Научная статья на тему 'Мутации в гене-супрессоре ТР53 и их связь с особенностями клинического течения рака молочной железы'

Мутации в гене-супрессоре ТР53 и их связь с особенностями клинического течения рака молочной железы Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

476
164
Поделиться
Ключевые слова
РАК МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ / ГЕН-ОНКОСУПРЕССОР ТР53 / МУТАЦИИ / ПРОГНОЗ / BREAST CANCER / TP53 ONCOSUPRESSOR GENE / MUTATIONS / PROGNOSIS

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Денисов Е. В., Литвяков Н. В., Стахеева М. Н., Гарбуков Е. Ю., Слонимская Е. М.

Проведено исследование частоты мутаций гена-супрессора ТР53 в 5, 7 и 8-м экзонах в опухолевой ткани 60 больных раком молочной железы (РМЖ) с использованием SSCP-анализа. Обнаруженная частота мутаций составила 61,7 % (37/60), что согласуется с литературными данными. Показана высокая частота множественных мутаций гена ТР53 51,4 % (19/37), а также ассоциация мутаций в 5-м экзоне с метастатическим поражением регионарных лимфоузлов.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Денисов Е. В., Литвяков Н. В., Стахеева М. Н., Гарбуков Е. Ю., Слонимская Е. М.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

MUTATIONS IN TP53 SUPRESSOR GENE AND THEIR ASSOCIATION WITH BREAST CANCER

The frequency of TP53 supressor gene mutations at exons 5,7 and 8 in tumor tissue of 60 patients with breast cancer was assessed using PCR-SSCP-analysis. The frequency of mutations was 61.7% (37/60) that was in accordance with literature data. High frequency of multiple mutations of TP53 gene and association of mutations at exon 5 with metastatic involvement of regional lymph nodes were shown.

Текст научной работы на тему «Мутации в гене-супрессоре ТР53 и их связь с особенностями клинического течения рака молочной железы»

УДК: 618.19-006.6:575.24

МУТАЦИИ в ГЕНЕ-СУПРЕССоРЕ ТР53 И их связь

с особенностями клинического течения рака

молочной железы

Е.в. денисов12, Н.в. Литвяков1, М.Н. Стахеева1, Е.Ю. Гарбуков1, Е.М. Слонимская1, Е.А. Малиновская1, Н.Н. Бабышкина1, в.Н. Стегний2, Н.в. Чердынцева1

ГУ «НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН»1 Томский государственный университет2

Проведено исследование частоты мутаций гена-супрессора ТР53 в 5, 7 и 8-м экзонах в опухолевой ткани 60 больных раком молочной железы (РМЖ) с использованием SSCP-анализа. Обнаруженная частота мутаций составила 61,7 % (37/60), что согласуется с литературными данными. Показана высокая частота множественных мутаций гена ТР53 - 51,4 % (19/37), а также ассоциация мутаций в 5-м экзоне с метастатическим поражением регионарных лимфоузлов.

Ключевые слова: рак молочной железы, ген-онкосупрессор ТР53, мутации, прогноз.

MUTATIONS IN TP53 SUPRESSOR GENE AND THEIR ASSOCIATION WITH BREAST CANCER E.V Denisov12, N.V Litvyakov1, M.N. Stakheeva1, E.Yu. Garbukov1, E.M. Slonimskaya1, E.A. Malinovskaya1, N.N.

Babyshkina1, V.N. Stegniy2, N.V. Cherdyntseva1 Cancer Research Institute, Tomsk Scientific Center, RAMS'-Tomsk State University2

The frequency of TP53 supressor gene mutations at exons 5,7 and 8 in tumor tissue of 60 patients with breast cancer was assessed using PCR-SSCP-analysis. The frequency of mutations was 61.7% (37/60) that was in accordance with literature data. High frequency of multiple mutations of TP53 gene and association of mutations at exon 5 with metastatic involvement of regional lymph nodes were shown.

Key words: breast cancer, TP53 oncosupressor gene, mutations, prognosis.

