CC BY
26
УДК 577.3
Д.В. Лебедев, М.Л. Соколова, Я.В. Федорова, Г.Е. Побегалов, Д.Б. Червякова, С.Б. Ланда, М.А. Ходорковский
НАДМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СТРУКТУРЫ, ОБРАЗУЕМЫЕ iN ViTRO БЕЛКОМ TiP49A
D.V. Lebedev ', M.L. Sokolova 2, Ya.V. Fedorova 3, G.E. Pobegalov4, D.B. Chervyakova 5, S.B. Landa 6, M.A. Khodorkovskiy 7
',5,6 B.P. Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute, Orlova Roscha, Gatchina, 188300, Russia 2, 3 4,7 St. Petersburg State Polytechnical University, 29 Politekhnicheskaya St., St. Petersburg, 195251, Russia
SUPRAMOLECULAR STRUCTURES FORMED BY TiP49A PROTEiN iN ViTRO
Белки TIP49A входят в ряд комплексов, ремодулирующих хроматин человека, и легко олигоме-ризуются in vitro с образованием различных агрегатов размером в десятки и сотни нанометров. В работе показано, что неспецифическая агрегация белка может быть значительно ослаблена в присутствии детергента Triton-X100 в концентрациях 0,05—0,10 %. Кроме того, добавление детергента разрушает уже имеющиеся агрегаты, что позволяет выделить олигомерные формы белка, вероятно обладающие биологической активностью. Представленные данные малоуглового рентгеновского рассеяния и динамического светорассеяния позволяют предположить, что агрегация белков TIP49A, наблюдаемая in vitro, носит обратимый характер; при этом в результате олигомеризации этот белок может образовывать два различных типа устойчивых филаментных структур.
БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА TIP49. МАЛОУГЛОВОЕ РЕНТГЕНОВСКОЕ РАССЕЯНИЕ. СВЕТОРАССЕЯНИЕ.
Tip49a, a human protein isolated with several chromatin-remodulating complexes, is readily oligomerized in vitro forming polydisperse aggregates of the size of tens and hundreds of nanometers. In this work we show that the non-specific aggregation of the protein can be effectively countered by 0.05—0.10 % concentrations of a detergent Triton-X100. We also show that addition of the detergent destroys aggregates formed already that allows us to isolate oligomeric forms of the protein which may have biological significance. When combined, the results of small angle X-ray scattering and dynamic light scattering experiments suggest that TIP49A aggregation observed in vitro is reversible with the protein oligomerization in two different types of stable filamentous structures.
TIP49 PROTEINS. SMALL ANGLE X-RAY SCATTERING. LIGHT SCATTERING.
TIP49A представляет собой ядерный белок эукариот, который выделяется в составе комплексов ремодуляции хроматина (IN080, Tip54 и др.). Предполагается, что этот белок участвует в ремодуляции хроматина в процессе репарации, в регуляции транскрипции и в процессе деления клеток. In vitro белок проявляет слабую АТФазную
и геликазную активность, при этом связь структуры и функции не установлена [1, 2]. Согласно структуре, полученной методом рентгеновской кристаллографии, мономер белка состоит из трех доменов: и Б3, формирующих модуль связывания и гидролиза АТФ, и ДНК-связывающего домена Б2 [1, 4].
Белок TIP49A легко олигомеризуется в растворе. На основании данных рентгеновской кристаллографии можно предположить образование целого ряда олигомерных состояний белка от тримера до додекамера, часть из которых наблюдалась экспериментально [3]. Роль этих состояний во взаимодействии данного фермента с молекулой ДНК на настоящий момент не установлена. Можно предположить, что связывание белка с ДНК модулируется присоединением АТФ к белку, которое в свою очередь обусловлено подвижностью шарниров в области аминокислотных остатков 366 и 383.
In vitro белки Tip49 имеют сильную склонность к неспецифической агрегации, что значительно затрудняет исследование функциональных олигомерных комплексов этих белков. В настоящей работе исследованы олигомерные состояния и агрегация белка TIP49A дикого типа и мутантных белков Y366A и G383A.
Методики исследования
Рекомбинантные белки TIP49A дикого типа, а также точечные мутанты Y366A и G383A были экспрессированы в культуру клеток бактерии E.coli с использованием вектора pET3a-TIP49a, несущего ген белка TIP49a крысы с 6his-flag тэгами на Л-конце белка. Вектор был получен от М.Ю. Григорьева, сотрудника Лаборатории молекулярной биологии эукариот университета г. Тулузы, Франция. Индукция синтеза белка осуществлялась добавлением реагента ИПТГ до концентрации 0,25 мМ в культуру клеток E.coli Rosetta (объем 600 мл). Клетки осаждали центрифугированием (приблизительно по 1,5 г клеточного осадка) и лизировали с помощью лизоцима. Растворимую часть клеточного лизата подвергали хроматографической очистке на Ni-NTA-агарозе согласно протоколу производителя (QIAGEN).
