CC BY
68
Химия растительного сырья. 2010. №3. С. 71-75.
УДК 582.475.4:577.112.34:581.133.8
НАКОПЛЕНИЕ L-АРГИНИНА В ХВОЕ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ ПРИ РЕГУЛЯЦИИ АЗОТНОГО И БОРНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ
© Н.П. Чернобровкина1, Е.В. Робонен1, М.И. ЗайцевО2
1 Институт леса Карельского научного центра РАН, ул. Пушкинская, 11, Петрозаводск, 185910 (Россия) e-mail: chernobrovkina@krc.karelia.ru 2Петрозаводский государственный университет, пр. Ленина, 33,
Петрозаводск, 185910 (Россия)
Изучено содержание общего и белкового азота, свободных аминокислот в хвое сосны обыкновенной в связи с различной обеспеченностью азотом и бором. Установлено стимулирующее влияние бора на накопление L-аргинина в хвое при высоком уровне азотного питания. Предлагается использовать хвою, обогащенную L-аргинином, в качестве сырья для получения этой аминокислоты.
Ключевые слова: Pinus sylvestris (L), азот, бор, аминокислотный состав, аргинин,
Введение
Исследование и целенаправленное изменение химического состава и фармакологических свойств растений позволяют открывать новые сырьевые источники биологически активных веществ (БАВ), используемых для производства лекарственных средств и пищевых добавок. Древесная зелень является источником большого числа БАВ, принадлежащих к разным классам соединений. При этом значительное их количество (до 30%) составляют водорастворимые фракции [1, с. 67]. К водорастворимым азотсодержащим веществам относятся свободные аминокислоты.
Аминокислоты применяются в качестве средства для лечения многих заболеваний человека и животных [2, 3]. Введение в состав комбикормов аминокислот сокращает расход дефицитных белков животного про -исхождения. Ряд аминокислот (аргинин, аспартат, цистеин, фенилаланин и др.) используют в медицине [4, с. 53]. Суточная потребность в L-аргинине у человека - 5-6 г. При его недостатке в организме нарушается ряд функций, включая производство инсулина и липидный обмен в печени. L-аргинин используется как иммуностимулятор при лечении фасциолеза коров [3]. Источниками поступления L-аргинина в организм человека и животных являются продукты и корма, богатые белками.
Аминокислоты получают несколькими путями: с использованием биотехнологических процессов, путем химического синтеза, гидролизом природного белкового сырья [4, с. 54]. Для производства лекарственных средств и пищевых добавок аминокислоты получают культивированием различных видов бактерий, в частности L-аргинин - с использованием бактерии рода Escherichia [5]. Химический синтез дает рацемат - продукт, содержащий как L-, так и D-формы аминокислот, однако D-изомеры обладают токсичностью, что ограничивает возможности применения аминокислот, полученных таким способом. Производство оптически активных L-изомеров аминокислот из гидролизатов природных материалов растительного и животного происхождения связано с многоступенчатой и дорогостоящей очисткой [4, с. 54]. Метод экстрагирования водорастворимых свободных аминокислот из растительного материала не сложен и экологически безопасен.
Актуальным является поиск новых способов получения растительного материала с высоким содержанием определенных соединений. Повышение в растительном сырье уровня доступных для усвоения аминокислот, обладающих высокой биологической активностью, и изменение их количественного соотношения в соответствии с конкретными задачами можно осуществлять путем регуляции минерального питания растений. Разба-
* Автор, с которым следует вести переписку,
лансировка минерального питания хвойных растений приводит к изменению состава свободных аминокислот в их тканях [б-9]. При избытке азота, а также при дефиците фосфора у хвойных происходит накопление L-аргинина и других аминокислот с высоким содержанием азота - лизина и орнитина. Изменения уровня L-аргинина и орнитина при дефиците серы, кальция, магния и микроэлементов не отмечено [9]. Влияние микроэлементов на аминокислотный состав растений остается слабоизученным. Известна полифункциональная роль бора у растений, в том числе в трансформации аминокислот [10]. Представляло интерес выявить влияние бора при высоком уровне азотного питания на состав свободных аминокислот хвойных растений.