Молекулярной основой злокачественных новообразований, формирующихся под влиянием различных неблагоприятных факторов, являются многочисленные генетические нарушения, включающие хромосомные аберрации, мутации и эпигенетические изменения ключевых генов контроля клеточного деления и репарации ДНК, к числу которых относятся гены-супрессоры опухолевого роста. Одним из наиболее хорошо изученных генов-супрессоров является ген TP53 (каталожный номер в базе генов человека ОМ1М № 191117), регулирующий процессы контроля клеточного цикла, апоптоза, репарации ДНК и ангиогенеза [13]. Повреждения гена ТР53 (мутации) приводят к нарушениям указанных процессов и критичны для развития неопла-зии. Соматические мутации гена ТР53 часто встречаются в большинстве злокачественных новообразований человека, а наследственные аберрации ТР53 предрасполагают к развитию широкого спектра ранних раков (синдром Ли-Фраумени) [20].

Наследственный рак молочной железы (РМЖ) диагностируется в 5-10 % случаев,

но только 25 % случаев данного заболевания можно объяснить повреждениями в известных в настоящее время генах (BRCA1, BRCA2, TP53 и др.) [5], что касается спорадических случаев РМЖ, в опухолевых клетках частота мутаций гена ТР53 варьирует от 25 до 86 % в зависимости от стадии процесса и метода детекции [8, 14, 19]. По данным Международного агентства исследования рака (IARC), сформировавшего базу данных по ТР53, общее количество мутаций ТР53 в клеточных линиях и опухолях различных локализаций составляет 24810, при этом 2414 аберраций обнаружено при РМЖ [20]. Преобладающая доля аберраций ТР53 представлена миссенс-мутациями (75 %) в ДНК-связывающем домене, приводящими к аминокислотным заменам в белке р53 и инги-биции его связывания с генами-мишенями. Прочие изменения ТР53 включают в себя инсерции и делеции (9 %), приводящие к сдвигу рамки считывания, нонсенс- (7 %) и сайленс-мутации (5 %), а также другие редко встречающиеся аберрации, модифицирующие функциональные свойства белка онкосупрессора р53 [6,

20]. Мутации в гене ТР53, помимо изменения трансактивационных свойств, могут приводить к ингибированию связывания белка р53 дикого типа с генами-мишенями, а также явлению «gain of function» («приобретение новых функций»), в результате которого происходит индукция экспрессии генов рецепторов ростовых факторов (EGFR, bFGF, VEGF), онкогенов (с-Myc, с-Fos) или взаимодействие с белками-супрессорами р63, р73, ведущее к последующему нарушению запуска апоптотической программы по р53-независимому пути. В опухолевых клетках с мутантным ТР53 также повышена экспрессия генов лекарственной устойчивости (MDR1), что снижает чувствительность опухоли к химиотерапии [13, 22, 23].

Прогностическая значимость мутаций ТР53 при РМЖ была изучена в многочисленных исследованиях. Многими авторами была показана связь аберраций ТР53 с плохим прогнозом, причем мутации, находящиеся в области связывания с ДНК, ассоциировались с более неблагоприятным прогнозом заболевания [20]. Для больных РМЖ с локализованным процессом было показано, что мутации ТР53 чаще встречались в опухолях с амплификацией эпидермального фактора роста 2 (neu/erbB-2), являющегося фактором неблагоприятного прогноза заболевания [7, 18]. При этом риск рецидива заболевания и летального исхода был существенно выше у пациенток с мутациями ТР53 и амплификацией neu/erbB-2 по сравнению с больными, имеющими нормальный ТР53 [7]. На основании исследования профилей генной экспрессии с применением микрочиповой технологии было выявлено, что ТР53 мутации при дополнительном учете экспрессионных профилей ключевых генов контроля клеточного цикла, а также в сочетании со стандартными прогностическими критериями, такими как размер опухоли и вовлечение в процесс лимфоузлов, являются информативными предикторами выживаемости [15]. Другими авторами было показано, что мутантный статус ТР53 положительно ассоциирован с такими неблагоприятными признаками, как отсутствие на опухолевых клетках экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону, анеуплоидия и высокая пролиферация. При этом

не было обнаружено взаимосвязи мутаций ТР53 с размером опухоли [9].

