CC BY
15©Коллектив авторов, 2019 Вопросы онкологии, 2019. Том 65, № 1
УДК 616.441-006
П.о. румянцев1, П.А. никифорович1, А.А. Полозников2, А.Ю. Абросимов1, В.А. Саенко3, т.и. рогунович3, А.А. Будзин45, А.П. Поляков2, А.д. Каприн2, и.и. дедов1,5
Мутация BRAFV600E при папиллярном раке щитовидной железы. клинические и методологические аспекты
1ФгБу «НМиЦ эндокринологии» Минздрава россии, Москва, 2ФгБу «НМиЦ радиологии» Минздрава россии, Москва, 3университет Нагасаки, институт радиоиндуцированных заболеваний, сакамото, Нагасаки, япония 4ФгбуН «институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» рАН,
Москва,
5ФгАОу ВО «первый московский государственный медицинский университет имени и.М. сеченова» Министерства здравоохранения российской Федерации, Москва
Мутация BRAFV600E специфична для папиллярного рака щитовидной железы (прЩЖ) и определяется в опухолевых клетках в 40-70% случаев. патогномонич-ность мутации BRAFV600E прЩЖ позволяет определять случаи анапластической карциномы, трансформировавшейся из папиллярной карциномы, составляющие до половины случаев, и персонализировать отбор пациентов на таргетную терапию мульти-киназными ингибиторами. имеются данные о влиянии мутации BRAFV600E на клиническое течение и ответ на терапию радиоактивным йодом, требующие углубленных доказательных исследований. существующие методики определения мутации BRAFV600E обладают различной точностью, доступностью и стоимостью. накладываются и другие методические аспекты, связанные с пробоподготовкой биологическим материала, качеством реактивов, кросс-валидацией результатов исследования. В данном обзоре на основании собственного опыта и литературных данных уточнены показания к определению мутации гена BRAFV600E в клинической практике, проведен комплексный сравнительный анализ современных методик исследования. обзор ориентирован на широкий круг разнопрофильных специалистов: онкологов, эндокринологов, радиологов, патологов, биологов.
ключевые слова: мутация BRAFV600E, рак щитовидной железы, молекулярная диагностика, персонализированная медицина
Введение
Мутация гена BRAFV600E строго специфична (патогномонична) для папиллярного рака щитовидной железы (ПРЩЖ) с частотой встречаемости 40% — 70% [22, 45, 46]. При недифференцированной (анапластической) карциноме
щитовидной железы данная мутация определяется в 25% — 48% случаев, подтверждая развитие последней из папиллярной карциномы [32, 38]. Это создает хорошие предпосылки для использования анализа мутации BRAFV600E в диагностических и этиологических целях.
Клиническая значимость BRAFV600E непосредственно связана с тем, что ее присутствие однозначно указывает на злокачественный характер новообразования щитовидной железы [1, 2]. Это предоставляет возможность, прежде всего, уточнить предоперационный диагноз в случаях неопределенного или промежуточного результата цитологического исследования материала тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ) и принять решение о необходимости хирургического вмешательства.
Прогностическое значение мутации BRAFV600E спорно. Одни исследования подтверждают негативное влияние наличия мутации на клиническое течение и выживаемость пациентов [5, 47], другие — ее отрицают [35].
Причинами противоречивости результатов могли быть различные биологические образцы, а также методы определения BRAFV600E. Для примера, биоматериал для исследования Fnais et al. (2015) — тонкоигольная аспирационная биопсия (ТАБ); Xing et al. (2007) — парафиновые блоки) [45]. Методы анализа (секвенирование по Сэнгеру, секвенирование нового поколения (NGS), ИГХ, rtPCR, ddPCR) — также чрезвычайно разнообразны.
По данным литературы, мутации BRAFV600E при ПРЩЖ коррелирует с более агрессивным фенотипом и более высокой клинической стадией опухоли [47]. В ряде исследований, включая наши собственные, BRAFV600E имела прогностическое значение, повышая вероятность рецидива ПРЩЖ [4, 6].
В 2015 году в клинических рекомендациях американской тиреодологической ассоциации (ATA) мутации BRAFV600E и TERT описаны как
неблагоприятные факторы клинического прогноза [36, 47]. В 2018 году принята новая (8-я) редакция классификации ТКМ, в которой мутация BRAFV600E также отнесена к независимым факторам неблагоприятного прогноза ПРЩЖ [11].
Методы определения клинически значимых мутаций в онкологии непрерывно совершенствуются, уточняется их роль в патогенезе опухоли и влиянии на ее клинико-патологические характеристики. Современные принципы доказательной медицины требуют постоянного критического анализа и обобщения накопленного лабораторного и клинического опыта. В настоящей работе мы проводим обзор данных о мутации BRAFV600E при раке щитовидной железы, уделяя особое внимание методологическим подходам к ее определению и прикладным клиническим аспектам.
Распространенность мутации BRAFV600E при ПРЩЖ
Мутация BRAFV600E — точковая активирующая онкомутация, патогномоничная для ПРЩЖ
[22,45,46]. Помимо мутации BRAFV600E, в опухолях щитовидной железы в единичных случаях описаны другие мутации гена BRAF (V600K, V600R, V600D, K601E), но они либо не патог-номоничны для ПРЩЖ, либо их этиопатологи-ческая роль пока не выяснена [12].
