CC BY
120
УДК 576.4
Мутации в гене PARK2, ассоциированном с болезнью Паркинсона, сопровождаются разбалансировкой систем программируемой клеточной гибели
Е. В. Коновалова1, О. М. Лопачева12, И. А. Гривенников3, О. С. Лебедева3, Э. Б. Дашинимаев4, Л. Г. Хаспеков1, Е. Ю. Федотова1, С. Н. Иллариошкин1* 1Научный центр неврологии, 125367, Москва, Волоколамское ш., 80
2Международный учебно-научный биотехнологический центр Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1/12 3Институт молекулярной генетики РАН, 123182, Москва, пл. Академика Курчатова, 2 4Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 26 *E-mail: [email protected] Поступило в редакцию 04.06.2015
РЕФЕРАТ Болезнь Паркинсона обусловлена дегенерацией дофаминергических нейронов среднего мозга. Причиной редкой рецессивной формы этого заболевания могут быть мутации гена PARK2, продукт которого, паркин, контролирует процессы митофагии и программируемой клеточной гибели. Определен уровень про- и антиапоптотических факторов семейства Bcl-2 в дофаминергических нейронах, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток здорового донора и пациента с болезнью Паркинсона -носителя мутаций PARK2. Методом Вестерн-блотинга проанализированы соотношения белков Bax, Bak, Bcl-2, Bcl-XL и Bcl-W. Показано, что уровень проапоптотического белка Bak в PARK2-нейронах вдвое ниже по сравнению со здоровыми клетками. Напротив, экспрессия антиапоптотических факторов Bcl-XL, Bcl-W и Bcl-2 статистически значимо увеличена в мутантных клетках по сравнению со здоровыми дофа-минергическими нейронами. Полученные результаты показывают, что мутации PARK2 сопровождаются разбалансировкой систем программируемой клеточной гибели, в которой ведущая роль принадлежит не-апоптотическим молекулярным механизмам.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА болезнь Паркинсона, дофаминергические нейроны, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, PARK2, мутации, программируемая клеточная гибель.
Болезнь Паркинсона (БП) - распространенное нейродегенеративное заболевание, обусловленное поражением пигментированных нейронов компактной части черной субстанции среднего мозга и дегенерацией дофаминергического нигростриатного пути. Лечение при БП носит лишь симптоматический характер и не предотвращает дальнейшей гибели нигральных клеток, что диктует необходимость идентификации ключевых звеньев патогенетического каскада болезни [1].
В развитии БП важная роль принадлежит генетике. Примерно 10% всех случаев БП представлены моногенными формами [1, 2], а остальные (спорадические) случаи имеют многофакторную природу. На сегодняшний день известно 20 генетических ло-кусов БП [2]. Один из вовлекаемых генов, PARK2,
расположен на хромосоме 6q25.2-27 и связан с развитием особой формы болезни - аутосомно-рецес-сивной БП, манифестирующей в раннем возрасте [3]. Мутации PARK2 обусловливают около 15% семейных и 4% спорадических случаев БП с дебютом до 40 лет [3-5]. Ген PARK2 кодирует белок паркин - цитозоль-ную убиквитин-Е3-лигазу. Основная роль паркина состоит в регуляции митофагии, осуществляемой вместе с митохондриальным белком РШК1 - продуктом еще одного гена аутосомно-рецессивного паркинсонизма [6]. Последовательность молекулярных событий выглядит следующим образом: нефункциональная митохондрия деполяризируется и тем самым стабилизирует РШК1, после чего тот захватывает паркин из цитозоля и активирует его при доставке к митохондрии за счет РШЮ-киназной
активности; далее активированный паркин обеспечивает селективную аутофагию поврежденной ор-ганеллы [7].
Таким образом, взаимодействуя друг с другом, паркин и PINK1 осуществляют контроль состояния митохондрий. В настоящее время паркин рассматривается в качестве поливалентного нейропротектор-ного агента, имеющего ключевое значение для выживания дофаминергических нейронов при воздействии различных нейротоксинов [8].