Целью работы было исследование содержания L-аргинина в хвое сосны обыкновенной при регуляции азотного и борного обеспечения.
Экспериментальная часть
Исследования были проведены на территории Петрозаводского лесхоза в южной части Карелии. Объектом исследования была 2-летняя сосна обыкновенная (Pinus sylvestris L.). Супесчаные почвы характеризовались оптимальной для роста хвойных растений кислотностью (pH 5,1). Содержание макро- и микроэлементов составляло (в % от веса сухой почвы): азота - 0,12, фосфора - 0,45, калия - 0,31, кальция - 0,42, бора - 0,0008, меди - 0,009, марганца - 0,027, цинка - 0,005, кобальта - 44х 10-4 и молибдена - 4х 10-5 % от сухой почвы.
В начале роста, в мае, было заложено два варианта опыта. Для каждого варианта выбраны изолированные участки площадью б м2 в трех повторностях. В опытных вариантах в почву в первой половине вегетации вносили азот в дозе 180 кг га-1 в виде водного раствора аммиачной селитры. Два варианта опыта с внесением в почву азота отличались обеспеченностью растений бором. В одном варианте бор в почву не вносили, в другом - в первой половине вегетационного периода в почву вносили бор в дозе 1,5 кг га-1 в виде водного раствора борной кислоты. Контролем для двух вариантов опыта служили соответствующие по уровню минерального питания участки, в почву которых азот и бор не вносили. В третьей декаде июля отбирали хвою для определения сухой массы и для анализа в ней содержания азота и свободных аминокислот. Хвою фиксировали с использованием лиофильной сушилки. Анализ элементов минерального питания (ЭМП) в почве проводили спектрофотометрическим и пламенно-фотометрическим методами [11]. Общий и белковый азот в хвое определяли методом Кьельдаля, модифицированным для тканей хвойных растений [12]. Извлечение аминокислот из хвои осуществляли по методу Плешкова [13]. Очистку экстракта от сахаров проводили на колонке с катионитом (смола КУ-2). Аминокислотный состав хвои определяли с помощью автоматического аминокислотного анализатора ААА-339. Перед введением в анализатор упаренный экстракт растворяли в цитрат-литиевом буфере (pH 2,2). Разделение аминокислот проводили в различных системах буферных растворов, состоящих из пяти компонентов. Введенные смеси сорбировали на ионообменной смоле колонки. Затем каждую из аминокислот вымывали буферными растворами в определенной последовательности с последующей обработкой нингидрином и регистрацией спектрофотометрическим детектором в видимой области спектра. Идентифицировали аминокислоты по времени удерживания аминокислоты на сорбенте. Перед анализом проводили калибровку прибора путем разделения стандартной смеси аминокислот, содержащей по 2,5 мкл каждой из них в 1 мл стандартного раствора. Далее для каждой из аминокислот рассчитывали среднюю (из пяти измерений) площадь регистрируемого сигнала, приходящуюся на 1 нм, и получали константы для количественной оценки содержания аминокислот в опытных образцах. Общее содержание аминокислот высчитывали суммированием. В таблице и на рисунке приведены средние значения из трех биологических повторностей и их стандартные ошибки. Для определения сухой массы хвои использовали по 100 растений в каждом варианте эксперимента. Содержание азота и L-аргинина в хвое рассчитывали на тонну сухой массы.
Обсуждениерезультатов
При внесении в почву в первой половине вегетации под сосну обыкновенную азота в дозе 180 кг га-1 и азота совместно с бором в дозе 1,5 кг га-1 сухая масса хвои повысилась соответственно в 2,7 и 3,5 раза (на 1б7 и 24б% по сравнению с контролем) (табл.).