Ген BRAF кодирует киназу семейства RAF тирозинкиназного сигнального пути RAS-RAF-MEK-ERK, так называемого митоген-активируе-мого протеинкиназой (МАРК, Mitogen-Activated Protein Kinase) каскадом. Точковая соматическая мутация T1799A локализуется в 15-м экзоне В-изоформы гена RAF-киназы (отсюда название гена «BRAF») и заключается в замене тимин-со-держащего нуклеотида на аденин-содержащий, приводя к замене валина на глютаминовую кислоту в 600-м аминокислотном остатке молекулы белка [30].
мутация BRAFV600E встречается при мела-номе (50-60%) [28], реже — при раке прямой кишки (10%) и еще реже (3%) — при раке легкого. Доказана эффективность селективных таргетных кинзаных ингибиторов для BRAF-положительных случаев меланомы (Вемурафе-ниб, Дабрафениб) [15, 40, 41].
Рис. 1. МАР-киназный сигнальный каскад в норме и при наличии мутации BRAFVвшE [45]
Молекулярные механизмы канцерогенеза, опосредуемые мутацией
Как показано на рис. 1, мутация BRAFV600E активирует канцерогенез посредством гиперактивации МАРК сигнального пути, вызывающего изменения в экспрессии ряда генов, что в конечном итоге стимулирует пролиферацию опухолевых клеток, повышает их выживаемость и злокачественный потенциал [45].
По данным Li et а1. (2016), пациенты с первичным ПРЩЖ и мутацией BRAFV600E имели одинаковый ответ на терапию радиоактивным йодом 1311 по сравнению с пациентами без мутации [34]. Однако пациенты с рецидивирующим ПрЩж и мутацией BRAFV600E имели ра-диойодрезистентность в 79% случаев, что было в 4 раза чаще, чем у пациентов без мутации [15]. Таким образом, нарушение работы МАР-киназного сигнального каскада вследствие мутации BRAFV600E у пациентов с ПРЩЖ приводит к
повышению вероятности развития резистентности к препаратам радиоактивного йода. Данный процесс вероятно связан с подавлением функциональной активности натрий-йодидного симпор-тера (НЙС) [17]. Патогенетические механизмы ПРЩЖ, связанные с мутацией BRAFV600E, представлены на рис. 2.
принципы определения мутации
Исторически первыми были качественные молекулярные методы: прямое секвенирование по Сэнгеру и различные варианты конечно-точ-ковой полимеразно-цепной реакции (ПЦР). В последнее время предпочтение отдается новым методам, которые позволяют выявить мутацию BRAFV600E не только качественно (Да/Нет), но и количественно (количество клеток, содержащих мутацию). К таким методам относятся секвени-рования нового поколения- NGS (Next Generation Sequencing), ПЦР в реальном времени (qPCR) и
Рис. 2. Молекулярные изменения и патогенетические пути, связанные с BRAF мутацией при ПРЩЖ. Наблюдается гиперэкспрессия VEGF, MMPs, ^-кВ и с-Ме^ способствующих пролиферации опухолевых клеток, повышению их устойчивости к неблагоприятным воздействиям и инвазии с одновременным снижением экспрессии опухоль-супрессорных генов и нарушением функции тиреоидных
йод-метаболизирующих молекул [45]
капельная цифровая ПЦР (ddPCR). Относительно недавно стала доступной методика на основе иммуногистохимического окрашивания (ИГХ). Каждый из этих методов обладает определенными достоинствами и недостатками, зависит от качества реактивов и соблюдения стандартов, но нуждается в кросс-валидации, особенно при изначальной постановке [23].
При использовании молекулярных методов можно обходиться минимальным количеством биологического материала, однако все они чувствительны к его качеству, прежде всего к соотношению опухолевых и прочих клеток. результаты молекулярного исследования фиксированной в формалине и свежезамороженной ткани могут существенно отличаться, прежде всего из-за деградации ДНК [38]. ИГХ-метод также может давать вариабельные результаты в зависимости, например, от длительности фиксации ткани в формалине, способов демаскирования антигена и надежности используемого первичного антитела [4].
Рекомендации ATA, NCCN, ESMO не учитывают качество и тип методики используемой для определения статуса гена BRAF [26]. На наш взгляд, причиной вариабельности результатов определения BRAFV600E в различных лабораториях является отсутствие клинически-обоснованных алгоритмов и единых методологических стандартов, диапазона референсных значений, способов исключения ложно-отрицательных и ложно-положительных результатов. Использование методов с различной чувствительностью и специфичностью к определению мутации может быть причиной получения разных результатов исследования даже у одного и того же пациента [31].
