CC BY
121
УДК 628.581.13.577.7.15
НАКОПЛЕНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ В ПШЕНИЦЕ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ
СТОЧНЫХ ВОД
© 2002 С.В. Мурзаева
Институт экологии Волжского бассейна РАН, г. Тольятти
Исследовали накопление тяжёлых металлов (ТМ) в зерне пшеницы при воздействии многокомпонентных загрязнителей (промышленных стоков разной степени очистки). Показано, что степень очистки стоков определяет абсолютное содержание токсических металлов: Zn, Cd, ^^ М, ^, Pb и Mn. Увеличение загрязненности зерна ТМ сопровождалось повышением уровня активностей антоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы в листьях и суперок-сиддисмутазы, пероксидазы в корнях проростков. Обнаружено высокое отношение мембранных форм ферментов к цитозольным. Обсуждается мембранотропное воздействие многокомпонентных загрязнителей, опосредованное ТМ (через образование активных форм кислорода), которые индуцировали антиоксидантную защиту в проростках нового поколения пшеницы.
Открытые системы сброса промышленных и бытовых стоков являются многокомпонентными загрязнителями. Проблема оценки токсичности смесей загрязнителей заключается в малой изученности механизмов аддитивного, синергического и конкурентного взаимодействия составляющих вредных веществ [1]. Разнообразный состав, химическое взаимодействие и динамика изменений присутствующих компонентов усложняет проблему. Особо опасными токсичными веществами в стоках представляются тяжелые металлы (ТМ) [2]. ТМ способны мета-болизировать в растениях и накапливаться в их биомассе [3]. По пищевым цепям, через растения, они попадают в организм животных и человека, вызывая терратогенное, мутагенное и канцерогенное действие [4].
В литературе обсуждаются вопросы инициирования тяжелыми металлами свободнорадикальных реакций при контакте с биологическими мембранами, приводящие к образованию активных форм кислорода (АФК) [5] и индуцированию окислительных стрессов [6]. В живых организмах существует многоуровневая система защиты от окислительного стресса, включающая специализированные антиоксидантные ферменты и низкомолекулярные антиоксиданты. Ферментные системы супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КАТ) и пероксидазы (ПО)
составляют первую линию защиты от окислительного стресса, регулируя уровень и устраняя излишки АФК [7]. Степень устойчивости и надежности живых систем, их старение в сильной степени зависят от активности антиоксидантных ферментов [8]. Существуют доказательства экспрессии генов СОД, КАТ и других антиоксидантных белков, индуцированных ТМ и АФК - супероксидом кислорода (О-2) и перекисью водорода (Н2О2) [7, 9, 10]. С этой точки зрения, идентификация мишеней воздействия многокомпонентных загрязнителей по изменению активностей защитных антиоксидантных ферментов представляется актуальной задачей для выявления механизмов трансформации ТМ в растениях.
В настоящей работе исследовали накопление ТМ в пшенице под влиянием промышленных стоков разной степени очистки. Проведена оценка изменения генеративной и ферментативной антиоксидантной функций в проростках в зависимости от уровня загрязненности зерна токсичными ТМ.
Методика
Пшеницу (не сортовую) выращивали в вегетационных ящиках при естественном освещении на открытом воздухе. Поливали све-жеотобранными стоками 1-2 раза в неделю (1 л на 10 см2 при плотности посева семян 1
шт на см2). Контрольные варианты поливали отстоянной водопроводной водой. Использовали сточные воды завода производства минеральных удобрений разной степени очистки: А1 - стоки после биологической очистки, А2 - неочищенные стоки и СМ - условно-чистые, содержащие промышленные и бытовые стоки города. Во избежание постороннего увлажнения, ночью и во время дождя, вегетационные сосуды с растениями накрывали пленкой. После созревания урожая, целые растения с корнем отмывали от почвы, высушивали и обмолачивали зерно. В отдельных частях - колосках без зерна, стеблях с листьями, корнях и молотом зерне определяли тяжелые металлы методом атомноадсорбционной спектроскопии [11].
Семена полученного урожая пшеницы проращивали в темноте, в чашках Петри на фильтровальной бумаге по 100 шт в 3-х повторностях . Увлажняли по мере подсыхания дистиллированной водой. Наклюнувшиеся семена выставляли на свет под люминостат-ные лампы (интенсивность 20 Вт м-2) и выращивали, с периодом освещения 12 ч, при температуре 20-270. Прорастание учитывали по количеству наклюнувшихся семян, биомассу - по весу зеленой массы проростков. В гомогенатах растертых листьев, определяли концентрацию хлорофилла по Вернону [12].