Повышение прироста хвои под воздействием дополнительного обеспечения азотом и бором свидетельст-вовало о том, что почва характеризовалась их дефицитом для интенсивного роста сосны. Содержание общего и белкового азота в хвое при внесении азота и особенно в сочетании с бором также повышалось.
Сухая масса хвои сосны обыкновенной, содержание азота и аргинина в хвое в связи с обеспеченностью растений азотом и бором
Показатели Контроль - без внесения в почву азота и бора Опыт 1 - в почву внесен азот в дозе 180 кг га-1 Опыт 2 - в почву внесены азот в дозе 180 кг га-1 и бор в дозе 1,5 кг га-1
Сухая масса хвои, % от 100 267 346
контроля
Содержание общего азота 18,21±1,43 25,19±1,98 28.54±2,44
в хвое, кг т-1
Содержание белкового 17,40±1,35 23,02±1,84 25,47±2,06
азота в хвое, кг т-1
Содержание Ь-аргинина 0,10±0,01 1,26±0,10 2,03±0,17
в хвое, кг т-1
В контроле (без внесения азота и бора в почву) сумма свободных аминокислот в хвое составила
0,82±0,07 кг т"1 сухого вещества (рис.). В составе свободных аминокислот хвои определены 19 аминокислот. В наибольшем количестве содержались глутаминовая кислота (15% от суммы аминокислот) и аргинин (12%). Глутаминовая кислота занимает центральное место в обмене аминокислот растений, синтезируется активнее, чем другие аминокислоты, и является универсальным донором и акцептором аминогруппы и углеродного скелета в превращениях азотных соединений [14, с. 149]. Аргинин является основной запасающей азот аминокислотой в хвое сосны обыкновенной в течение большей части года [6].
Дополнительное обеспечение растений азотом, особенно в сочетании с бором, повысило содержание суммы свободных аминокислот в хвое соответственно до 2,35±0,21 и 2,67±0,24 кг т-1 сухого вещества. В опытных вариантах достоверно не изменялось содержание глицина, метионина, изолейцина, лейцина, тирозина и гистидина. В двух опытных вариантах содержание аргинина, орнитина, лизина и цистеина повышалось по сравнению с контролем. Уровень ОН-лизина, глутаминовой и аспарагиновой кислот, аланина, серина, треонина и пролина повышался при внесении в почву азота и снижался при использовании азота в сочетании с бором. Содержание валина достоверно не изменялось при внесении в почву азота, а при использовании азота и бора - снижалось. Количество фенилаланина в хвое снижалось в варианте с внесением азота и повышалось в варианте с использованием азота и бора. При внесении в почву азота сумма свободных аминокислот без учета аргинина в хвое повысилась, а в варианте с внесением в почву азота и бора - понизилась. Предположительно, понижение суммы свободных аминокислот, без учета аргинина, происходило в результате стимуляции белкового синтеза, поскольку содержание белкового азота при этом повышалось.
Повышение суммы аминокислот в хвое опытных растений произошло преимущественно за счет Ь-аргинина. Его содержание в хвое составило в контроле 0,1±0,01 кгт-1 сухой массы, в опыте с использованием азота - 1,26±0,10, с использованием азота и бора - 2,03±0,17 кг т-1 сухой массы (см. табл., рис.). Таким образом, уровень Ь-аргинина в хвое в расчете на единицу сухого вещества увеличился по сравнению с кон-
□ <
□ Glu
□ Orn
□ Asp
■ Lys
□ OH-Ly
и Ser
□ Ala
□ Phe
□ Leu
13 His
ш Gly
□ ^г
□ Cys
11 Val
□ Pro
ц Tyr
□ Ує
□ Met
□ EA
Влияние обеспеченности азотом и бором сосны обыкновенной на содержание свободных аминокислот в хвое, кг т-1 сухого вещества
тролем при внесении в почву азота, а также азота и бора соответственно в 12,2 и 19,7 раза и составил 53 и 76% от общего содержания аминокислот.