Другим важным аспектом исследований является применение стандартизованных контрольных образцов. Для гистологических исследований коммерчески доступны как образцы, содержащие мутацию BRAFV600E, так и ткани, содержащие BRAF дикого типа (например, «Horizon Discovery Group», Кэмбридж, Великобритания). Для проведения молекулярных исследований применяются образцы ДНК, выделенные из клеточных линий. В качестве отрицательного контроля может быть использована ДНК, выделенная из клеточной линии HEK293 [13], а в качестве положительного контроля — из клеточных линий A375 [25] или HT29 [16]. Применение такого типа контролей, полученных непосредственно в лабораториях, в рутинных исследованиях и, что особенно важно, при первичной постановке методик может быть причиной систематических ошибок. Поэтому необходимо проводить регулярную межлабораторную верификацию полученных результатов. В настоящее
время существует несколько некоммерческих организаций, целью которых является стандартизация молекулярных исследований, такие как Cancer ID (https://www.cancer-id.eu/) и Европейская сеть по качеству молекулярно-генетиче-ских исследований EMQN (https://www.emqn. org). Эти организации позволяют осуществлять обмен образцами между лабораториями-участниками, обладающими различной приборной базой, и, таким образом, по результатам слепого тестирования стандартизировать молекулярные исследования.
Для повышения надежности любой методики рекомендуется:
Сравнение с результатом альтернативного метода определения мутации. При противоречивых результатах целесообразен анализ "третейским" методом (который может быть дороже или более трудозатратным), но обладающим наибольшей точностью (оптимальный баланс чувствительности и специфичности).
Тщательная пробоподготовка с подтверждением качественного состава образца.
Выбор наименьших размеров ампликонов для ПЦР-зависимых методик для снижения частоты ошибки, связанной с деградацией ДНК.
Непрерывная валидация методики за счет участия в исследованиях "Лучшей практики" («Best Practice») и наличии выборочного внешнего контроля качества.
способы получения образцов и методы определения мутации
Существуют следующие варианты получения клеточного материала для определения мутации BRAFV600E
цитологический материал, полученный из опухоли путем тонкоигольной аспирационной биопсии (тАБ). Существуют два варианта про-боподготовки: исследование соскоба со стекла после цитологического исследования и анализ смыва пункционной иглы.
В первом случае материала для исследования больше, а также возможен селективный отбор участков, содержащих преимущественно или исключительно клетки опухолевого эпителия; при этом, однако, цитологический препарат становится непригодным для пересмотра (мазок соскабливается), в связи с чем желательно предварительное архивирование изображения.
Анализ смыва пункционной иглы при морфологическом подтверждении диагноза по цитологическому препарату. При этом способе биоматериала меньше, но вполне достаточно для исследования и цитологический препарат сохраняется. При этом используется остаточный биоматериал в просвете пункционной иглы, ко-
торый обычно попадает в отходы. Для контроля качества биологического образца (наличие и количество клеток опухоли щитовидной железы) целесообразно определять в нем уровень цито-кератина-19.
Парафиновый блок для гистологического исследования.
Стандартный способ сохранения гистологического материала. В основе метода лежит фиксация ткани в формалине с последующим обезвоживанием и заливкой в парафин. образец необходимо помещать в фиксирующий раствор немедленно после взятия, поскольку важно, чтобы кусочки оставались нефиксированными возможно более короткое время. Флаконы с материалом следует содержать при температуре не менее 4°С. При отложенной фиксации аутоли-тические изменения ткани начинается сразу после того, как ткань лишается кровоснабжения. Преимуществом является то, что биологический образец может храниться длительно при комнатной температуре [3, 25]. Участок опухоли для исследования маркируется под микроскопическим контролем по соответствующему срезу на стекле.
Криоконсервированный образец опухоли (биобанк).
Самым надежным и изученным методом длительного сохранения нативных биологических образцов является глубокая заморозка [27]. Сохранение структуры ткани происходит с помощью криогенной консервации при температуре от -80 до -196 С. Данная технология применяется при создании биобанка/криобанка [7]. В дальнейшем материал можно использовать по требованию вне зависимости от временного интервала.
Жидкостная биопсия крови (Liquid Biopsy) — фракционирование мононуклеаров крови, в том числе циркулирующих опухолевых клеток (при их наличии в крови), циркулирующих в крови фрагментов ДНК и РНК. метод может быть дополнением или альтернативой биопсии опухоли. Забор крови является рутинной малоинвазивной процедурой с хорошим качеством биологического материала, что позволяет применять его для выявления генетических «следов» опухоли в крови в процессе первичной диагностики, лечения и последующего наблюдения [33]. Появление фрагментов опухолевой ДНК в крови связано, вероятно, с гибелью опухолевых клеток в первичном и/или метастатических очагах с попаданием их генетического материала в кровь. Циркулирующая опухолевая ДНК представляет собой очень малую часть фракции ДНК крови, как правило, менее 0,01% и может значительно изменять свой титр в зависимости от течения процесса
и ответа опухоли на лечение [19]. Для жидкостной биопсии рекомендуется использовать плазму крови.
Методы определения мутации BRAFV600E:
Секвенирование по Сэнгеру является последовательным молекулярным анализом — один анализ, один ген. Время выполнения анализа, включающего несколько генов, может составлять несколько дней. точность исследования может варьировать в пределах +/- 15%. Применяется при определении точковых мутаций при отсутствии других инструментов определения. Существенным недостатком, помимо длительности, является низкая чувствительность метода. Надежное выявление мутации возможно в образцах, содержащих не менее 5-10% опухолевой ДНК.