Цитозольные и мембранные белки выделяли из листьев и корней проростков. Навеску растительного материала, 2 г, растирали в ступке с жидким азотом в 20 мл среды, содержащей 50 мМ КН2Р04 и 0,5 мМ этилен-диаминтетраацетат (ЭДТА), рН 7,8. Гомогенат листьев или корней фильтровали через четыре слоя капрона и центрифугировали 30 мин при 17000 §. Супернатант использовали для выделения цитозольных, а осадок - для выделения мембранных белков.
Супернатант пропускали через обеззо-ленный бумажный фильтр, растворимые белки из фильтрата осаждали сульфатом аммония до 80 % насыщения, выдерживая сутки в холодильнике. Высоленные белки отделяли центрифугированием 15 мин при 1300 §, растворяли в минимальном объеме среды, содержащей 0,01 М фосфатный буфер, рН 7,8 и
0,1 мМ ЭДТА, затем обессоливали на колонке с сефадексом g-25, уравновешенной 0,05 М Трис - ацетатным буфером, рН 8,0. В полученном элюате определяли активность растворимых цитозольных ферментов.
Мембранные белки получали из осадка ступенчатым экстрагированием, как описано в работе [13]. Первую экстракцию проводили 1 М NaCl, выдерживая раствор 1 ч при 40, непрерывно перемешивая. Экстракт отделяли центрифугированием и обессоливали на колонке с сефадексом g-25, как описано выше. Элюат содержал от 40 до 70 % мембранных ковалентно связанных белков. Оставшийся осадок обрабатывали охлажденным до -180 абсолютным ацетоном (объемное отношение осадка к ацетону І:9), выдерживали, помешивая, 1 ч на ледяной бане, затем после осаждения на центрифуге (режим указан выше), промывали охлажденным 80 % ацетоном до полного удаления пигментов. Ацетоновые экстракты, содержащие растворимые пигменты и липиды, отбрасывали. Оставшийся осадок подсушивали под феном и из него экстрагировали липидорастворимые мембранные белки раствором, содержащим 10 мМ фосфатный буфер и 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,8, непрерывно помешивая 1 ч при 40. Нерастворимую фракцию отделяли центрифугированием и заливали раствором 100 мМ NaOH на 1 ч при 40 для экстрагирования щелочнорастворимых мембранных белков. В результате последовательных трех экстракций удавалось наиболее полно (до 9В %) извлечь труднорастворимые мембранные белки из растений.
В экстрактах, содержащих цитозольные и мембранные белки, определяли содержание белка по методу Бредфорд [14] и активность антиоксидантных ферментов: суперок-сиддисмутазы (СОД), каталазы (КАТ), перок-сидазы (ПО), как описано в работе [15]. За 1 относительную единицу активности СОД принято количество фермента, ингибирующее восстановление нитросинего тетразолия на 50 %, на мг белка в пробе. За единицу активности КАТ (или ПО) принято количество фермента, разрушающего І мкмоль Н2О2 (или ммоль) в мин на мг белка в пробе.
В работе использовали реактивы отече-
ственного производства марки Х.Ч. и О.С.Ч., кроме: НАДН и ЭДТА фирмы "Reanal" (Венгрия), сефадекс g-25 средний и ФМС фирмы "Serva" (Швеция).
Результаты
В пшенице, выращенной при поливе сточными водами А А2 и СМ, определяли девять металлов - Fe, Mn, Cu, Zn, Cr, Co, Ni, Pb и Cd. Все эти элементы присутствуют в сточных водах, сбрасываемых в водохранилище [16]. В табл.1 представлено абсолютное содержание исследуемых элементов и их суммы (ХТМ) в четырех вариантах пшеницы (контроль, А А2, СМ) в целых растениях и в отдельных частях - корнях, зерне, соломе (листья + стебель и колос без зерна). Для удобства сравнения с контролем, увеличение содержания тяжелых металлов в опытных вариантах А1, А2 и СМ выделено в таблице затенением ячеек и жирным шрифтом.
