]: режим доступа: http: //www.nanoware.ru/forum/ showthread.php? = 165.
14. Нанобиотехнологии в сельском хозяйстве [электронный ресурс]: режим доступа: http://www.proovosh.my1.ru/news/2008-03-01-2.
15. Макарова Ю.А. Некодирующие РНК / Ю.А. Макарова, Д.А. Крамеров // Биохимия, 2007. Т. 72. № 11. С. 1427-1447.
16. Нанобиотехнологии в России (редакционная статья) // Российские нанотехнологии, 2008. Т. 3. № 3-4. С. 29-53.
17. Плотников В.К. Генетико-физиологическая детерминация распада мРНК злаков in vitro // Успехи современной биологии, 2003. Т. 123. Вып. 1. С. 98-109.
18. Mirkin Ch.A. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials / Ch. A. Mirkin, R.L. Letsinger, R.C. Mucic, J.J. Storhoff // Nature, 1996. V. 382. P. 607-609.
19. Богатырев В.А. Метод дифференциальной спектроскопии рассеянного света для исследования биоспецифических реакций в системах конъюгатов золотых наночастиц с белками или олигонуклеотидами / В.А. Богатырев, Л.А. Дыкман, Я.М. Краснов, В.К. Плотников, Н.Г. Хлебцов // Коллоидный журнал, 2002. Т. 64. № 6. С. 745-755.
20. Плотников В.К. Колориметрическая оценка количества мРНК зеинов созревающего зерна кукурузы при помощи конъюгатов коллоидного золота с ген-специфическими олигодезоксирибонуклеотидами / В.К. Плотников, В.А. Богатырёв, Л.А. Дыкман, Н.Г. Хлебцов, О.И. Соколов // Материалы V съезда общества физиологов растений России и международной конференции «Физиология растений — основа фитобиотехнологии». Пенза, 2003. С. 469-470.
21. Богатырев В.А. Оптические свойства конъюгатов коллоидного золота с олиго-тимидином и их изменение при реакции гибридизации с полиадениловой кислотой /
B.А. Богатырев, Л.А. Дыкман, Б.Н. Хлебцов, В.К. Плотников, Н.Г. Хлебцов // Коллоидный журнал, 2005. Т. 67. № 4. С. 413-421.
22. Богатырёв В.А. Нанобиотехнологический метод оценки количества ген-специфической мРНК / В.А. Богатырёв, Л.А. Дыкман, Я.Ю. Евтушенко, В.К. Плотников, Н.Г Хлебцов // Материалы IV съезда общества биохимиков и молекулярных биологов России. Новосибирск, 2008.
23. Doria G. Nanodiagnostics: fast colorimetric method for single nucleotide polymorfism/mutation detection//mutation detection / G. Doria, R. Franco, P. Baptista // IET Nanobiotechnol, 2007. V. 1, № 4. P. 53-57.
24. Baptista P. Gold nanoparticles for the development of clinical diagnosis methods / P. Baptista, E. Pereira, P. Eaton, G. Doria, A. Miranda, I. Gomes, R. Franco // Anal. Bio-anal. Chem, 2008. V. 391. № 3. P. 943-950.
25. Li M. Enhancing the efficienly of a PCR using gold nanoparticles / M. Li, Yu-Ch. Lin, Ch.-Ch. Wu, Hs-Sh. Liu // Nucleic Acids Research, 2005. V. 33. № 21. P. 1-10.
26. Csaki A. DNA-based Molecular Nanotechnology / A. Csaki, G. Maubach,
D. Born, J. Reichert, W. Fritzsche // Singl Mol, 2002. V. 3, № 5-6. P. 275-280.
27. Goto T. Self-assembled spherical aggregates of gold nanoparticles and their network ensembles mediated by metal ion recognition / T. Goto, H. Fujihara // Journal of materials science, 2004. V. 39. P. 2171-2173.
28. He X. Gold Nanoparticle-Based Flourometric and Colorimetric Sensing of Copper (II) Ions / X. He, H. Liu, Y. Li, N. Wang, J. Xiao, X. Xu, D. Zhu // Adv. Mater, 2005. V. 17. P. 2811-2815.
29. Bates A.D. Constraction and Characterization of a Gold Nanoparticle Wire Assembled Using Mg2+-Dependent RNA-RNA Interactions / A.D. Bates, B.P. Callen, J.M. Cooper, R. Cosstick, C. Geary, A. Glidle, L. Jaeger, L. Pearson, M. Proupin-Peres,
C. Xu, R.S. Cumming // Nano Letters, 2006. V. 6. № 3. P. 445-448.
Рецензент — д. с.-х. н. В.И. Глазко
SUMMARY
Nanobiothechnology is a rapidly advancing area of scientific and technological opportunity that applies the tools and processes of nano/micro range to build devices for studying biosystems. The impact of achievements in nanobiotechnology is particularly relevant to biodiagnostics, where nanoparticle-based assay has been developed for specific detection of bioanalytical and clinical interest. A short review o f our own and literature data on synthesis, optical properties, functionalization and applications of plasmon-resonant nanoparticles is given in the article.
Key words: nanobiotechnology, nanoparticles, biodiagnostics, biosystems
Плотников Владимир Константинович — д. б. н., КНИИСХ имени П.П. Лукьяненко. Тел. 222-69-14. Эл. почта: vkpbio@mail.ru .