Секвенирование нового поколения (NGS). Позволяет «прочитать» одновременно сразу несколько участков генома, что является главным отличием от более ранних методов сек-венирования. Основной метод, применяемый в современных исследованиях и создании баз данных. обладает большей чувствительностью по сравнению с секвенированием по Сэнге-ру. Минимально необходимое количество ДНК в препарате составляет 10-40 нг. Кратчайший срок выполнения исследования — 3 часа, но, как правило, занимает несколько дней. точность определения варьирует в пределах +/- 2-5%. может применяться для выполнения жидкостной биопсии крови. Преимуществом является возможность поиска неизвестных мутаций, в то время как прочие методы определяют уже известную искомую мутацию. Однако метод является более затратным по сравнению с другими. В силу дороговизны его использование оправдано в случаях параллельного определения набора мутаций, что реализовано, например, в коммерческих молекулярных канцер-панелях, или при наличии большого количества образцов (мультиплексирование).
Количественная Пцр (qPCR) или Пцр в реальном времени (Real time PCR, rtPCR). Включает в себя одновременно детекцию и количественное определение (измерение абсолютного количества копий, либо измерение количества копий относительно внесённой ДНК или дополнительных калибровочных генов) целевой последовательности ДНК в образце. Выявление наличия искомой мутации происходит с использованием флюоресцентных зондов специфичных к измененной последовательности и последовательности дикого типа. Основным преимуществом метода является высокая чувствительность. Контаминация проб может повышать частоту ложноположительных и ложноотрица-тельных ответов.
цифровая капельная Пцр (ddPCR). Усовершенствованный метод полимеразной цепной реакции. Позволяет провести точную (вплоть до 1 копии на 100 000) количественную оценку представленности определенного участка ДНК в образце. Отсутствует необходимость в использовании калибровочных кривых, хотя это и может быть реализовано в случае необходимости. Чувствительность системы и ее высокая точность дает возможность определения даже редких мутаций, что особенно важно при анализе биопсии крови. Для получения результата достаточно нескольких десятков пикограмм ДнК, что в тысячи раз меньше, чем нужно для NGS.
Нммуногистохимическое исследование (НгХ) с антителами к BRAF. Моноклональное антитело (УБ1) связывается с белком, образующимся в результате мутации BRAFV600E. Относительно быстрая и относительно недорогая "ручная" методика; существуют также коммерческие наборы реактивов для автоматического окрашивания. Возможен анализ цитологического материала.
Основные методы определения мутации BRAFV600E в биологических образцах различного типа приведены в табл. 1. В табл. 2 приводятся характеристики методов.
клиническое значение мутации BRAFV600E при подозрении на установленном рЩЖ
Как показано на рис. 3, определение мутации BRAFV600E может быть рекомендовано в следующих целях:
Дифференциальная диагностика опухолей щитовидной железы неизвестного потенциала злокачественности [37].
• С учетом патогномоничности для ПРЩЖ определение мутации BRAFV600E улучшает точность цитологической диагностики опухолей ЩЖ, особенно при неопределенном цитологическом заключении "фолликулярной опухоли" и клеточной атипии (Bethesda IV и III, соотв.); часто-
Таблица 1. Сравнительная оценка методик определения мутации BRAFV600E и исследуемого материала
Методика Цитология/ Смыв пукнционной иглы Гистологический материал Жидкостная биопсия (кровь) Преимущества Недостатки
Количественная (в реальном времени) ПЦР/ ^РСЯ, ПРСЯ) + + - Низкая стоимость и высокая доступность Снижение точности при деградации материала из-за низкого по сравнению с другими методами предела обнаружения
Приемлемая чувствительность и специфичность для одиночного сиквенса
Цифровая капельная ПЦР / №РСЯ) + + + Более высокая чувствительность и специфичность по сравнению с qПЦР Выявление мутаций ограничено набором типовых реагентов
Деградация материала не снижает точность исследования
Высокая точность при жидкостной биопсии
Относительно дешевый метод
Секвенирование нового поколения (NGS) + + + одновременное определение множественного количества генов Дорогостоящее, длительное и трудоемкое исследование
Секвенирование по Сэнгеру (Сэнгер) + + - Наиболее доступный и изученный метод Один цикл/одна мутация Длительность Качественный тест
ИПХ - + - Высокоспецифичный метод определения единичной мутации Высокое требование к качеству реагентов и исполнения
Таблица 2. Сравнение основных характеристик методов выявления BRAFV600E
Параметр теста Сенгер NGS ИГХ q(rt)PCR ddPCR
Что исследуется 15 экзон 15 экзон белок (продукт V600E) мутация V600E мутация V600E
Время исследования 1-3 дня 3-5 дней 2-3 часа 8 часов 8 часов
Минимальное количество материала, нг 100-250 > 10 3-4 20 > 2
Частота ошибок, в среднем 4% 5% 3% 3% 3%
Себестоимость, доллары США/рубли 175/11 375 275/17 875 125/8 125 30/1 950 45/2 925
та мутации в клинической практике достигает 40% [10].
• При неинформативности цитологического заключения при наличии данных (пальпация, УЗИ-TIRADS, ассиметрично увеличенные лимфоузлы на стороне опухоли).