Распределение азота между растворимыми фракциями в значительной степени зависит от обеспеченности растений азотом, фосфором и другими ЭМП. Рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксилаза/оксигеназа (Руби-ско), аминокислоты и аммоний могут рассматриваться как соединения, в которых преимущественно накапливается азот, но аккумулируются они в органах и тканях при различных условиях [16]. С увеличением обеспеченности растений фосфором содержание Рубиско увеличивается, а при высоких дозах азота и низкой обеспеченности фосфором избыточный азот накапливается в форме азота аминокислот и аммония.
В случае незначительного или краткосрочного воздействия азотом растения реагируют увеличением интенсивности синтеза белка, если другие элементы питания доступны в достаточном количестве [8]. Высокие дозы азота или долгосрочные воздействия азотом в сосновых древостоях приводят к изменениям в механизме детоксификации избытка азотных соединений. Чтобы избежать накопления токсичного аммиака в растительных клетках, ассимилируемые соединения азота детоксифицируются путем включения в состав свободных аминокислот, преимущественно в состав Ь-аргинина, имеющего наиболее низкое по сравнению с другими аминокислотами отношение С/М (1.5) [8]. В литературе показано, что сеянцы сосны обыкновенной накапливали и запасали до 80% азота в форме Ь-аргинина в случае, если синтез белка был ограничен факторами, отличными от доступности азота [7]. Увеличение содержания Ь-аргинина и глутамина в хвое сосны обыкновенной в 25-летнем, а также 60-80-летнем древостоях указывало на поступление избыточного количества азота в вой-ное растение [8]. Уровень этих аминокислот рассматривается как чувствительный биохимический индикатор загрязнения азотом сосновых древостоев. Необходимо учитывать, однако, что состав и содержание свободных аминокислот в хвое может варьировать в пределах кроны, имеет сезонную, суточную динамику, зависит от внешних воздействий [6, 7, 12, 15, с. 59]. При внесении в течение 17 лет избыточного количества азота под деревья сосны обыкновенной в условиях Северной Швеции отмечалось значительное повышение уровня Ь-аргинина в хвое [6]. Максимальное количество аминокислоты в хвое в сезонной динамике было отмечено в феврале. При выращивании ели норвежской (Рісеа аЫез) в течение двух сезонов в вегетационных сосудах в условиях фона азотного питания, повышенного в 4 раза по сравнению с оптимальным, содержание свободного Ь-аргинина в хвое увеличивалось и составляло до 2% сырого веса [9]. Отмечалось увеличение содержания и других аминокислот с высоким содержанием азота - орнитина и лизина. При дефиците фосфора у сосны обыкновенной также повышалось содержание Ь-аргинина в хвое [6].
Высокий уровень Ь-аргинина и других аминокислот в органах растений можно рассматривать как чувствительный биохимический индикатор разбалансировки их минерального питания. При высоком по сравнению с другими ЭМП поступлении азота в хвойное растение некоторые его органы и ткани не способны использовать для синтеза белков и запасают в форме аминокислот с высоким содержанием азота, прежде всего в форме Ь-аргинина. Дополнительное обеспечение бором хвойного растения ускоряет процессы роста и месте с тем усиливает дефицит других ЭМП, что приводит к повышению накопления Ь-аргинина в хвое.
Аммиачную селитру и борную кислоту в определенных дозах можно рекомендовать для внесения под сосну в почву с целью значительного увеличения содержания Ь-аргинина в хвое. Регулированием вносимых в почву доз азота и бора можно стимулировать накопление этой аминокислоты в хвое сосны. Необходимо учитывать, что разбалансированность минерального питания в результате внесения избыточных количеств азота и бора может сказаться в будущем на различных аспектах метаболизма растительного организма. Такая схема внесения удобрений может применяться для древостоев, планируемых под вырубку, при возможности использования недревесных лесных ресурсов (сосновой лапы с хвоей, обогащенной Ь-аргинином), а не в качестве способа ухода. Экономическая целесообразность использования хвои для получения Ь-аргинина еще требует своего изучения.