Изучение клеточной биологии и нейрохимии PARK2/паркина является чрезвычайно актуальным направлением современной неврологии. Объектом наших исследований стал мутантный паркин, экс-прессируемый в клетках пациента с редкой PARK2-ассоциированной формой БП. В качестве модельной системы была выбрана культура обогащенных дофа-минергическими нейронами нервных клеток, полученных в результате репрограммирования фибро-бластов кожи в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) и их последующей направленной дифференцировки [9, 10]. С целью уточнения патогенеза болезни мы изучали динамику ряда про-и антиапоптотических факторов в мутантной культуре в сопоставлении с культурой нейронов, полученных от здорового донора.
В работе использовали культуры клеток здорового донора и пациента с аутосомно-рецессивной юве-нильной БП, носителя компаунд-гетерозиготных мутаций в гене PARK2 (del202-203AG и IVS1 + 1G/A). Из биоптатов кожи донора и пациента ранее нами были получены фибробласты, которые репрограм-мировали при помощи оригинальных лентивирусных векторов с факторами плюрипотентности (LeGO-hOCT4, LeGO-hSOX2-IRES-GFP, LeGO-hc-Myc, LeGO-hKLF4) с целью получения клонов ИПСК. Далее клетки были дифференцированы по нейро-нальному типу с использованием факторов диффе-ренцировки. Методики получения фибробластов и их репрограммирования, а также индукции дифферен-цировки ИПСК в специализированные дофаминерги-ческие нейроны описаны ранее [10].
Дифференцировку клеток в нейроны подтверждали с помощью иммуноцитохимического окрашивания антителами к P-III-тубулину и тирозингидроксилазе (TH). Вестерн-блотинг для определения содержания белков в клеточных культурах проводили по стандартной методике.
Результаты обрабатывали в программах Microsoft Exсel и GraphPad Prism 6.
Клеточные линии Po2 и Tr5 при дифференциров-ке экспрессировали нейрональные маркеры, которые выявляли при помощи иммуноцитохимического окрашивания (рис. 1). Белок P-III-тубулин является
A
* »
# Ш
Ч*
7
200 мкм
200 мкм
Рис. 1. Иммуноцитохимическое окрашивание нейронов, дифференцируемых из ИПСК. А - окраска на Р-Ш-тубулин (зеленый цвет); Б - окраска на ТН (красный цвет); синим цветом обозначены ядра клеток (маркер DAPI)
классическим маркером ранней нейрональной дифференцировки, а TH традиционно рассматривается как специфический маркер дифференцировки нейронов по дофаминергическому пути. Как видно из рис. 1, дифференцировке подвергаются все ИПСК, поскольку все ядра клеток, окрашенные DAPI, находятся в нейронах (позитивных по Р-Ш-тубулину и TH). Количество нейронов, дифференцированных по дофаминергическому пути, составляет около 80% от общего количества клеток, позитивных по Р-Ш-тубулину.
Оказалось, что соотношение про- и антиапоптотических факторов в клеточных культурах Po2 и ^5, полученных соответственно от здорового до-
A
ra с га х !_ X
и
8.0Х106
и О X m х и х Ф н X
X
6.0Х106
ш 4.0Х106
и
^2.0Х106
Б
Po2 Tr5
Po2 Tr5
Bak Bax
Bcl-W Bcl-XL
Bak, 25 кДа
■ Bax, 20 кДа Bcl-2, 25 кДа
■ Bcl-W, 18 кДа Bcl-XL, 30 кДа
■ GAPDH, 37 кДа
Рис. 2. Количественный анализ про-и антиапоптотических белков в клеточной культуре Po2, полученной от здорового донора, и в культуре Tr5, полученной от пациента с БП -носителя мутаций в гене PARK2 (Вестерн-блотинг). A - интенсивность сигнала (в условных единицах) от полос Bak, Bax, Bcl-2, Bcl-W и Bcl-XL (n = 3). p < 0.001 (***), p < 0.01 (**) и p < 0.05 (*) при сравнении культур Po2 и Tr5. Б - репрезентативные фотографии полос, полученных при проведении Вестерн-блотинга
нора и носителя мутаций в гене PARK2, различается (рис. 2).
Концентрация проапоптотического белка Вак в мутантных дофаминергических нейронах Тг5 была статистически значимо ниже (на 58%), чем в клетках здорового донора в культуре Ро2 (р < 0.001). Значимых различий в содержании проапоптотического белка Вах в изучаемых культурах клеток не обнаружено.