• Подозрение на метастазазирование в щитовидную железу другой карциномы или подозрение на лимфому щитовидной железы.
Послеоперационное определение в гистологических блоках (а лучше в нативном материале опухоли/метастазов):
• Определение группы клинического риска рецидива дифференцированного рака щитовидной железы (по критериям ATA 2015).
• Прогноз развития радиойодрезистентности
оценка ответа на лечение
• ответ опухоли на проводимое лечение после операции, терапии радиоактивным йодом с помощью жидкостной биопсии.
• При прогрессировании опухолевого процесса — пунктирование всех очагов поражения с описанием экспрессии мутации гена в каждом из них.
определение мутации в ургентных клинических ситуациях (при анапластическом раке щитовидной железы) для начала системной таргетной терапии [8]. В клинической практике значение имеет не только точность метода, но иногда и возможность срочного выполнения анализа по жизненным показаниям. Так, при анапластическом раке щитовидной железы скорость прогрессирования опухоли и угроза жизни пациенту настолько высоки, что дорог буквально каждый день. В такой ситуации предпочтение отдается наиболее доступному и быстрому тесту на наличие мутации BRAFV600E, поэтому предпочтительны ИГх с жидкостной цитологией пунктата [44]. При положительном результате теста пациенту можно предложить лечение комбинацией селективного ингибитора BRAFV600E дабрафениба и траметиниба, доказавших свою эффективность и одобренных FDA (оба препарата зарегистрированы в РФ) [44]. В отсутствии лечения АРЩЖ прогноз краткосрочной фатальности чрезвычайно высок.
Доказательств необходимости учета BRAFV600E статуса при выборе объема хирургического лечения ПРЩЖ пока недостаточно. В настоящий момент не выявлено корреляции наличия му-
рис. 3. Алгоритм обследования на наличие мутации BRAFVв00E на различных этапах и в различных клинических ситуациях
Рис. 4. Главные аспекты клинической релевантности мутации BRAF"60
тации BRAFV600E с увеличением объема операции на щитовидной железе до тиреоидэктомии у пациентов с низким риском рецидива. также не выявлено корреляции наличия мутации и выполнением центральной лимфодиссекции [14].
В других работах, напротив, выявлена прямая зависимость наличия мутации BRAFV600E при ПРЩЖ с более агрессивным типом опухоли: метастазирование (регионарное/отдаленное), выход опухоли за капсулу щитовидной железы и повышение частоты регионарных рецидивов [48].
В группе пациентов с низким риском рецидива и интратиреоидной опухолью (<4 см, N0, M0; 33% пациентов имели мутацию BRAFV600E), общий риск рецидива опухоли в течение 5 лет составил 3% [21]. При этом в подгруппе пациентов с наличием мутации BRAFV600E частота рецидива составила 8% (8 из 106) по сравнению с 1% (2 из 213) в группе BRAFV600E-негативных опухолей [21]. При многофакторном анализе мутация BRAFV600E оказалась единственным независимым предиктором рецидива опухоли после 5 лет наблюдения [21].
В результате мета-анализа выявлено неблагоприятное влияние мутации BRAFV600E при ПРЩЖ на частоту положительного результата ПЭТ/КТ с ФДГ (OR 2,12, 95%ДИ 1,53-3,0) в сравнении с отсутствием мутации [42].
По данным Dunn et al. (2018), применение селективного BRAF-ингибитора Вемурафениба привело в ряде случаев к восстановлению спо-
собности к накоплению йода ранее радиойодре-зистентных очагов опухоли щитовидной железы и положительным ответом на проведение повторной терапии 1311 при наличии исходной мутации BRAFV600E в клетках опухоли. Важное значение в выборе пациентов для данной терапии имел уровень тиреоглобулина: при уровне ТГ <7 нг/мл вероятность ответа на таргетную терапию была низкой [20].
При обнаружении мутации BRAFV600E необходимо на предоперационном этапе (УЗИ, ТАБ со смывом из иглы на тиреоглобулин) более внимательно оценивать распространенность опухоли и планировать адекватный объем операции на щитовидной железе и регионарном лимфатическом коллекторе, тактику дальнейшего ведения.
Мутации BRAFV600E, особенно в сочетании с мутациями ТБКГС228Т,С250Т при дифференцированном раке щитовидной железы, имеют не только диагностическое, но и прогностическое значение, что необходимо учитывать при выборе тактики ведения пациентов [18, 24, 29, 36, 3439, 43, 47].
При наличии достаточно противоречивых данных необходимо уделять больше внимания оценке распространенности опухоли на предоперационном этапе (УЗИ, ТАБ со смывом из иглы на тиреоглобулин), особенно при положительном статусе BRAFV600E, что способствует выбору адекватного объема операции на щитовидной железе и регионарном лимфатическом коллекторе в каждом конкретном случае.
Заключение
Мутация BRAFV600E является патогномонич-ной для ПРЩЖ. Учитывая накопленный в мире опыт клинических исследований, а также рекомендации международных онкологических сообществ (ATA, NCCN, UICC), определение данной мутации целесообразно при дополнительном диагностическом тестировании на предоперационном (цитология: Bethesda III-IV) и послеоперационном (гистология) этапах при опухолях неизвестного потенциала злокачественности.