Суммарное содержание элементов в целых растениях пшеницы (ХТМ) соответствует принятой классификации абсолютного содержания металлов в растениях на кг сухой массы [3, 17]: высокие концентрации (выше 100 мг) - Fe, Mn, Zn; средние (1-100 мг) - Cu, Cr,Ni, Co, Pb и низкие (меньше 1 мг)
- Сd, табл. 1. Характер распределения элементов по органам пшеницы акропетальный [3], однако, несмотря на концентрирование ТМ в корнях, они активно переходят в надземные части растений и накапливаются в зерне. Для сравнения показаны ПДК Cu, Zn, Cr, Co, Ni, Pb и Cd, допускаемые ГОСТом в зерне и кормовых [18]. Исходя из норм ПДК, можно сказать, что контрольный вариант зерна пшеницы загрязнен и неудовлетворителен по содержанию Co, Ni, Pb, а соломы - Zn, Cr. Возможно, это было связано с загрязнением почвы, которую использовали для выращивания пшеницы. По данным работы [19] в почвах нашего региона содержание этих металлов, превышает величины кларка.
Сравнивая с контролем, можно видеть, что сточные воды избирательно способствовали накоплению элементов в пшенице (целое растение). Воды А1 снижали на 27-47% содержание Cd, Pb, Co, незначительно уве-
личивали - Fe, Mn, Сг, Щ Общий уровень тяжелых металлов, ХТМ, под действием этих стоков был повышен только на 5 %.
Воды СМ увеличивали накопление Cd, Щ Mn и Си на 6-14 %, концентрации остальных металлов - уменьшали, особенно, Fe и Со (на 22 и 42 %), в итоге сумма элементов была уменьшена на 20 %.
Воды А2 способствовали накоплению всех металлов, кроме Со. Значительно увеличивали содержание Fe и Сг (на 71 и 101%). Общий уровень металлов в растениях возрастал на 67 %. Причиной тому, по-видимому, была большая загрязненность неочищенных стоков, по сравнению с двумя другими, которые частично очищаются [16 с.140].
По суммарному накоплению ТМ целыми растениями, исследуемые варианты пшеницы представляют ряд: А2 > А1 > К > СМ, что показывает зависимость действия стоков от очистки и положительное влияние условно-чистых стоков СМ. Такой же ряд соответствует загрязнению ТМ корней. Однако, при распределении металлов по другим органам пшеницы ряд накопления ХТМ варьирует: в соломе - А2 > А1 > СМ > К, а в зерне - СМ > К
> А2 > А1-
Относительно накопления ТМ зерном, следует отметить, что все стоки способствовали активному транспорту из корней в зерно 2п и Мп. Стоки СМ оказывали заметное действие по продвижению Сг и Fe из корней в зерно. В данном случае превышение по железу в зерне составляло в 1,5 раза, а по хрому в 10 раз по сравнению с контролем, поэтому приоритетными загрязнителями зерна по ХТМ были стоки СМ.
Оценивая фитотоксичность пшеницы в целом, отметим, что в основном, ТМ аккумулируется в корнях и, следовательно, остаются в почве. Определенная часть металлов трансформируется по растению и, в зависимости от метаболизма фотосинтезирующими органами, попадает в стебли, листья и зерно. В итоге, солома (кормовой продукт для скота) обогащена не менее чем 5-7, а зерно - 3-4 аккумулированными элементами. Среди них высоко токсичные - 2п, Cd и токсичные - Си, Сг, Щ Со, РЬ, Мп (классификация токсично-
263
Вариант пшеницы Органы пшеницы Fe Мп Си Zn Cr Со Ni Pb Cd ІГТМ
Контроль корни 4550.8 И 7.3 10.4 44.8 6.1 2.1 9.9 2.63 0.13 4744.16
♦солома 322.3 76.9 7.2 52.9 0,74 1.7 2.5 0.95 0.23 465.42
черно 35.6 44.7 4,3 39,5 0,07 2 Л 2,2 0.71 0.12 129.3
целое растение 4908.7 238.9 21.9 137.2 6,91 5.9 14.6 4.29 0.48 5338.88
Стоки А] корни 4773,3 117.8 10.7 34.8 6.26 2.0 10,1 2.21 0.14 4957,31
солома 415,8 82,3 7,0 46.9 1,08 1.1 3,6 0.69 0.1 558,57
зерно 11.3 48,4 3.1 47,6 н/о н/о 2,5 н/о 0.11 113.01
