CC BY
56
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2012, № 3
УДК 631.461.5:579.842.16:579.22
НАКОПЛЕНИЕ АЛАНИНА В КЛЕТКАХ ЭНДОФИТА Klebsiella terrigena Е6 В УСЛОВИЯХ АЗОТФИКСАЦИИ
М.Л. КАЗАКОВА, К.М. ЗЛОТНИКОВ, А.В. КАЗАКОВ, А.К. ЗЛОТНИКОВ
На модельном объекте (штамм Klebsiella terrigena Е6, способный колонизировать ткани ячменя и подсолнечника) изучали возможные метаболические пути выноса фиксируемого N из клеток азотфиксирующих бактерий-эндофитов в небобовые растения. В исследовании реализован оригинальный методический подход — анализ пула основных аминокислот в бактериальных клетках с целью выявления возможного акцептора аммонийной группы глутамата, образующегося при азотфиксации. Обнаружено, что в условиях азотфиксации доминирующей аминокислотой в клетках K. terrigena Е6 был аланин (53,4 % от суммы аминокислот). При добавлении в среду роста бактерий пирувата накопление аланина увеличивалось в 1,4 раза. Полученные результаты позволяют предположить, что аммонийная группа у K. terrigena Е6 при азотфиксации переносится из глутамата на пируват, а образующийся при этом аланин может служить переносчиком фиксированного азота из клеток бактерий.
Ключевые слова: азотфиксация, аланин, бактериальный эндофит, Klebsiella terrigena.
Keywords: nitrogen fixation, alanine, bacterial endophyte, Klebsiella terrigena.
Известно, что некоторые азотфиксирующие бактерии (Acetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum spp., Azospirillum spp., Klebsiella oxytoca) колонизируют ткани сельскохозяйственных растений — сахарного тростника, риса, сорго, кукурузы (1-3). Было показано, что азотфиксирующие эндофиты K. oxytoca и K. planticola могут снабжать растение-хозяина азотом из атмосферы (4). Так, бактериальные эндофиты Acetobacter diazotrophicus и Herbaspirillum spp., выделенные из сахарного тростника, обеспечивают до 80 % потребности растения в азоте (3, 5). Кроме того, бактерии-эндофиты способны выделять физиологически активные вещества, положительно воздействуя на рост, развитие и иммунитет растений (5, 6).
Азотфиксирующие бактерии рода Klebsiella в этой связи представляют особый интерес. Установлено, что K. oxytoca колонизирует внутренние ткани пшеницы, риса и табака (7, 8), K. terrigena — ткани ячменя, табака и подсолнечника (7, 9). Названные бактерии также относятся к активным почвенным азотфиксаторам, синтезируют ауксины и подавляют развитие фитопатогенных грибов (10). Инокуляция семян ячменя штаммом K. terrigena Е6 повышает энергию прорастания и способствует росту растений (9).
При очевидном вкладе N-фиксирующих бактерий-эндофитов в азотное питание небобовых растений, конкретные механизмы поступления фиксируемого азота в растение не исследованы.
Целью нашей работы было изучение пула свободных аминокислот у азотфиксирующего эндофита небобовых растений K. terrigena Е6 для выявления возможных переносчиков фиксированного азота из клеток этих бактерий в клетки растения.
Методика. Объектом исследований служила азотфиксирующая бактерия Klebsiella terrigena E6 из рабочей коллекции лаборатории адаптации микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов (г. Пущино). Бактерии K. terrigena E6 выращивали при 28 °С, в жидкой среде IPG-05 (11) в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с 250 мл среды на качалке (180 об/мин) в течение 1 сут. Затем клетки бактерий осаждали центрифугированием 30 мин при 5000 об/мин. Полученную биомассу ресуспендировали в 250 мл модифицированной безазотной среды
Доберейнер NFb следующего состава (г/л): Б,Ь-яблочная кислота — 5,00; К2НРО4 — 0,5; MgSO4 • 7H2O — 0,20; NaCl — 0,10; CaCl2 • 2H2O — 0,02; глюкоза — 3,00; раствор микроэлементов — 2 мл, раствор витаминов — 1 мл, pH среды доводили KOH до 6,8. Состав раствора микроэлементов (мг/л): EDTA — 500; FeSO4 • 7H2O — 1500; ZnSO4 • 7H2O — 400; MnCl2 • 4H2O — 1000; H3BO3 — 500; CoCl2 • 6H2O — 300; CuSO4 • 5H2O — 100; NiCl2 • 6H2O — 20; KI — 20; Na2MoO4 • 2H2O — 500. Состав раствора витаминов (мг/л): пантотенат Ca — 1000, тиамин — 400, биотин — 500 (12). Клетки бактерий подращивали в этой среде для истощения связанного азота при 28 °С на качалке в течение 12 ч и осаждали центрифугированием. По 1 мл полученной сгущенной суспензии клеток с титром около 1011 КОЕ/мл помещали в пенициллиновые флаконы объемом 15 мл и сверху наслаивали жидкую среду Доберейнер NFb (1, 2, 3 и 4 мл) так, чтобы высота столбика среды над подложкой бактериальной суспензии была разной. В зависимости от цели эксперимента в наслаиваемую среду Доберейнер NFb добавляли пируват.