Накоплена доказательная база того, что наличие мутации BRAFV600E является прогностически неблагоприятном фактором, повышающим вероятность резистентности очагов опухоли к терапии радиоактивным йодом, что необходимо учитывать при выборе тактики ведения пациентов.
определение мутации BRAFV600E в опухоли целесообразно для:
Дифференциальной диагностики опухолей ЩЖ на предоперационном (в дополнение к цитологическому заключению Bethesda III и IV) и послеоперационном этапе гистологической диагностики (опухоль неопределенного потенциала злокачественности).
Уточнения группы клинического риска рецидива ПРЩЖ;
оценки вероятности резистентности к терапии радиоактивным йодом;
Отбора пациентов с ПРЩЖ и АРЩЖ на тар-гетную терапию BRAF-ингибиторами (Дабрафе-ниб, Вемурафениб).
В различных клинических ситуациях имеет значение срочность выполнения анализа. Так, при анапластическом раке щитовидной железы, ввиду высокой агрессивности карциномы требуется срочный (1-2 дня) анализ мутации BRAFV600E с целью определения показаний к таргетной терапии. В других клинических ситуациях время на ожидание результата анализа, как правило, имеется.
На данный момент в России для определения мутации BRAFV600E применяется метод rtPCR и секвенирование по Сэнгеру или NGS. В мире превалируют более точные методы, такие как ddPCR и ИГХ, а для повышения точности — комбинации различных методов. Методом, гармонично сочетающим в себе точность, удобство и относительную дешевизну является ddPCR, однако сегодня он малодоступен в РФ. Проведенный в статье анализ информативности методик определения мутации BRAFV600E позволяет полагать, что оптимальным выбором являются ddPCR и ИГх при обеспечении должного контроля качества.
Внедрение в клиническую практику надежных методов определения мутации BRAFV600E
позволит улучшить диагностику и оценку клинического прогноза пациентов с ПРЩЖ, подбирать кандидатов на таргетную терапию МКИ при радиойод-резистентном ПРЩЖ или АРЩЖ по срочным жизненным показаниям. Необходимо внедрять в клиническую практику наиболее точные методы определения онкомутаций, создавать референсные центры для кросс-валидации результатов с целью совершенствования персонализированной медицины. Востребованы мультицентровые рестроспективные и проспективные исследования, позволяющие повысить прикладное значение онкогенетики.
ЛИТЕРАТУРА
1. Васильев Е.В., Румянцев П.О, Саенко В.А. и др; Молекулярный анализ структурных нарушений генома папиллярных карцином щитовидной железы // Молекулярная биология. - 2004. - Т. 38. — № 4. - С. 642-653.
2. Васильев Е.В., Румянцев П.О, Саенко В.А. и др. Ради-ационно-индуцированные опухоли: диагностика молекулярной патологии в различных формах рака щитовидной железы // Вестник научно-исследовательского института молекулярной медицины. Молекулярная медицина и безопасность. — Выпуск 4. — С. 55-73.
3. Мальков П.Г., Франк Г.А. Основы обеспечения качества в гистологической лабораторной технике. — Москва, 2011.
4. Сидорин АВ. Абросимов А.Ю. и др. Клинические, морфологические и прогностические особенности папиллярного рака щитовидной железы с различным статусом BRAF, установленным иммуногистохимическим методом // Архив патологии. — 2018. — С. 19-25.
5. Поляков А.П., Волченко Н.Н., Славнова Е.Н. и др. Влияние статуса гена BRAF на выбор тактики хирургического лечения высокодифференцированного рака щитовидной железы // Опухоли головы и шеи. —
2016. — Т. 6. — № 4. — С. 45-48.
6. Румянцев П.О., Залетаев Д.В., Васильев Е.В. и др. Анализ частоты соматических мутаций генов BRAF и RET в папиллярном раке щитовидной железы // Вопросы онкологии. — 2006. — Т. 52. — № 2. — С. 145-149.
7. Румянцев П.О., Мудунов А.М. Биобанкинг в онкологии и радиологии // Эндокринная хирургия. — 2017. — Т. 11. — № 4.
8. Agarwal R, Wang J, Wilson K et al. Response to Targeted Therapy in BRAF Mutant Anaplastic Thyroid Cancer // J. Natl. Compr. Canc. Netw. — 2016. — Vol. 14(10). — P. 1203-1207.
9. Barollo S., Pennelli G., Vianello F. et al. BRAF in primary and recurrent papillary thyroid cancers: the relationship with (131)I and 2-[(18)F]fluoro-2-deoxy-D-glucose uptake ability // Eur. J. Endocrinol. — 2010. — Vol. 163(4). — P. 659-663. — doi: 10.1530/EJE-10-0290.
10. Baier N.D., Hahn P.F., Gervais D.A. et al. Fine-needle aspiration biopsy of thyroid nodules: experience in a cohort of 944 patients // AJR Am. J. Roentgenol. — 2009. — Vol. 193(4). — P. 1175-1179. — doi: 10.2214/AJR.08.1840.
11. James D. Brierley, Mary K. Gospodarowicz, Christian Wittekind. TNM Classification of Malignant Tumours,
2017. — 272 p.