Очищенный белок переводили диализом в буфер 20 мМ Tris-HCl мМ, pH = 7,4 при 4 °C, содержащий 50 мМ KCl и (за исключением образцов, свободных от магния) 5 мМ MgCl2. Для проверки качества очистки белка проводили электрофорез в поли-акриламидном геле в денатурирующих усло-
виях. Выход белка из одного выделения составлял около 1 мг. Для экспериментов по динамическому светорассеянию белок подвергался дополнительной стадии хроматографии (гель-фильтрации) для разделения олигомеров белков по размерам. Непосредственно перед измерением часть образцов инкубировалась в буфере, содержащем 0,05 % детергента (Triton-X100) при комнатной температуре в течение 20 мин. Измерения производилось на приборе Ма1уегп Zetasizer Nano (Malvern Instruments Ltd, Англия) в стандартной конфигурации.
Измерение спектров малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) белка TIP49A в растворе проводились на станции BM-29 источника синхротронного излучения ESRF (г. Гренобль, Франция) в диапазоне амплитуд векторов рассеяния от 0,04 до 3 нм1 при температуре 20 °С. Белок добавлялся в количестве, необходимом для получения конечной концентрации от 0,5 до 4,5 мг/мл, к 20 мМ Tris-HCl буферу (pH = 7,4 при 4 °C).
В соответствующих образцах к буферному раствору добавлялся хлорид магния (до 5 мМ) и двунитевая ДНК фага X. С целью уменьшения степени агрегации белка в часть образцов с концентрацией белка около 1 мг/мл был добавлен Triton-X100 (0,05 %) с последующим увеличением концентрации белка путем центрифугирования на диализной мембране с молекулярным весом отсечки 10 кДа. Данные МУРР корректировались на фоновые спектры, полученные на соответствующих буферных растворах.
Питательная среда LB для выращивания клеток приготовлялась из готовой смеси фирмы Amresco. Реактивы для приготовления буферов, проведения электро-форезов и других процедур (Tris, ЭДТА, натрия додецилсульфат, акриламид, биса-криламид, ß-меркаптоэтанол, изопропил-ß-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ), фенил-метилсульфонилфторид (ФМСФ), ими-дазол, АТФ, АТФYS) были приобретены в фирме Sigma-Aldrich, США. Остальные реактивы (HCl, ксиленцианол, бромфено-ловый синий, глицин, уксусная кислота, глицерин, изопропанол, NaH2PO4 и др.)
Рис. 1. Спектры малоуглового рентгеновского
рассеяния белка TIP49A при различных концентрациях, мг/мл: 0,5 (3), 1,5 (2), 4,5 (1)
приобретались в российских компаниях. Лизоцим, белковый маркер и дитиотрейтол (ДТТ) приобрели в компании Fermentas (США). Хроматографический носитель — агарозу Ni-NTA Superflow получили из компании QIAGEN (США).
Результаты и их обсуждение
Анализ данных малоуглового рентгеновского рассеяния показал высокую склонность белка к агрегации (рис. 1), что выражалось в росте интенсивности в малых углах рассеяния и отсутствии области
Гинье в диапазоне векторов рассеяния до 0,04 нм-1. Это указывает на образование аморфных полидисперсных агрегатов размером 25 нм и более. Для сравнения отметим, что максимальный диаметр гекса-мера белка, наблюдаемого в электронной микроскопии, составляет менее 12 нм [3]. Понижение концентрации белка с 4,5 до 0,5 мг/мл привело лишь к незначительному уменьшению агрегации и изменению спектров рассеяния (см. рис. 1). Аналогичные результаты были получены для мутантных белков У366А и С383А.
Высокая склонность белка к агрегации подтверждается данными динамического светорассеяния (ДСР). В то же время анализ данных ДСР для мутантного белка У366А (рис. 2, а) показал присутствие двух фракций частиц со средними размерами 15,5 ± 2,3 и 59 ± 17 нм. Массовая доля фракции с гидродинамическим диаметром 15 нм составляла около 70 %, что соответствует примерно 7 %-му вкладу в интенсивность рассеяния.
Следует отметить, что интенсивности рассеяния в малые углы для МУРР и интенсивности ДСР имеют одинаковую зависимость от размера рассеивающей частицы и пропорциональны квадрату ее объема, поэтому даже сравнительно небольшое количество крупных агрегатов может вносить основной вклад в спектры рассеяния.