Для анализа пула свободных аминокислот в клетках K terrigena E6 флаконы с бактериальной суспензией культивировали при 28 °С без перемешивания, через 6, 12 и 24 ч бактерии отделяли от среды центрифугированием и высушивали при 60 °С до постоянной массы. Измерения проводили по стандартной методике (13) на аминокислотном анализаторе Т339 («Microtechnic Praha», Чехия); ионообменная смола — LGANB, детектор — диодный фотометр (X = 570 нм).
Азотфиксирующую активность определяли ацетиленовым методом (14). Флаконы с суспензией бактерий и разным количеством среды Доберейнер NFb герметично закрывали резиновыми пробками, инкубировали с ацетиленом в течение 3 ч при 28 °С без перемешивания и измеряли количество образовавшегося этилена на газовом хроматографе Цвет-101 (Россия) с пламенно-ионизационным детектором; длина колонки — 2 м, наполнитель — специально обработанный силикагель КСК (Россия); 90 °С; в качестве газа-носителя использовали аргон. Активность азотфиксации выражали в нмоль C2H4/(мг белка • ч). Контролем служили клетки K. terrigena Е6, прокипяченные на водяной бане в течение 10-15 мин. Содержание белка в биомассе клеток определяли по Лоури.
Все опыты выполняли в 3 повторностях. Статистическую обработку осуществляли с помощью программы Microsoft Excel. В результатах приводятся средние значения и стандартные отклонения полученных величин при уровне значимости P = 0,05.
Результаты. Штамм K. terrigena Е6 был выделен из ризосферной почвы ежи сборной (Dactylis glomerata) в составе естественной бактериальной ассоциации с Bacillus firmus E3 (15). Ранее мы показали, что этот штамм — эндофит и способен колонизировать ткани ячменя и подсолнечника (9).
Как известно, образуемая при биологической фиксации атмосферного азота молекула аммиака при ассимиляции по метаболическому пути GS—GOGAT включается в глутамин и глутамат и далее вовлекается в обменные процессы N-метаболизма посредством реакций переаминирования глутамата (16). Для выявления возможного акцептора этой аммонийной группы мы количественно оценили состав пула основных аминокислот в клетках, культивируемых в способствующих азотфиксации условиях, использовав наслоение разных объемов жидкой безазотной среды Доберейнер NFb на сгущенную суспензию бактерий в качестве приема, позволяющего оптимизировать аэрацию.
При добавлении 1, 2, 3, 4 и 0 мл (контроль без среды) безазотной среды Доберейнер МБЪ азотфиксирующая активность в образцах составила соответственно 11,52; 4,46; 4,11; 3,77 и 0 нмоль С2Н4/(мг белка-ч). То есть наибольшую азотфиксирующую активность наблюдали при наслоении 1 мл среды, и эта активность соответствовала характерной для К. 1вт-gena Е6 нитрогеназной активности 15 нмоль С2Н4ДМГ белка *ч) (12).
Доминирующей аминокислотой в пуле оказался аланин (его концентрация была наибольшей при культивировании бактерий в течение 12 ч) (рис. 1, А). Количество аланина превосходило количество глутамата почти в 5 раз и составляло 53,4 % от суммы всех аминокислот. Для сравнения (см. рис. 1, Б) приведено распределение аминокислот в клетках К. 1вт-gena Е6, выращенных на среде 1Р0-05 в условиях, исключающих азотфик-сацию. Полученное в этом варианте соотношение количества аминокислот в пуле было совершенно иным, а доля аланина составляла лишь 15,4 %.
Доминирование аланина над глутаматом (см. рис. 1, А) при накоплении в клетках бактерий отмечали только в условиях максимальной азот-фиксирующей активности у штамма Е6. При наслаивании 2 и 3 мл среды и, соответственно, снижении активности азотфиксации наблюдали доминирование глутамата.