Таким образом, связь мутаций ТР53 с плохим прогнозом и неблагоприятным исходом заболевания достаточно четко определена, хотя до сих пор нет однозначного мнения о возможности использования их в качестве независимого прогностического критерия [10]. При этом в литературе редко встречаются данные о связи множественных мутаций гена ТР53 с клиникопатологическими характеристиками РМЖ.

Целью настоящего исследования явилось изучение спектра мутирования гена ТР53 при РМЖ и его связи с особенностями клинического течения заболевания.

Материал и методы

Образцы опухолей (п=60) были получены во время операции от больных РМЖ в возрасте от 29 до 76 лет (средний возраст 51,6 ± 11,2 года), получавших комбинированное лечение в клинике НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, и хранились в замороженном состоянии при -80 0С. Диагноз был верифицирован морфологически. Стадия процесса устанавливалась согласно классификации ТКМ (4-е издание, 1989), в исследование включены больные со стадиями Т^^^М^. Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.93 № 2288), было получено разрешение локального этического комитета НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН.

Выделение ДНК проводили из лейкоцитов периферической крови (эти образцы использовались как контрольные пробы в SSCP-анализе) и образцов опухоли с помощью протеиназы К и фенол-хлороформной экстракции. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с целью амплификации участков 5, 7 и 8-го экзонов (соматические мутации) гена TP53 по стандартной методике с собственными модификациями. Последовательность используемых праймеров приведена в табл. 1. Реакционная смесь ПЦР объемом 30 мкл содержала ПЦР буфер (160 мМ ^Н4)^04, 670 мМ Трис-НС1, 15 мМ Mga2: 0,1 % Tween-20), 3,5 мМ MgQ2, 0,2 мМ каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов,

е.в. Денисов, н.в. литвяков, м.н. стахеева и др.

34 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------

Таблица 1

Последовательности праймеров

Экзон Праймеры Температура отжига, °С Ссылка

5 F 5’-GCT GCC GTG TTC CAG TTG CTT TAT C-3’ R 5’-AGG GGC CAG ACC TAA GAG CAA TCA G-3’ 61 [1]

7 F 5’-AGT CTA GAG GGC CTG TGT TAT CTC CTA G-3’ R 5’-AGA GAT CTG GAG TCT TCC AGT GTG ATG AT-3’ 61 [2]

8 F 5’-GCC TCT TGC TTC TCT TTT CCT ATC CTG AG-3’ R 5’-TCT GAG GCA TAA CTG CAC CCT TGG TC-3’ 61 [1]

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

1 мкМ прямого и обратного праймеров, 1,5 ед. Taq-полимеразы, 50-200 нг геномной ДНК.

Для детекции мутаций в 5, 7 и 8-м экзонах гена ТР53 (область связывания белка р53 с ДНК) был использован SSCP-анализ с собственными модификациями [1, 2]. Принцип метода SSCP (от англ. Single Strand Conformation Polymorphism, полиморфизм конформаций одноцепочечных фрагментов) основан на различной электрофоретической подвижности одноцепочечных фрагментов ДНК в неденатурирующем геле, зависящей от структуры и размера исследуемого фрагмента. После ПЦР 5-10 мкл амплификата инкубировали 10 мин при 98 °С в 1,5-кратном объеме денатурирующего буфера (на 1 мл буфера: 950 мкл формамида, 4 мкл 5М NaOH, 40 мкл 0,5М ЭДТА рН 8,0, по 0,25 мг бромфенолового синего и ксиленцианола). После прогревания пробы немедленно помещали в лед и затем наносили на полиакриламидный гель (10-12 %). Результат SSCP-электрофореза визуализировали с помощью окрашивания нитратом серебра [16].

Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью пакета прикладных программ «STATISTICA 6.0». Для проверки гипотезы о значимости различий между исследуемыми группами использовали непараметрический критерий согласия %2 (Пирсона), высчитываемый в четырехпольных таблицах (при значении абсолютных частот в анализируемых ячейках больше 10). Если значение было меньше 10 и 5, то использовали критерий %2 с поправкой Йетса либо точный критерий Фишера (F), соответственно.