целое растение 5200,4 248,5 20.8 129.3 7,34 зл 16,2 2.9 0.35 5628,99
Стоки А: корни 7800,4 139,7 13.2 42.2 13,02 3,4 13,7 2,95 0,14 8028,71
солома 606,9 101,4 6,6 52.0 0,89 2,3 3,8 2,62 0.21 776,72
черно 9.7 54,0 4.4 49,5 н/о н/о 2,5 0.54 0,27 120.91
целое растение 8417,0 295,1 24,2 143,7 13,91 5.7 20,0 6,11 0,62 8926,34
Стоки СМ корни 3433.0 132,8 11,8 33.9 5.6 1.0 9.1 1.69 0,21 3629.1
солома 333,3 84,5 8,0 42.3 0,92 1.7 4,3 2,17 0.19 477,38
черно 53,0 55,2 3.6 52,5 0,2 0.7 2.2 н/о 0.11 167,51
целое растение 3819.3 272,5 23,4 128.7 6,72 3,4 15,6 3.86 0,51 4273.99
ГОСТ ПДК для черна. И) 50 0,35 0.06 0.7 0.5 0.1
1986 г
для кормовых * “ 30 50 0.5 - * 3.0 0.5
Биология и экология
Таблица 2. Влияние стоков на генеративную функцию семян пшеницы
Вариант Проросло, % Зеленая часть
Рост, см Биомасса растений, 100 г Хлорофилл, Белок,* мкг на мг сырой массы
Контроль 97 5 4,4 0,95 32
Аі 98 9 7,0 0,95 34
А2 99 7 5,6 0,9 29
СМ 98 8 5,4 1,0 37
Примечание: * - общий белок (мембранные + цитозольные белки). Возраст проростков 9 суток, освещение 20 Вт на м2. Приведены средние данные трех биологических опытов, хлорофилл и белок определяли в каждом опыте в двух аналитических повторностях - отклонение от среднего не превышало ± 5 %.
сти элементов по ГОСТу 1983 [20]). Качественный состав стоков и степень их очистки определяли абсолютное содержание токсикантов в органах пшеницы. Так, стоки А прошедшие биологическую очистку аккумулировали в зерне Мп, Хп и Ші, стоки А2 - Мп, Хп, Ш и Сё, а стоки СМ - Мп, Хп и Сг. Содержание Ші в зерне соответствующих вариантов превышало ПДК в 3,6 , Сё - в 2,7 , а Хп -1,05 раза. В то же время стоки А1 и СМ ограничивали поступление в репродуктивные органы пшеницы Сё, РЬ и Си. В итоге ряд загрязнения зерна токсичными ТМ соответствует степени очистки стоков: А2 > СМ > А1> К и отличается от такового по суммарному накоплению ТМ зерном, где на первое место выходили стоки СМ и кон -троль, а затем уже А2 и А
Пролонгирующее действие ТМ на генеративную функцию полученных семян показано в табл.2. Оказалось, что семена всех четырех вариантов пшеницы при проращивании имели одинаковую энергию прорастания. По скорости роста и наращиванию зеленой биомассы все опытные варианты проростков опережали контроль. Наибольшие показатели по биомассе имели проростки А1. Впрочем, такие же результаты были получены нами при проращивании "родительских" семян в присутствии соответствующих стоков [21]. Следовательно, те изменения, которые произошли на уровне родительских форм под воздействием стоков проявились при генерации нового поколения, но каких-либо новых морфологических отклонений
обнаружено не было.
Проростки практически не различались по биохимическим показателям - содержанию хлорофилла и белка. Незначительные изменения, которые наблюдали, скорее можно расценивать как тенденцию негативного или положительного влияния соответствующих стоков на биохимические синтезы белков и пигментов в пшенице.
Главные и заметные изменения на биохимическом уровне обнаружены в антиокси-дантной защите проростков. Они проявлялись в изменении активностей ферментов СОД, КАТ и ПО. Эти ферменты присутствуют в растительной клетке в мембранах и цитозоле [13, 15, 22]. На рис.1, 2, 3 представлены активности мембранных и цитозольных форм ферментов в листьях и корнях исследу-
400
350
« 300
с;
Ф
ю
250
§
X 200
Л 150
ч:
ш
100
50
Листья
Корни
В □ Ц в
К А1 А2 СМ К А1 А2 СМ
□ цитозоль □ мембраны
Рис. 1. Активность супероксиддисмутазы в проростках пшеницы
0
о
о
ч:
30
25
20
15
10
Листья
Корни
с
ш
ю
го
ч:
о
а.
о
ч:
о
ш
а.