Рис. 2. Динамическое светорассеяние белка Т1Р49А У366А в отсутствие детергента (а) и после инкубации с 0,05 % Тгйоп-Х100 (б)
Рис. 3. Спектры малоуглового рентгеновского рассеяния белка Т1Р49А, полученные в отсутствие детергента (1) и с применением методики концентрации этого белка в присутствии детергента ТгИоп-Х100 (2)
Инкубация белка в присутствии 0,05 % детергента привела к почти полному исчезновению крупных полидисперсных агрегатов белка и полному исчезновению фракции с размером агрегатов 15 нм (рис. 2, б).
Основная масса белка (более 98 %) имела олигомерную форму с гидродинамическим диаметром 6,4 ± 0,7 нм, что соответствует молекулярной массе 260 ± 80 кДа, близкой к массе пента- или гексамера белка. Полидисперсные агрегаты (52 ± 17 нм) составляли только 1,6 % общей массы белка, при этом их вклад в рассеяние составлял чуть более 80 %.
Спектры малоуглового рентгеновского рассеяния белка Т1Р49А в присутствии детергента также показывают значительный вклад белковых агрегатов, однако при этом наблюдается заметное увеличение интенсивности малоуглового рассеяния в больших углах, что указывает на увеличение доли частиц небольшого размера (мономеров либо олигомеров белка) в растворе (рис. 3).
Поскольку по данным ДСР средний размер агрегатов в присутствии ТгИоп-Х100 менялся незначительно, мы использовали это наблюдение для интерпретации спектра МУРР белка, обработанного детергентом, в виде линейной комбинации спектра мало-
углового рассеяния в отсутствие детергента, и гауссовой функции, соответствующей области Гинье спектра монодисперсных частиц:
(
Л(ч) = аЪ(д) + 10 ехр
Кч
(1)
где ^ — радиус гирации частицы; 11, / — интенсивности рассеяния до и после добавления детергента, соответственно.
Для модели вытянутых частиц (фила-ментов) использовалась аналогичная формула:
( 2 ^
I (ч) = а ■ /1(4) + 1С0 ехр
(2)
где Яс — поперечный радиус гирации.
Коэффициенты а, /0 (либо /с0) и радиус гирации (Я) находились путем регрессии экспериментальных данных по формулам (1) или (2) методом наименьших квадратов в диапазоне малых углов, где и применимо приближение Гинье.
Как видно из рис. 4, спектры рассеяния мутантного белка У366А в диапазоне амплитуд вектора рассеяния 0,05 — 0,25 нм1 могут быть описаны функцией (1). Результаты МУРР согласуются с данными ДСР и
Рис. 4. Спектр малоуглового рентгеновского рассеяния мутантного белка Т1Р49А У366А (1); представлен в виде суммы интенсивностей рассеяния белком в агрегированном состоянии (2) и монодисперсными частицами (3) с радиусами инерции 4,7 нм.
Регрессия по формуле (1) в диапазоне 0,05 - 0,25 нм-1 , х2 = 3,66
указывают на присутствие частиц с радиусом инерции 4,7 ± 0,4 нм, что близко к расчетным значениям для пента- и гексамера белка (5,1 — 5,4 нм).
Обработка спектров малоуглового рассеяния белка дикого типа, аналогичная проведенной для мутанта С383А, дает значения радиуса гирации более 10 нм, что значительно больше, чем у известных олигомерных форм белка. Анализ данных
а)
Рис. 5. Спектры малоуглового рентгеновского рассеяния (1, 4) белка Т1Р49А дикого типа в отсутствие магния (а) и комплекса этого белка с двухнитевой ДНК (б). Оба спектра представлены в виде суммы интенсивностей рассеяния объектами в агрегированном состоянии (2, 5) и монодисперсными филаментами (3, 6) с различными поперечными радиусами
инерции, нм: 4,7 (а), 1, 6 (б). Регрессии проведены по формуле (2) в диапазоне 0,08 — 0,20 нм-1; х2 = 4,29 (а) и 0,95 (б)
МУРР показал, что, в отличие от мутантно-го белка Y366A, для этих белков агрегация в присутствии детергента в значительной степени зависит от содержания магния. Данные, полученные в отсутствие магния, хорошо описываются с использованием формулы (2) в диапазоне векторов рассеяния от 0,08 до 0,2 нм-1. Результат регрессии данных для белка дикого типа приведен на рис. 5, а и дает поперечный радиус инерции 4,7 ± 0,2 нм. Подобная модель для мутанта G383A дает поперечный радиус гирации филамента 5,0 ± 0,2 нм. Анализ спектров, полученных в присутствии двунитевой ДНК, дает соответствующие параметры Rc = =1,6 ± 0,7 нм для белка дикого типа (рис. 5, б) и 4,3 ± 0,3 нм для мутантного белка G383A.