Результаты и обсуждение

Исследование мутаций гена ТР53 проводили в области 5, 7 и 8-го экзонов, кодирующих цен-

тральный домен связывания белка р53 с ДНК. В 61,7 % случаев (37/60) были выявлены мутации гена ТР53 в опухолях (табл. 2), что согласуется с представленными ранее результатами других авторов [8, 14, 19]. Частота мутаций ТР53 в 7-м экзоне (22,8 %; 13/57) была существенно ниже, чем в 5-м (38,3 %; 23/60) и 8-м экзонах (38,3 %; 23/60). В работах большинства авторов исследовались единичные мутации, встречающиеся в пределах одного экзона гена ТР53, хотя встречаемость множественных мутаций достаточно высока и заслуживает особого внимания при изучении их роли в прогрессии РМЖ [12, 17].

По литературным данным, частота множественных мутаций при РМЖ составляет от 5 % до 15 % [12, 17]. В нашей работе среди всех выявленных случаев мутаций частота единичных мутаций составила 48,6 % (18/37), частота множественных - 51,4 % (19/37), что выше указанных в литературе данных для РМЖ. Среди множественных мутаций «двойные» составили 84,2 % (16/19), «тройные» - 15,8 % (3/19). Большая часть двойных мутаций была представлена мутациями, затрагивающими одновременно 5-й и 8-й экзоны (62,5 %; 10/16). Все случаи наличия в гене ТР53 «тройных» мутаций (5, 7 и 8-й экзоны) были ассоциированы с неблагоприятным клиническим течением заболевания. Так, у одной пациентки был диагностирован диссеминированный злокачественный процесс, у второй - прогрессирование в виде метастазирования в мягкие ткани грудной полости через шесть лет с момента обращения. У третьей больной с тройными мутациями отмечена отягощенная наследственность по онкогинекологическим заболеваниям. Это свидетельствует о связи множественных мутаций гена ТР53 с высокой агрессивностью злокачественного процесса и плохим прогнозом. По данным литературы,

Таблица 2

Частота мутаций гена ТР53 у больных РМЖ

Результаты SSCP-анализа

Единичные мутации Множественные мутации

Общая частота Общая частота Двойные Тройные

Общая частота 5 и 7-й экзоны 5 и 8-й экзоны 7 и 8-й экзоны 5, 7 и 8-й экзоны

48,6 %* (18/37) 51,4 %* (19/37) 84,2 %** (16/19) 12,5 % (2/16) 62,5 % (10/16) 25,0 % (4/16) 15,8 %** (3/19)

Примечание: * - частота мутаций среди индивидуумов, несущих мутации; ** - частота мутаций среди пациенток с множественными мутациями.

вопрос о природе возникновения и прогностической значимости множественных мутаций гена ТР53 остается пока без ответа. Возможно, что гипермутабильность ТР53 может проявляться на ранних этапах развития РМЖ и не связана со стадией процесса [12]. Так, было показано, что множественные мутации ТР53 детектировались в ткани РМЖ независимо от инвазивности опухоли [11]. В отношении множественных мутаций была предложена гипотеза мутационного «автостопа» (hitch-hiking), предполагающая, что при наличии патогенетически значимой мутации дополнительные мутации (миссенс или сайленс) не вносят вклад в формирование фенотипа опухоли, определяющего ее поведение [21]. Для носителей «двойных» мутаций гена ТР53 не было отмечено связи с неблагоприятным клиническим течением РМЖ.

Мы не выявили значимой ассоциации мутаций ТР53 в изучаемых экзонах с такими характеристиками процесса, как размер опухоли и степень ее злокачественности. При оценке распределения мутаций изучаемых участков гена ТР53 (5, 7 и 8-й экзоны) у больных РМЖ в зависимости от вовлеченности лимфоузлов в