а)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
Листья
Корни
К А1 А2 СМ
К А1 А2 СМ
К А1 А2 СМ
К А1 А2 СМ
□ цитозоль □ мембраны
Рис. 2. Активность каталазы в проростках пшеницы
□ цитозоль □ мембраны
Рис. 3. Активность пероксидазы в проростках пшеницы
емых вариантов проростков пшеницы.
На рис.1. показаны изменения активности СОД. Характерным признаком была буль-шая активность СОД в корнях, по сравнению с листьями (в 2-16 раз) и преобладание активности мембранной формы фермента над цитозольной. В листьях отношение мембранная/цитозольная СОД варьировало в пределе 2,5-9,2 раза, в корнях - 4,2-22,8. Сравнивая с контролем, видно, что стоки А1 повлияли на уменьшение активности фермента в листьях и корнях в 1,3 и 2,3 раза, а А2 - на увеличение - в 1,6 и 1,9 раза, соответственно. Воды СМ уменьшали активность СОД в листьях в 1,3, но увеличивали - в корнях в 3 раза. Увеличения активности связаны, в основном, с мембранной формой фермента.
В отличие от СОД, каталазная активность была выше в листьях, а не в корнях, за исключением контроля, и отмечалось наличие большей доли цитозольной формы фермента, рис.2. Отношение мембранная/цитозольная КАТ было меньше чем для СОД (варьировало в пределе 1,2-2,3), но преобладала также мембранная форма. Увеличение активности КАТ в 1,3 раза происходило только в листьях проростков А2 и оно было связано, в основном, с мембранной формой. В остальных случаях наблюдали уменьшение активности КАТ - незначительное в листьях А1 (в 1,2 раз) и более сильное в корнях
А1, А2 и СМ (в 1,5 - 3 раза).
Общая активность ПО в проростках, также как и СОД, была выше в корнях (в 2-5 раз), по сравнению с листьями, рис.3. Подобно СОД в листьях присутствовала, в основном, мембранная форма фермента и следы цитозольной. В корнях обнаруживали обе формы пероксидазы с преобладанием в 1,4 - 2,6 раза мембранной над цитозольной. Стоки А1 незначительно повышали активность ПО в листьях (в 1,1), А2 - в листьях и корнях (в 1,4 и 1,2, соответственно), а СМ - только в корнях (в 1,3 раза). Стоки СМ способствовали снижению активности фермента в листьях (в 1,2), а стоки А1 - в корнях (в 1,3 раза).
Динамика изменения активностей ферментов в зависимости от стоков, в процентном отношении к контролю, показана в табл.3. Видно, что колебания активности СОД в проростках происходили в пределе от -58 до +265, КАТ - от -67 до +30, а ПО - от -23 до +40 %. Самые большие изменения в активности под влиянием стоков происходили с СОД, особенно в корнях. Ферменты КАТ и ПО испытывали меньшие изменения. Следует также отметить соответствие увеличения или уменьшения активностей всех трех ферментов СОД, КАТ, ПО в листьях и пары СОД, ПО в корнях в зависимости от уровня, присутствующих в зерне токсичных ТМ: А2 > СМ > А1.
5
0
0
Таблица 3. Динамика изменений активностей антиоксидантных ферментов в проростках пшеницы в зависимости от стоков, %
Вариант Листья Корни
СОД КАТ ПО СОД КАТ ПО
Аі -23 -16 + 10 -58 -35 -23
А2 +60 +30 +40 +87 -67 +20
СМ -23 -5 -15 +265 -58 +30
± - увеличение или уменьшение по отношению к контролю.
Обсуждение результатов
Данные, представленные в настоящей работе, показывают, что в присутствии сточных вод пшеница накапливает ТМ. Характер количественных изменений распределения отдельных элементов по органам пшеницы, свидетельствуют о сложных механизмах трансформации загрязнителей в растениях. Возможно, действующим началом поглощения растениями элементов являются неорганические и органические комплексы металлов, содержащиеся в стоках и образующиеся при поступлении в органы растений. Они могли конкурировать между собой и составлять конкуренцию подвижным формам элементов используемой почвы [23-25], что можно проследить по Сй.