Содержание антиапоптотических белков Вс1-2, Bcl-W и Bcl-XL оказалось статистически значимо более высоким в клетках Тг5, экспрессирующих му-тантный PARK2. Так, концентрация белка Вс1-2 в мутантных клетках была на 222% выше, чем в клетках дикого типа, белка Bcl-W - на 150.5% (в обоих случаях р < 0.01), а белка Bcl-XL - на 55% (р < 0.05).
Каждая проба содержала 20 мкг общего белка. Равномерность нанесения белка на гель дополнительно контролировали с использованием белка GAPDH, уровень сигнала которого во всех образцах был одинаковым (рис. 2Б).
Описано несколько вариантов программируемой клеточной гибели при БП и других нейродегенера-тивных заболеваниях - классический апоптоз, ау-тофагический путь, AIF/PARP-зависимый путь, параптоз и др. [11, 12]. В ряде случаев, однако, закономерности клеточной гибели не соответствуют какому-то одному механизму и имеют комплексный характер. Важную роль в клеточной гибели играет высвобождение из митохондрий цитохрома с [13]. Цитохром с активирует цитозольный белок Ара^1 и прокаспазу-9 по пути формирования апоптосо-мы, и его выброс строго регулируется соотношением в клетке про- и антиапоптотических факторов. Дисбаланс в данной системе, выявленный нами в PARK2-скомпромитированных нейронах, может быть связан с функциональными свойствами дефектного паркина, но это предположение нуждается в до-
полнительном подтверждении на культурах с нормальным и мутантным генотипами.
Белок паркин действует как митохондриальный нейропротектор. Установлено, в частности, специфическое автономное влияние паркина на митохондри-альные механизмы, определяющие высвобождение цитохрома с и запуск реакций апоптоза [14]. Недавно идентифицирован паркиноподобный цитоплазма-тический белок, ассоциированный с р53 (PARC): как и паркин, он является Е3-лигазой и инициирует протеасомную деградацию цитохрома с [15]. Важным этапом защитного действия паркина может быть протеасомная деградация ARTS - митохондриально-го белка, инициирующего ранний (до выделения ци-тохрома с) этап каспазного пути [16]. Тем не менее детальные молекулярные механизмы нейропротекции, ассоциированные с паркином, остаются не до конца ясными.
Особенность культуры Tr5 состоит в отсутствии нормального паркина, поскольку нейроны данной культуры несут две инактивирующие рецессивные мутации гена PARK2 (делецию со сдвигом рамки del202-203AG и мутацию сплайсинга IVS1 + 1G/A). Таким образом, в мутантной культуре нарушен селективный процессинг митохондриальных белков и цитохрома с, осуществляемый паркином. При этом в культуре Tr5 вместо ожидаемой инициации апоп-тоза нами выявлено статистически значимое снижение концентрации проапоптотического белка Bak и, напротив, повышение уровня всех исследованных антиапоптотических белков семейства Bcl. Полученные результаты сходны с данными о повышении уровня Bcl-XL in vivo и in vitro в модели индуцированного паракватом паркинсонизма [17]. Одной из функций паркина считается предотвращение транслокации апоптотического белка Bax в митохондрии [18], однако нарушение регуляции этого процесса в PARK2-мутантных клетках не затраги-
вает экспрессию Вах и может не сопровождаться изменением его уровня в культуре. В последние годы большое значение в митохондриальном цитотокси-ческом каскаде при БП придается микроглиальной активации и воспалению [19], причем эти процессы не требуют индукции митохондриального апоптоза [20], что косвенно подтверждается и нашими данными.
ВЫВОДЫ
1. Нами представлены характеристики системы Вах/ Вак/Вс1 при аутосомно-рецессивном паркинсонизме со сложной мутацией PARK2: установлено, что мутации PARK2 приводят к сложной разбалансировке
систем программируемой клеточной гибели, ведущая роль в которой принадлежит, по-видимому, неапоп-тотическим молекулярным механизмам.
2. Полученные предварительные данные должны быть подтверждены на дофаминергических нейронах, полученных от других гомозиготных и гетерозиготных носителей мутаций гена PARK2.