опухолевый процесс установлено, что в группе больных РМЖ с местно-распространенным процессом (^_2) по сравнению с пациентками с локализованным процессом (К0) отмечается тенденция к увеличению частоты мутаций ТР53 в 5-м экзоне (53,1 % против 23,8 %; %2=3,36, р=0,06). Ассоциация мутаций в 5-м экзоне гена ТР53 с метастазированием в регионарные лимфоузлы косвенно свидетельствует о том, что опухолевые клетки с данным типом аберраций обладают селективным преимуществом при распространении опухоли за пределы первичного очага (табл. 3). В отношении мутаций в 7-м и 8-м экзонах такой закономерности показано не было. Эти данные позволили на более представительной выборке подтвердить полученные нами ранее результаты для больных РМЖ [4]. Кроме того, нами были опубликованы данные о том, что мутации гена ТР53 в 5-м экзоне коррелируют с неблагоприятным исходом заболевания также у больных с опухолями головы и шеи [3].

Таким образом, проведено исследование наличия мутаций гена ТР53 в опухолевых клетках у больных РМЖ. Обнаруженная частота мута-

Таблица 3

Распределение мутаций гена ТР53 у больных РМЖ в зависимости от лимфогенного метастазирования

Лимфогенная распространенность РМЖ 5-й экзон 7-й экзон 8-й экзон

Норма Мутации Норма Мутации Норма Мутации

N0 76,2 % (16/21) 23,8 % (5/21) 75 % (15/20) 25 % (5/20) 66,7 % (14/21) 33,3 % (7/21)

N1-2 46,9 % (15/32) 53,1 % (17/32) Х2=3,36 p=0,06 80,6 % (25/31) 19,4 % (6/31) 65,6 % (21/32) 34,4 % (11/32)

ций ТР53 (61,7 %) согласуется с литературными данными. В группе больных РМЖ выявлена высокая частота множественных мутаций ТР53, а также ассоциация мутаций в 5-м экзоне с лимфогенным распространением опухоли.

В заключение следует отметить, что мутации в различных структурных и функциональных доменах р53 по-разному отражаются на его биологической активности и, соответственно, по-разному влияют на опухолевый фенотип, определяющий агрессивность злокачественного процесса. Существующая противоречивость литературных данных о прогностической значимости мутаций р53 может быть в определенной степени объяснена использованием различных методов оценки мутационного статуса р53. В частности, иммуногистохимическая детекция аберраций белка р53 обладает достаточно низкой чувствительностью (65 %) в отношении определения генетических мутаций, тогда как метод SSCP, использующийся в нашей работе, более чувствителен - 85-90 %, и лишь в единичных работах применялся метод прямого сиквенса, выявляющий истинные нарушения в структуре ДНК [14]. Систематизация данных о связи определенных типов мутаций р53 с изменениями белка и о вкладе этих нарушений в опухолевую прогрессию может прояснить значимость мутаций р53 в прогнозе заболевания.

Работа поддержана грантом Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (№06/1127 от 04.09.07).

ЛИТЕРАТУРА

1. Бартновский А.Э., Лихин Ф.А., Белохвостов А.С. и др. Оптимизация и применение 88СР-анализа 5, 6, 7 и 8-го экзонов гена р53 для выявления мутаций в ДНК плазмы и клеток крови онкологических и онкогематологических больных // Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2003. Т. 2, № 1. С.76-79.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

2. Белявская В.А., Вардосанидзе В.К., Смирнова О.Ю. и др. Генетический статус р53 при раке желудка: соматические мутации и полиморфизм кодона 72 // Бюл. эксп. биол. и мед. 2006. Т. 141. № 2. С. 205-209.

3. Исаева Т.М., Белявская В.А., Ромащенко А.Г. и др. Соматические мутации гена р53 и течение заболевания при злокачественных новообразованиях разных локализаций // Бюл. эксп. биол. и мед. 1999. Т. 127. Прил. 1. С. 92-95.

4. Чердынцева Н.В., Исаева Т.М., Белявская В.А. и др. Соматические мутации гена р53 у больных доброкачественными опухолями и раком молочной железы // Генетика человека и патология: Сб. материалов. Томск, 2002. Вып. 6. С. 239-243.

5. Bradbury A.R., Olopade O.I. Genetic susceptibility to breast cancer // Rev. Endocr. Metab. Disord. 2007. Vol. 8. P. 255-267.