На основании этих результатов мы предположили, что у бактерий К. temgena Е6 при азотфиксации аммонийная группа из глутамата посредством переаминирования передается главным образом в аланин. Предшественником аланина служит пируват, следовательно, можно было ожидать, что в присутствии пирувата произойдет накопление аланина.
Наше предположение подтвердили результаты, полученные при добавлении пирувата в среду Доберейнер МБЪ для наслаивания и суспендирования бактерий. Наиболее заметное накопление аланина зарегистрировали в варианте с концентрацией пирувата 1 мг/л (в 1,4 раза больше, чем в контроле) (рис. 2). При этом также возросло соотношение между количеством аланина и глутамата (с 2,56-кратного превышения первого в контроле до 3,50-кратного — в варианте с концентрацией пирувата 1 мг/л).
На основании полученных результатов была предложена возможная схема выноса атмосферного азота, фиксируемого эндофитной бактерией К. terrigena Е6, в растение (рис. 3). В предлагаемой схеме растение
Рис. 1. Содержание аминокислот в клетках Klebsiella ter-rigena Е6, инкубируемых в оптимальных для азотфиксации условиях (A) и в условиях, исключающих азот-фиксацию (Б).
Рис. 2. Содержание аминокислот в клетках Klebsiella terrigena Е6, инкубируемых при разной концентрации пирувата в безазотной среде Доберейнер NFb: а — аланин, б — глутамат.
поставляет в клетки эндофитных бактерий сахара. Они в процессе гликолиза метаболизируются до пирувата, далее выступающего в качестве акцептора аммонийной группы в реакциях переаминирования с глутаматом, а образующийся при этом аланин экскретируется в растение.
Рис. 3. Возможная схема выноса фиксированного азота в растение у эндофитной бактерии Klebsiella terrigena Е6: Pi — неорганический фосфат, GS — глутаминсинтетаза, GOGAT — глута-матсинтаза.
Таким образом, установлено, что при азотфиксации в клетках Klebsiella terrigena Е6 в пуле свободных аминокислот увеличивается доля аланина. Накопление аланина стимулируется его предшественником — пируватом. Наши результаты позволяют предположить, что аммонийная группа у K. terrigena Е6 при азотфиксации передается от глутамата на пи-руват, а образующийся при этом аланин может служить переносчиком фиксированного азота. На основании полученных данных предложена схема выноса фиксированного азота в растение из клеток эндофитных азот-фиксирующих бактерий.
1. R o s e n b l u e t h M., M a r t i n e z - R o m e r o E. Bacterial endophytes and their interactions with hosts. Mol. Plant Microbe. Interact., 2006, 19: 827-37.
2. R y a n R.P., G e r m a i n e K., F r a n k s A., R y a n D.J., D o w l i n g D.N. Bacterial endohytes: recent developments and applications. FEMS Microbiol. Lett., 2008, 278: 1-9.
3. J a m e s E.K., R e i s V.M., O l i v a r e s F.L., B a l d a n i J.I., D o b e r e i n e r J. Infection of sugar-cane by the nitrogen-fixing bacterium Acetobacter diazotrophicus. J. Exp. Botany., 1994, 45: 757-766.
4. B r i l l W.J. Biochemical genetics of nitrogen fixation. Microbiol. Rev., 1980, 44: 449-467.
5. H a l l m a n n J., Q u a d t - H a l l m a n n A., M a h a f f e e W.F., K l o e p p e r J.W. Bacterial endophytes in agricultural crops. Can. J. Microbiol., 1997, 43: 895-914.
6. Ш а п о ш н и к о в А.И., Б е л и м о в А.А., К р а в ч е н к о Л.В., В и в а нк о Д.М. Взаимодействие ризосферных бактерий с растениями: механизмы образования и факторы эффективности ассоциативных симбиозов (обзор). С.-х. биол., 2011, 3: 16-22.
7. П е т а к А.М., К о в т у н о в и ч Г.Л., К о з ы р о в с к а я Н.А., Т у р я н и ц а А.И., К о р д ю м В.А. Взаимоотношения бактерий рода Klebsiella с растением. Биополимеры и клетка, 1995, 11(6): 75-80.
8. B a c o n C.W., H i n t o n D.M. Bacterial endophytes: the endophytic niche, its occupants, utility. In: Plant-associated bacteria /S.S. Gnanamanickam (ed.). Springer, Netherlands, 2006, Part 1: 155-194.
9. 3 л о т н и к о в А.К., К а з а к о в а М.Л., 3 л о т н и к о в К.М., К а з а к о в А.В. Новый бактериальный эндофит сельскохозяйственных культур. С.-х. биол., 2006, 3: 62-66.