12. COSMIC;Lovly et al. 2012; Rubinstein et al. 2010.
13. Chat-Uthai N., Vejvisithsakul P., Udommethaporn S. et al. Development of ultra-short PCR assay to reveal BRAF V600 mutation status in Thai colorectal cancer tissues // PLoS One. - 2018. -Vol. 13(6). - P. e0198795. - doi: 10.1371/journal.pone.0198795.
14. CarrieC.Lubitz, Sareh Parangi, Tammy M.Holm et al. Detection of Circulating BRAFV600E in Patients with Papillary Thyroid Carcinoma // J. Mol. Diagn. — 2016. — Vol. 18(1). — P. 100-108.
15. Dabrafenib. Summary of Product Characteristics, 2015.
16. Dahse R., Kromeyer-Hauschild K., Berndt A. et al. No incidence of BRAF mutations in salivary gland carcinomas—implications for anti-EGFR therapies // J. Biomed. Biotechnol. — 2009. — Vol. 2009. — P. 501736. — doi: 10.1155/2009/501736.
17. Dong H. et al. Effects of BRAF(V600E) mutation on Na(+)/I(-) symporter expression in papillary thyroid carcinoma // J. Huazhong Univ. Sci. Technolog Med. Sci. — 2016. — Vol. 36(1). — P. 77-81. -doi: 10.1007/s11596-016-1545-3.
18. Dobashi Y, Sugimura H., Sakamoto A. et al. Stepwise participation of p53 gene mutation during dedifferentiation of human thyroid carcinomas // Diagn. Mol. Pathol. — 1994. — Vol. 3. — P. 9-14.
19. Diehl F., Li M., Dressman D. et al. Detection and quantification of mutations in the plasma of patients with colorec-tal tumors // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. — 2005. — Vol. 102(45). — P. 16368-16373.
20. Dunn L.A., Sherman E.J., Baxi S.S. et al. Vemurafenib redifferentiation of BRAF mutant, RAI-refractory thyroid cancers // J. Clin. Endocrinol. Metab. — 2018. — doi: 10.1210/jc.2018-01478.
21. Elisei R., Viola D., Torregrossa L. et al. The BRAF(V600E) mutation is an independent, poor prognostic factor for the outcome of patients with low-risk intrathyroid papillary thyroid carcinoma: single-institution results from a large cohort study // J. Clin. Endocrinol. Metab. — 2012. — Vol. 97. — P. 4390-4398.
22. Forbes S.A., Beare D., Gunasekaran P. et al. COSMIC: exploring the world's knowledge of somatic mutations in human cancer // Nucleic. Acids. Res. — 2015. — Vol. 43. — P. D805-D811.
23. Gonzalez D. et al. BRAF mutation testing algorithm for vemurafenib treatment in melanoma: recommendations from an expert panel // British Journal of Dermatology. — 2013. — Vol. 168(4). — P. 700-707. — doi: 10.1111/ bjd.12248.
24. Garcia-Rostan G., Costa A.M., Pereira-Castro I. et al. Mutation of the PIK3CA gene in anaplastic thyroid cancer // Cancer Res. — 2005. — Vol. 65. — P. 10199-10207.
25. Guibert N., Pradines A., Casanova A. et al. Detection and Monitoring of the BRAF Mutation in Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA in BRAF-Mu-tated Lung Adenocarcinoma // J. Thorac. Oncol. — 2016. — Vol. 11(9). — P. e109-12. — doi: 10.1016/j. jtho.2016.05.001
26. Haugen B.R., Alexander E.K., Bible K.C. et al. 2015Ameri-canThyroid Association Management Guidelines for Adult Patients with Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer: The American ThyroidAssociation Guidelines Task Force on Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer. Thyroid: official journal of the American Thyroid Association // Thyroid. — 2016. — Vol. 26(1). — P. 1133. — https://doi.org/10.1089/thy.2015.0020.
27. Hainaut P., Vaught J., Zatloukal K., Pasterk M. Banking of Human Biospecimens. Switzerland: Springer, 2017. — 239 p.
28. Holderfield M., Deuker M.M., McCormick F. et al. Targeting RAF kinases for cancer therapy: BRAF-mutated melanoma and beyond // Nature Reviews Cancer. — 2014. — Vol. 14. — P. 455-467.
29. Hou P., Liu D., Shan Y et al. Genetic alterations and their relationship in the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in thyroid cancer // Clin. Cancer Res. — 2007. — Vol. 13. — P. 1161-1170.
30. Knauf J.A., Ma X., Smith E.P. et al. Targeted expression of BRAFV600E in thyroid cells of transgenic mice results in papillary thyroid cancers that undergo dedifferentiation // Cancer Res. — 2005. — Vol. 65. — P. 4238.
31. Kowalik A., Kowalska A., Walczyk A. et al. Evaluation of molecular diagnostic approaches for the detection of BRAF p.V600E mutations in papillary thyroid cancer: Clinical implications // PLOS ONE. — 2017. — https://doi. org/10.1371/journal.pone.0179691.
32. Landa I., Ibrahimpasic T., Boucai L. et al. Genomic and transcriptomic hallmarks of poorly differentiated and anaplastic thyroid cancers // J. Clin. Invest. — 2016. — Vol. 126. — P. 1052-1066.