Подвижный элемент Сй, проявляющий повышенную мобильность в растениях [4], обнаруживался в значительных количествах во всех органах контрольного варианта пшеницы. Биологически очищенные стоки А1 снижали, а неочищенные стоки А2 и условно-чистые СМ способствовали увеличению этого элемента в целых растениях пшеницы, по сравнению с контролем. Причем, стоки СМ задерживали кадмий в корнях, а стоки А2, напротив, способствовали трансформации токсиканта по растению и накоплению в семенах. По-видимому, в стоках СМ содержались компоненты, способные связывать кадмий и ограничивать его поступление в фотосинтезирующие, а затем в репродуктивные органы растений. Это могли быть основания, сдвигающие рН в щелочную сторону и способствующие осаждению Ме [3, 18, 23]. В действительности, измерение рН стоков во время наших экспериментов показывали более щелочной показатель у СМ (рН 8-9), по
сравнению со стоками А1 и А2 (рН 6-8).
Не следует исключать и конкуренцию между Ме или, образуемыми органическими комплексами с катионами металлов, стабильность которых определяется природой металла [23, 25]. Стоки СМ и А1 задерживали в корнях и листьях не только Сй, но и Си, РЬ, Мп, что уменьшало их накопление в зерне. Следовательно, репродуктивные органы пшеницы были защищены от наиболее активных ТМ, легко реагирующих с физиологически важными веществами. Сй и РЬ - вызывают мутагенез [3, 4], а Си индуцирует оксидазные системы в живых организмах [25]. В итоге, фитотоксиность зерна по загрязнению токсичными ТМ была снижена, по сравнению со стоками А2.
В работе [21] нами было показано, что во время вегетации пшеница в присутствии стоков А2 быстрее проходила все стадии развития, но отставала в росте и имела более ломкий стебель. Кроме того, эти стоки увеличивали долю уродливых растений. Вероятно, это было следствие канцерогенного действия Сй [3,4], которое, как показали данные в настоящей работе, не проявилось при проращивании новых семян. Увеличение в два раза количества этого элемента в зерне варианта А2, не вызывало каких-либо внешних морфологических нарушений в эмбриогенезе. Энергия прорастания и биологическая продуктивнсть (биомасса) проростков увеличивались (см. табл.2) и были сходны тем, что наблюдали у родительских форм [21]. Данные показывают, что при явном отсутствии внешних морфологических нарушений, в пшенице нового поколения на ранней стадии развития происходили изменения на биохимическом уровне - изменялись активнос-
ти антиоксидантных ферментов: СОД, КАТ, ПО. Под действием стоков отмечается увеличение доли мембранных форм ферментов по отношению к цитозольным. Этот факт указывает на мембранотропное последействие стоков.
Увеличение загрязненности зерна токсичными ТМ приводит к повышению уровня антиоксидантной защиты в проростках. Это прослеживается по возрастанию активности трех ферментов СОД-КАТ-ПО в листьях у варианта А2 или пары - СОД-ПО в корнях вариантов А2 и СМ, см. рис.1-3, родительские растения которых имели больший уровень накопления ТМ в соответствующих органах и зерне см табл.1. Напротив, у пшеницы подверженной действию менее загрязненных сточных вод А1 (которые, в дополнение, уменьшали накопление токсичных металлов в зерне), в проростках обнаруживали уменьшение активностей СОД-КАТ-ПО в корнях и СОД-КАТ в листьях.
Функция ферментов СОД, КАТ и ПО связана с утилизацией активных форм кислорода [5]. СОД осуществляет дисмутацию супероксидного радикала (О2-.) до менее токсичной перекиси водорода [5], а Н2О2 удаля -ется каталазой и пероксидазой разными путями [22, 26]. КАТ разрушает избыток образуемой перекиси водорода, а ПО использует НА для окисления широкого спектра веществ, в том числе при детоксикации чужеродных соединений [26, 27]. При оксидазном механизме пероксидазы при определённых условиях могут продуцироваться О2-. и, более токсичный гидроксил радикал (ОН) [28]. Эти формы АФК инактивируют СОД и, особенно, КАТ [29]. Есть сообщения, что и СОД может продуцировать ОН- [25, 29, 30]. Таким образом, СОД и ПО, кроме антиоксидантного, проявляют еще и прооксидативное свойство, что может способствовать развитию окислительных реакций и инициированию окислительного стресса.
Экспериментально, в работе [15], нами было показано, что развитие окислительного стресса в растениях при токсических дозах ксенобиотика сопровождается гиперусилением пероксидазной активности, в 10 и
более раз, на фоне увеличения СОД в 2-3 раза. Растения при этом погибали. В настоящей работе морфологических нарушений в проростках не наблюдали, следовательно окислительный стресс на ранней стадии развития растения не испытывали. Однако индуцирование пары ферментов СОД-ПО и уменьшение каталазной активности свидетельствуют об активно протекающих окислительных реакциях в корнях проростков. Известно, что ферменты СОД и ПО участвуют в детоксикации ксенобиотиков [26, 30]. Возможно, увеличение окислительной активности связано с продолжающимися реакциями инактивирования ТМ, осажденных в виде каких либо хелатов и комплексов в мембранах клеток корней, через окислительные реакции и образование неактивных лигандов [25]. В любом случае это следует расценивать как индукцию прооксидативного действия ферментов СОД-ПО в растительных клетках тяжелыми металлами и возможность усиления окислительной активности в растениях при дальнейшем развитии.