3. Результаты нашей работы показывают, что разрабатываемые подходы к терапии нейродегенера-тивных заболеваний, связанные с подавлением апоптоза [11, 12], могут оказаться неэффективными при PARK2-ассоциированной БП. •
Работа поддержана РНФ (грант № 14-15-01047).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Jenner P., Morris H.R., Robbins T.W., Goedert M., Hardy J., Ben-Shlomo Y., Bolam P., Burn D., Hindle J.V., Brooks D. // J. Parkinson's Dis. 2013. V. 3. P. 1-11.
2. Bonifati V. // Parkinsonism Relat. Disord. 2014. V. 20 (Suppl. 1). P. S23-S28.
3. Загоровская Т.Б., Иллариошкин С.Н., Сломинский П.А., Иванова-Смоленская И.А., Маркова Е.Д., Лимборская С.А., Левин О.С., Милосердова О.В., Проскокова Т.Н., Багыева Г.Х., Брис А. // Журн. неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2004. T. 8. C. 66-72.
4. Periquet M., Lücking C.B., Vaughan J.R., Bonifati V., Dürr A., De Michele G., Horstink M.W., Farrer M., Illarioshkin S.N., Pol-lak P., et al. // Am. J. Hum. Genet. 2001. V. 68. P. 617-626.
5. Kilarski L.L., Pearson J.P., Newsway V., Majounie E., Knipe M.D., Misbahuddin A., Chinnery P.F., Burn D.J., Clarke C.E., Marion M.H., et al. // Mov. Disord. 2012. V. 27. P. 1522-1529.
6. Park J., Lee S.B., Lee S., Kim Y., Song S., Kim S., Bae E., Kim J., Shong M., Kim J.M., Chung J. // Nature. 2006. V. 441. P. 1157-1161.
7. Matsuda N., Sato S., Shiba K., Okatsu K., Saisho K., Gautier C.A., Sou Y.S., Saiki S., Kawajiri S., Sato F., et al. // J. Cell Biol. 2010. V. 189. P. 211-221.
8. Lim K.L., Ng X.H., Grace L.G., Yao T.P. // Antioxid. Redox. Signal. 2012. V. 16. P. 935-949.
9. Takahashi K., Yamanaka S. // Cell. 2006. V. 126. P. 663-676.
10. Лебедева О.С., Лагарькова М.А., Киселев С.Л., Мухина
И.В., Ведунова М.В., Усова О.В., Ставровская А.В., Ямщикова Н.Г., Федотова Е.Ю., Гривенников И.А. и др. // Нейрохи-мия. 2013. V. 3. P. 233-241.
11. Esposito E., Cuzzocrea S. // Curr. Med. Chem. 2010. V. 17. P. 2764-2774.
12. Lockshin R.A., Zakerib Z. // J. Cell Mol. Med. 2007. V. 11. P. 1214-1224.
13. Kim J., Yang Y., Song S.S., Na J.H., Oh K.J., Jeong C., Yu Y.G., Shin Y.K. // Biophys. J. 2014. V. 107. P. 1601-1608.
14. Berger A.K., Cortese G.P., Amodeo K.D., Weihofen A., Letai A., LaVoie M.J. // Hum. Mol. Genet. 2009. V. 18. P. 4317-4328.
15. Gama V., Swahari V., Schafer J., Kole A.J., Evans A., Huang Y., Cliffe A., Golitz B., Sciaky N., Pei X.H., et al. // Sci. Signal. 2014. V. 7(334). P. ra67. doi: 10.1126/scisignal.2005309.
16. Kemeny S., Dery D., Loboda Y., Rovner M., Lev T., Zuri D., Finberg J.P., Larisch S. // PLoS One. 2012. V. 7. P. e38837.
17. Fei Q., McCormack A.L., Di Monte D.A., Ethell D.W. // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 3357-3364.
18. Charan R.A., Johnson B.N., Zaganelli S., Nardozzi J.D., LaVoie M.J. // Cell Death Dis. 2014. V. 5. P. e1313. doi:10.1038/ cddis.2014.278.
19. Yan J., Fu Q., Cheng L., Zhai M., Wu W., Huang L., Du G. // Mol. Med. Rep. 2014. V. 10. P. 2223-2233.
20. Allam R., Lawlor K.E., Yu E.C., Mildenhall A.L., Moujalled D.M., Lewis R.S., Ke F., Mason K.D., White M.J., Stacey K.J., et al. // EMBO Rep. 2014. V. 15. P. 982-990.