33. Lim J. S. J., Janku F., Yap T.A. Circulating tumor DNA— From bench to bedside // Current Problems in Cancer. — 2017. — Vol. 41 (3). — P. 212-221.
34. Li J., Liang J. Noninferior response in BRAFV600E mutant nonmetastatic papillary thyroid carcinoma to radioiodine therapy // Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. — 2016. — Vol. 43(6). — P. 1034-9. — doi: 10.1007/s00259-015-3305-1.
35. Liu R.T., Chen YJ., Chou F.F. et al. No correlation between BRAFV600E mutation and clinicopathological features of papillary thyroid carcinomas in Taiwan // Clin. Endocrinol. (Oxf). — 2005. — Vol. 63(4). — P. 461-466.
36. Liu X., Qu S., Liu R. et al. TERT promoter mutations and their association with BRAF V600E mutation and aggressive clinicopathological characteristics of thyroid cancer // J. Clin. Endocrinol. Metab. — 2014. — Vol. 99. — P. E1130-E1136.
37. NCCN 2018 Thyroid cancer.
38. Rao S.N., Zafereo M., Dadu R. et al. Patterns of treatment failure in anaplastic thyroid carcinoma // Thyroid. — 2017. — Vol. 27. — P. 672-681.
39. Ripoli F., Mohr A., Hammer S. et al. A Comparison of Fresh Frozen vs. Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Specimens of Canine Mammary Tumors via Branched-DNA Assay // Int. J. Mol. Sci. — 2016. — Vol. 17(5). — P. E724.
40. Trametinib. Summary of Product Characteristics, 2015.
41. Vemurafenib. Summary of Product Characteristics, 2014.
42. Santhanam P., Khthir R., Solnes L.B. et al. The relationship of BRAFV600E mutation status to FDG PET/CT avidity in thyroid cancer: a review and meta-analysis // En-docr. Pract. — 2018. — Vol. 24(1). — P. 21-26. — doi: 10.4158/EP-2017-0080.
43. Scott E., Learoyd D., Clifton-Bligh R.J. Therapeutic options in papillary thyroid carcinoma: current guidelines and future perspectives // Future Oncol. — 2016. — Vol. 12. — P. 2603-2613.
44. Subbiah V., Kreitman R.J., Wainberg Z.A. et al. Dabrafenib and Trametinib Treatment in Patients With Locally Advanced or Metastatic BRAF V600-Mutant Anaplastic Thy-
roid Cancer // J. Clin. Oncol. — 2018. — Vol. 36(1). — P. 7-13. — doi: 10.1200/jc0.2017.73.6785.
45. Xing M. BRAF mutation in papillary thyroid cancer: pathogenic role, molecular bases, and clinical implications // Endocrine Rev. — 2007. — Vol. 28. — P. 742-762.
46. Xing M., Alzahrani A.S., Carson K.A. et al. Association between BRAF V600E mutation and mortality in patients with papillary thyroid cancer // JAMA. — 2013. — Vol. 309. — P. 1493-1501.
47. Xing M., Liu R., Liu X. et al. BRAF V600E and TERT promoter mutations cooperatively identify the most aggressive papillary thyroid cancer with highest recurrence // J. Clin. Oncol. — 2014. — Vol. 32. — P.2718-2726.
Поступила в редакцию 18.12.2018 г.
P.O. Rumyantsev1, P.A. Nikiforovich1, A.A. Poloznikov2, A.U. Abrosimov1, V.A. Saenko3, T.I. Rogunovich3, A.A. Budzin45, A.P. Polyakov2, A.D. Kaprin2, I.I. Dedov15
BRAF^*® mutation in papillary thyroid carcinoma. Clinical and methodological aspects
1FGBU «National Medical Research Center of Endocrinology» of the Health Ministry of Russia, Moscow,
2FGBU «National Medical Research Center of Radiology» of the Health Ministry of Russia, Moscow, 3Department of Radiation Molecular Epidemiology, Atomic Bomb Disease Institute, Nagasaki, Japan 4The M.M. Shemyakin-Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences, Moscow, 5I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow
Abstract
Mutation BRAFV600E is highly specific for papillary thyroid carcinoma. It's detected in 40-70% of all papillary thyroid carcinoma cases. Moreover this mutation is noticed in anaplastic carcinoma in 40-50%.This fact gives a chance to select patients and provide targeted therapy with multi-kinase inhibitors in cases of unresectable anaplastic carcinoma. The influence of BRAF V600E mutation for response to radioactive iodine therapy requires more evidence-based research. Existing methods for determining the BRAFV600E mutation have different accuracy, availability and cost. Other methodological aspects are also associated with the sample preparation of biological material, the quality of reagents, and the cross-validation of research results. In this review, on the basis of our own experience and literature data, the indications for determining the mutation of the BRAFV600E gene in clinical practice are refined, and a comprehensive comparative analysis of modern research methods has been conducted. This review is focused on a wide range of specialists of different types: oncologists, endocrinologists, radiologists, pathologists, and biologists.
Key words: BRAFV600E mutation, thyroid cancer, molecular diagnostics, personalized medicine