10. 3 л о т н и к о в А.К., У м а р о в М.М. Влияние инокуляции ризосферной бактериальной ассоциации Bacillus firmus и Klebsiella terrigena на пораженность ярового ячменя фитопатогенными грибами. Тез. Межд. конф. «Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии». М., 1998: 41-42.
Л И Т Е Р А Т У Р А
11. 3 л о т н и к о в К.М., Ч а т у е в Б.М., И в а ш и н а Т.В., X м е л ь н и ц к и й М.И. Выделение ауксотрофных мутантов у Rhizobium japonicum и Rhizobium phaseoli. Генетика, 1983, 19(9): 1404-1410.
12. 3 л о т н и к о в А.К., К а з а к о в а М.Л., 3 л о т н и к о в К.М., К а з а к о в А.В., У м а р о в М.М. Физиологические и биохимические свойства бактериальной ассоциации Klebsiella terrigena Е6 и Bacillus firmus Е3. Прикладная биохимия и микробиология, 2007, 43(3): 339-346.
13. S p a c k m a n D.H., S t e i n W.H., M o o r e S. Chromatography of amino acids on sul-fonated polystyrene resins. Anal. Chem., 1958, 30(7): 1185-1189.
14. Методы почвенной микробиологии и биохимии /Под ред. Д.Г. 3вягинцева. М., 1991.
15. Z l o t n i k o v A.K., S h a p o v a l o v a Y.N., M a k a r o v A.A. Association of Bacillus firmus E3 and Klebsiella terrigena E6 with increased ability for nitrogen fixation. Soil Biol. Bio-chem., 2001, 33: 1525-1530.
16. Ш л е г е л ь Г.Г. Общая микробиология. М., 1987.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Т.К. Скрябина РАН,
142290 Московская обл., г. Пущино, просп. Науки, 5, е-mail: boronin@ibpm.pushchino.ru, volosina@rambler.ru, andreynkaz@rambler.ru, albit@ albit. ru
ALANINE ACCUMULATION IN CELLS OF ENDOPHYTE Klebsiella terrigena Е6 UNDER THE NITROGEN FIXATION
M.L. Kazakova, K.M. Zlotnikov, A.V. Kazakov, A.K. Zlotnikov S u m m a r y
Possible metabolic pathways of carrying out the fixed N from bacteria-endophyte cells to non leguminous plants were investigated on a model strain (Klebsiella terrigena Е6, colonizing the tissues of barley and sunflower). An original technical approach was realized in this experiment — the analysis of the main amino acids pool in bacterial cells for the detection of possible acceptor of glutamate ammonium group, generated during nitrogen fixation. The authors revealed, that alanine is dominant amino acid in K. terrigena Е6 cells in nitrogen fixation conditions (53.4 % of total amino acids). The addition of pyruvate to growing bacterial medium increased the alanine accumulation by 1.4 times. These data permit to suppose that ammonium group during nitrogen fixation in K. terri-gena Е6 is transferred from glutamate to pyruvate, and formed alanine may serve as a carrier for fixed nitrogen transferred from bacterial cells to plant.
Научные собрания
СЕССИЯ КОНГРЕССА «ФОТОНИКА В СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ И ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИИ» (научная программа 7-й Международной специализированной выставки оптической, лазерной и оптоэлектронной техники «ФОТОНИКА. МИР ЛАЗЕРОВ И ОПТИКИ-2012») в рамках Международной научно-практической конференции «Фотоника в биотехнологиях, экологии и сельском хозяйстве»)
(г. Москва, Дом науки ВСТИСП РАСХН, 19-20 апреля 2012 года)
Организаторы: РАСХН, Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства РАСХН, Лазерная ассоциация России.
Тематика:
■ Механизмы взаимодействия оптического излучения с биологическими системами и структурами
■ Модификационная изменчивость и эпигенетические процессы световой регуляции экспрессии генов
■ Фундаментальные и теоретические вопросы лазерных био- и агротехнологий
■ Фотоника в садоводстве
■ Практическое использование оптического излучения в биотехнологии, растениеводстве, животноводстве, ветеринарии и аквакультуре
■ Технические средства для электромагнитной обработки растений и животных
■ Современные оптические приборы и методы измерений в биологии, биотехнологии, экологии и сельском хозяйстве
Контакты и информация: http://www.photonics-expo.ru, http://www.vstisp.org, vstisp@vstisp.org
Поступила в редакцию 12 сентября 2011 года