Древесная зелень используется для производства биологически актив ных препаратов лечебно-профилактического и кормового назначения [1, 17]. Повышение содержания Ь-аргинина в хвое путем регуляции минерального питания растений открывает новые возможности использования ее в качестве сырья для получения БАВ.
Выводы
Регулирование азотного и борного обеспечения сосны обыкновенной позволяет значительно (в 20 раз) повысить содержание свободного L-аргинина в хвое за один вегетационный период. При этом повышается также прирост биомассы хвои и содержание в ней общего и белкового азота. Хвою с высоким содержанием L-аргинина можно использовать в качестве сырья для получения этой аминокислоты.
Список литературы
1. Ягодин В.И. Основы химии и технологии переработки древесной зелени / под ред. Ю.И. Холькина. Л., І98І. 224 с.
2. Западнюк В.И., Купраш Л.П., Заика М.И. и др.Аминокислоты в медицине. Киев, І982. 200 с.
3. Дахно И.С. Влияние иммуностимуляторов L-аргинина и РНК на иммунный статус коров при фасциолезе // Вісник Полтавського державного сільського сподарського інституту. 2000. №5. С. 32-34.
4. Волкова Т.Г. Биотехнология. Новосибирск, І999. 252 с.
5. Патент №2304бІ5 (Россия). Способ получения Ь-аминокислот с использованием бактерий, принадлежащих к роду Escherichia / КВ. Рыбак, Е.А. Сливинская, Е.А. Саврасова, В.З. Ахвердян, Е.В. Клячко, С.В. Машко,
B.Г. Дорошенко, Л.Г. Айрих, Т.В. Леонова. 2005.
6. Nasholm T., Ericsson A. Seasonal changes in amino acids, protein and total nitrogen in needles of fertilized Scots pine trees // Tree Physiology. І990. V. б. Pp. 2б7-281.
7. Gezelius K, Nasholm T. Free amino acids and protein in Scots pine seedlings cultivated at different nutrient availabilities // Tree Physiology. І993. V. 13. №1. Pp. 71-8б.
8. Huhn B.G., Schulz H. Contents of free amino acids in Scots pine needles from field sites with different levels of nitrogen deposition // New Phytol. І99б. V. І34. Pp. 95-І0І.
9. Engvild K.C. The «Red» Decline of Norway Spruce or «Rede Redgraner» - Is it Ammonium Overload or Top-Dying? // Rise National Laboratory. April, 2005. Іб p.
10. Кибаленко А.П. Значение бора в метаболизме растительной клетки // Микроэлементы в обмене веществ растений. Киев, 197б. С. 93-125.
11. Аринушкина С.В. Руководство по химическому анализу почв. М., І970. 487 с.
12. Чикина П.Ф. Азотный обмен // Физиолого-биохимические основы роста и адаптации сосны на Севере. Л., І985.
C. 57-82.
13. Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений. М., 197б. 25б с.
14. Кретович В.Л. Обмен азота в растениях. М., І972. 528 с.
15. Чернобровкина Н.П. Экофизиологическая характеристика использования азота сосной обыкновенной. СПб., 200І. І75 с.
16. Warren C. R., Adams M.A. Phosphorus affects growth and partitioning of nitrogen to Rubisco in Pinuspinaster// Tree Physiology. 2002. V. 22. P. ІІ-19.
17. Левин Э.Д., Репях C.M. Переработка древесной зелени. М., І984. І20 с.
Поступило в редакцию 6 октября 2009 г.
После переработки 24 марта 2010 г.