6. Bouchet B.P., De Fromentel C.C., PuisieuxA., Galmarini C.M. p53 as a target for anti-cancer drug development // Critical Reviews in Oncology. Hematology. 2006. Vol. 58. P. 190-207.

7. Bull S.B., Ozcelik H., Pinnaduwage D. et al. The combination of p53 mutation and neu/erbB-2 amplification is associated with poor survival in node-negative breast cancer // J. Clin. Oncol. 2004. Vol. 22. P. 86-96.

8. Dimitrakakis C., Konstadoulakis M., Messaris E. et al. Molecular markers in breast cancer: Can we use c-erbB-2, p53, bcl-2 and bax gene expression as prognostic factors? // The Breast. 2002. Vol. 11. P. 279-285.

9. Feki A., Irminger-Finger I. Mutational spectrum of p53 mutations in primary breast and ovarian tumors // Critical Reviews in Oncology. Hematology. 2004. Vol. 52. P. 103-116.

10. Harris L., Fritsche H., Mennel R. et al. American Society of Clinical Oncology 2007 Update of Recommendations for the Use of Tumor Markers in Breast Cancer // J. Clin. Oncol. 2007. Vol. 25, № 33. P. 5287-5312.

11. Kang J.H., Kim S.J., Noh D.Y. et al. The timing and characterization of p53 mutations in progression from atypical ductal hyperplasia to invasive lesions in the breast cancer // J. Mol. Med. 2001. Vol. 79. P. 648-655.

12. KeohavongP., Gao W-M., Mady H.H. et al. Analysis of p53 mutations in cells taken from paraffin-embedded tissue sections of ductal carcinoma in situ and atypical ductal hyperplasia of the breast // Cancer Letters. 2004. Vol. 212. P. 121-130.

13. Kumar S., Walia V, Ray M., Elble R.C. p53 in breast cancer: mutation and countermeasures // Frontiers in Bioscience. 2007. Vol. 12. P. 4168-4178.

14. Lai H., Ma F, Trapido E. et al. Spectrum of p53 tumor suppressor mutations and breast cancer survival // Breast Cancer Res. Treat. 2004. Vol. 83. P. 57-66.

15. LangerodA., ZhaoH., Borgan O. et al. TP53 mutation status and gene expression profiles are powerful prognostic markers of breast cancer // Breast Cancer Res. 2007. Vol. 9, № 3. P. 1-16.

16. Lukowsky A. // Methods in Molecular Biology, Cancer Cell Signaling / Ed. David M. Terrian. 2003. Vol. 218. P. 285-320.

17. Meng L., Lin L., Zhang H. et al. Multiple mutations of the p53 gene in human mammary carcinoma // Mutation Research. 1999. Vol. 435. P. 263-269.

18. Meng S., Tripathy D., Shete S. et al. HER-2 gene amplification can be acquired as breast cancer progresses // PNAS. 2004. Vol. 101, № 25. P. 9393-9398.

19. Olivier M., Hainaut P. TP53 mutation patterns in breast cancers: searching for clues of environmental carcinogenesis // Semin. Cancer Biol. 2001. Vol. 11. P. 353-360.

20. Petitjean A., AchatzM.I.W., Borresen-DaleA.L. et al. TP53 mutations in human cancers: functional selection and impact on cancer prognosis and outcomes // Oncogene. 2007. Vol. 26. P. 2157-2165.

21. Rodin S.N., Holmquist G.P., RodinA.S. CpG transition strand asymmetry and hitch-hiking mutations as measures of tumorigenic selection in shaping the p53 mutational spectrum // Int. J. Mol. Med. 1998. Vol. 1. P. 191-199.

22. TadaM., Furuuchi K., KanedaM. et al. Inactive the remaining p53 allele or the alternate p73? Preferential selection of the Arg72 polymorphism in cancers with recessive p53 mutants but not transdominant mutants // Carcinogenesis. 2001. Vol. 22, № 2. P. 515-517.

23. Van Oijen M.G.C.T., Slootweg PJ. Gain-of-function mutations in the tumor suppressor gene p53 // Clin. Cancer Res. 2000. Vol. 6. P. 2138-2145.

nocrynn^a 15.10.07