Итак, заключая полученные данные, отметим следующее.
- Многокомпонентные загрязнители -сточные воды, способствуют накоплению ТМ растениями пшеницы, адсорбируя их в зерне.
- В проростках пшеницы семян 1 -го поколения индуцируются активности антиокси-дантных ферментов СОД, КАТ и ПО с высоким отношением мебранные/цитозольные формы.
- Уровень и качественный состав ТМ в зерне определяют мембранотропный уровень антиоксидантной защиты - СОД-КАТ-ПО в новом поколении на ранней стадии развития проростков.
- Увеличение активностей СОД - ПО, на фоне уменьшения каталазной активности, показывают возможность прооксидативного действия антиоксидантных ферментов при токсическом воздействии ТМ.
Остается вопрос о механизме индукции антиоксидантной защиты. Был ли это синтез ферментов de novo, вызванный экспрессией генов в родительских формах растений и пе-
реданный новому поколению, или это активация ферментов, связанная с защитой мембран от ТМ, накопленных зерном и трансформируемых в проростках? Оба эти механизма могут иметь место. Из литературы известно, что индукторами экспрессии генов белков, защищающих от окислительного и других стрессов, являются факторы, вызывающие соответствующий стресс, в том числе АФК (О-2, Н2О2) и ТМ [7, 9, 10]. На наш взгляд, некоторым подтверждением синтеза ферментов de novo, по крайней мере СОД, служит сильная активация этого фермента по сравнению с КАТ и ПО. Если такое происходило у родительских форм, то продуцируемая СОД перекись водорода, не успевая разрушаться, свободно проникала в цитозоль к ядерному матриксу и, как сигнальная молекула, могла индуцировать соответствующие участки в генах [10]. Вызывает интерес закрепления этих признаков - индуцирования антиоксидант-ной защиты, далее в поколениях пшеницы, что безусловно способствует формированию устойчивости растений к загрязнению окружающей среды ТМ. Эти вопросы является предметом наших дальнейших исследований.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Мазухина С.И., Моисеенко Т.И. Моделирование поведения элементов химического состава воды в условиях комплексного загрязнения (на примере оз. Имандра) // Водные ресурсы. 2000. Т.27. №5.
2. Романенко Н.А. Санитарные требования к сельскохозяйственному использованию сточных вод и осадков // Г игиена и санитария. 1986. №7.
3. ПрохороваН.В., Матвеев Н.М., Павловский В.А. Аккумуляция тяжелых металлов дикорастущими и культурными растениями в лесостепном и степном Поволжье. Самара: Самарский университет, 1998.
4. Цинк и кадмий в окружающей среде. М.: Наука, 1992.
5. Фридович И. Радикалы кислорода, пероксид водорода и токсичность кислорода // Свободные радикалы в биологии / Под ред. У! Прайер. М.: Мир, 1979. Т.1. (Free
Radicals in Biology / Edited by William A. Pryor. New York San Francisco. London: Acad. Press, 1976).
6. Inze D., Van Montagu M. Oxidative stress in plants // Current Opin. Biotechnol. 1995. V.5.
7. Лущак В.И. Окислительный стресс и механизмы защиты от него у бактерий (обзор) // Биохимия. 2001. Т.66. Вып.5.
8. АнисимовВ.Н. Современные представления о природе старения // Успехи совр. биол. 2000. Т.120. №2.
9. Турпаев К. Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов // Биохимия. 2002. Т.67. Вып.3.
10. ТарчевскийИ.А. Сигнальные системы клеток растений. М.: Наука, 2002.
11. Методические указания по определению тяжелых металлов в почвах сельхозугодий и продукции растениеводства. М.: ЦИ-НАО, 1989.
12. VernonL.P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts // Analit. Chem. 1960. V.32.
13. Barcelo A.R., MunozR., SabaterF. Subcellular location of basic and acidic soluble isoperoxidase in lupinus // Plant Science. 1989. V63.