Наши данные указывают на то, что агрегация белка TIP49A in vitro является обратимой. Аморфные агрегаты размером в несколько десятков наномеров стабилизируются магнием и разрушаются при добавлении 0,05 % детергента Triton-X100. По данным МУРР основной олигомерной формой белка дикого типа вероятнее всего являются филаменты с радиусом инерции, приблизительно соответствующим поперечному радиусу инерции белкового гексамера. Таким образом, наблюдаемые результаты могут указывать на образование непрерывных филаментов белка в конфор-мации, близкой к наблюдаемой в гексаме-ре, либо линейных структур из отдельных гексамеров.
Мутантный белок Y366A не образует филаментов в присутствии детергента. Однако в экспериментах по ДСР видна полидисперсная фракция белка с гидродинамическим диаметром около 15 нм, которая полностью исчезает после добавления 0,05 % Triton-X100. Можно предположить, что эта фракция также соответствует фила-ментным структурам длиной в 20 — 30 нм, которые менее стабильны, чем у дикого типа. Возможно, что за счет изменения конформационной подвижности этот белок не в состоянии образовывать непрерывный филамент, а формируемые вместо него линейные агрегаты разрушаются детергентом.
Взаимодействие белка дикого типа с ДНК приводит к значительному уменьшению толщины филамента, поперечный радиус инерции которого падает приблизительно до 2 нм. Такое изменение структуры филамента должно быть связано со значительными конформационными изменениями в мономере, возможно, в области, отвечающей за связывание АТФ, поскольку данный эффект не наблюдается в мутант-ном белке С383А.
Вопрос о функциональной роли белка Т1Р49А и ее молекулярных механизмах на настоящий момент остается открытым. Постулируемая геликазная активность этого фермента, основанная на принципе структурного сходства, по всей вероятности, может осуществляться гексамерной формой белка. В то же время для фермента, суб-
стратом которого является линейный полимер (ДНК), образование филаментов и их структурная реорганизация при взаимодействии с субстратом может указывать на другие механизмы участия Т1Р49А в процессе ремодуляции хроматина.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (ГК N0. 11.519.11.2002 и Стипендия Президента РФ № СП-5651.2013.4 ) и РФФИ (грант № 12-02-12053 офи_м) с использованием оборудования ЦКП «Аналитический центр нано-и биотехнологий ГОУ СПбГПУ» на базе ФГБОУ ВПО СПбГПУ. Также мы благодарим Европейский центр синхротронного излучения (Е8КР, г. Гренобль, Франция) за предоставленную возможность использования синхротронного излучения, и персонально Андрю Мак-Карти за помощь в проведении эксперимента на станции ВМ29.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Matias, P.M. Crystal structure of the human AAA+ protein RuvBLl [Text] / P.M. Matias, S. Gorynia, P. Donner, M.A. Carrondo // J. Biol. Chem. - 2006. - Vol. 281. - № 50.
- P. 38918-38929.
2. Huen, J. Rvb1-Rvb2: essential ATP-dependent helicases for critical complexes [Text] / J. Huen, Y. Kakihara, F. Ugwu [et al.] // Biochem. Cell Biol.
- 2010. - Vol. 88. - № 1. - P. 29-40.
3. Niewiarowski, A. Oligomeric assembly and interactions within the human RuvB-like RuvBLl and RuvBL2 complexes [Text] / A. Niewiarowski, A.S. Bradley, J. Gor [et al.] // Biochem. J. - 2010.
- Vol. 429. - № 1. - P. 113-125.
4. Petukhov, M. Large-scale conformational flexibility determines the properties of AAA+ TIP49 ATPases [Text] / M. Petukhov, A. Dagkessamanskaja, M. Bommer [et al.] // Structure. - 2012. - Vol. 20.
- № 8. - P. 1321-1331.
ЛЕБЕДЕВ Дмитрий Витальевич — старший научный сотрудник НИЦ «Курчатовский институт» Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова. 188300, Ленинградская обл., г. Гатчина, Орлова роща dtry@omrb.pnpi.spb.ru
СОКОЛОВА Мария Леонидовна — студентка Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.
195251, г. Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29 arimiora@gmail.com
ФЕДОРОВА Яна Витальевна — студентка Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.
195251, г. Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29 kedrovka126@rambler.ru
ПОБЕГАЛОВ Георгий Евгеньевич — аспирант кафедры биофизики Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.
195251, г. Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29 lwdrums@gmail.com
ЧЕРВЯКОВА Дарья Борисовна — научный сотрудник НИЦ «Курчатовский институт» Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова. 188300, Ленинградская обл., г. Гатчина, Орлова роща darya.dcd@gmail.com
ЛАНДА Сергей Борисович — старший научный сотрудник НИЦ «Курчатовский институт» Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова. 188300, Ленинградская обл., г. Гатчина, Орлова роща sergey. landa@gmail. com
ХОДОРКОВСКИЙ Михаил Алексеевич — кандидат физико-математических наук, ведущий научный сотрудник, директор НИК «Нанобиотехнологии» Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.
195251, г. Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29 khodorkovskii@mail.ru
© Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, 2013