14. Bredford M.M. A Rapid and Sensitive Method for Principle of Protein-Dye Binding // Analyt. Biochem. 1976. V.72.
15.Мурзаева С.В. Индуцирование антиок-сидантных ферментов в растениях гороха избытком хлористого аммония // Известия Самарского научного центра РАН. 2000. Т.2. №2.
16. РозенбергГ.С., КраснощековГ.П, Сульди-миров Г.К. Экологические проблемы города Тольятти. Тольятти: Институт экологии Волжского бассейна, 1995.
17. Ильин В.Б. Тяжелые металлы в системе почва-растение. Новосибирск: Наука, 1991.
18. Предельно допустимые концентрации тяжелых металлов и мышьяка в продовольственном сырье и пищевых продуктах. САНПИН 42-123-4089-86 МЗ СССР, 1986.
19. Прохорова Н.В., Матвеев Н.М. Территориальные особенности распределения тяжелых металлов в почвах Самарской области // Известия Самарского научного
центра РАН. 2000. Т. 2. №2.
20. Фирсова В.П., Павлова Т.С., Тощев В.В., Прокопович Е.В. Сравнительное изучение содержания тяжелых металлов в лесных, луговых и пахотных почвах лесостепного Зауралья // Экология. 1997. №2.
21.Мурзаева С.В. Морфометрические и продукционные изменения пшеницы под действием сточных промышленных вод // Продукционный процесс, его моделирование и полевой контроль. Сб. науч. трудов под ред. В.А. Кумакова. Саратов, 1990.
22.Мурзаева С.В., Акулова Е.А. Роль катала-зы и преоксидазы в регуляции фотохимических реакций хлоропластов, связанных с метаболизмом перекиси водорода // Сб. "Механизм фотодыхания и его особенности у растений различных типов" под ред. Ю.С.Карпилова и А.К. Романовой . Пу-щино, 1978.
23. Добровольский В.В. Биосферные циклы тяжелых металлов и регуляторная роль почвы // Почвоведение. 1997. №4.
24.Матвеев Н.М., Павловский В.А., Прохорова Н.В. Экологические основы аккумуляции тяжелых металлов сельскохозяй-
ственными растениями в лесостепном и степном Поволжье. Самара: Самарский университет. 1997.
25. Демидчик В.В., Соколик А.И., Юрин В.М. Токсичность избытка меди и толерантность к нему растений // Успехи соврем. биологии. 2001. Т.121. №5.
26. Gaspar T., Penel C., Thorpe T., Greppin H. Peroxidases / 1970-1980: A Survey of Their Biochemical and Physiological Roles in Higher Plants. Geneve, Centre de Botaique. 1982.
27. Роговин В.В., Муравьев Р.А., Акимов В. С., Бавыкина И.В. Пероксидазосомы растительных клеток // Физиология растений. 1987. Т.34.
28. Yamazaki J. Peroxidase. Molecular Mechanisms of Oxygen Activation. N.Y. London: Acad. Press, 1974.
29. Метелица Д.И., Еремин А.Н. Изменения антиоксидантных свойств полисульфидов замещенных фенолов при их взаимодействии с сывороточным альбумином человека // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т.38. №3.
30. Canada A. T., Calabrese E.J. Superoxide Dismutase: Its Role Xenobiotic Detoxification // Pharmac. Ther. 1989. V.44.
THE ACCUMULATION OF HEAVY METALS AND THE ACTIVITY OF ANTIOXIDATIVE ENZYMES IN WHEAT EXERCISE INFLUENCE OF SEWAGES
© 2002 S.V. Murzaeva
Institute of Ecology of the Volga River Basin of Russian Academy of Sciences, Togliatti
Investigated accumulation of heavy metals in the wheaten grain exercise influence of multicomponent pollutants (industrial sewages differ by degree of cleaning). It is significant, that the degree of clearing of sewages determines the absolute contents of toxic metals: Zn, Cd, Cu, Cr, Ni, Co, Pb and Mn. The increase polluted of a grain by heavy metals was accompanied by increase of a level activity of antioxidative enzymes: a superoxide dismutase, catalase and peroxidase in leaves and superoxide dismutase, peroxidase in the roots of young growth wheat’s. The high relation of the membranous to cytosoling forms of enzymes is revealed. The membranotropism effect of multicomponent pollutants, through action of heavy metals (through formation of the activity forms oxygen), which one induced the antioxidative protection in young growth wheat of a new generation is discussed.
