CC BY
87
: Мутации в генах ВНА¥ и МАР2К1 при волосатоклеточном
; лейкозе и селезеночной В-клеточной лимфоме
§ из клеток маргинальной зоны
ев И.А. Якутик, Л.С. Аль-Ради, У.Л. Джулакян, Б.В. Бидерман, А.Б. Судариков
ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России; Россия, 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, 4
^ Контакты: Игорь Александрович Якутик igorya90@list.ru
Е ш
к Исследованы образцы ДНК пациентов с волосатоклеточным лейкозом (ВКЛ) и селезеночной В-клеточной лимфомой из клеток
® маргинальной зоны (СЛКМЗ) для выявления активирующих мутаций в генах BRAF и MAP2K1. Мутация BRAF V600E обнаружена
2 у 39 (98%) из 40 больных ВКЛ и ни у одного пациента с СЛКМЗ. Ни у одного пациента, вошедшего в данное исследование, не выявлены
в какие-либо другие, отличные от V600E, активирующие мутации в экзонах 11 и 15 гена BRAF. Мутация MAP2K1Q56P выявлена у 1 (2 %) из 40пациентов с ВКЛ, характеризующегося экспрессией ЮИУ4-34. Ни у одного больного СЛКМЗ не обнаружены активирующие
*" мутации в экзонах 2, 3 или 11 гена МАР2К1, в том числе и среди тех, у кого выявлена экспрессия ЮИУ4-34.
са
а
cv
Ключевые слова: селезеночная В-клеточная лимфома, волосатоклеточный лейкоз, ген BRAF, ген MAP2K1, мутации
DOI: 10.17650/1818-8346-2016-11-1-34-36
BRAF and MAP2K1 mutations in hairy cell leukemia and splenic marginal zone B-cell lymphoma
I.A. Yakutik, L.S. Al'-Radi, H.L. Julhakyan, B. V. Biderman, A.B. Sudarikov
National Research Center for Hematology, Ministry of Health of Russia; 4 Novyy Zykovskiy Proezd, Moscow, 125167, Russia
DNA samples from patients with hairy cell leukemia (HCL) and splenic marginal zone B-cell lymphoma (MZBCL) for BRAF and MAP2K1 activating mutations were analyzed. V600E mutation of BRAF was detected in 39 (98 %) of 40 patients with hairy cell leukemia, and no patient with MZBCL. In none of the patients in this study any other activating mutations than V600E in exons 11 and 15 of BRAF gene were revealed. MAP2K1Q56P mutation characterized by IGHV4-34 expression was detected in 1 (2 %) of 40 patients with HCL. In none of the patients with MZBCL activating mutations in the 2, 3 or 11 exons of MAR2K1 gene have been identified, including those with IGHV4-34 expression.
Key words: splenic B-cell lymphoma, hairy cell leukemia, BRAF gene, MAR2K1 gene mutations
Введение
Волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ) — хроническое В-клеточное лимфопролиферативное заболевание (ЛПЗ), обладающее рядом характерных клинико-патологи-ческих, иммунофенотипических и молекулярно-био-логических черт, позволяющих отличить его от прочих В-клеточных ЛПЗ. Ранее с помощью полноэкзомного секвенирования было продемонстрировано, что мутация в гене BRAF, приводящая к аминокислотной замене V600E, выявляется у 100 % больных ВКЛ [1], а также была показана конститутивная активация RAF-MEK-ERK-каскада [2, 3]. Вместе эти находки проливают свет на молекулярные механизмы патогенеза данного заболевания, а также вносят существенный вклад в вопросы диагностики и лечения ВКЛ, поскольку позволяют отличить его от сходных В-кле-точных ЛПЗ, таких как вариантная форма ВКЛ и селезеночная В-клеточная лимфома из клеток маргинальной зоны (СЛКМЗ). Больные ВКЛ хорошо отвечают на химиотерапию пуриновыми аналогами — кладри-бином и пентостатином, однако при медиане наблюдения 10 лет примерно у 40 % пациентов развивается рецидив, иногда менее восприимчивый к терапии [4].
Эти и другие факты указывают на необходимость совершенствования современных методов терапии ВКЛ. Открытие мутации BRAF V600Eи активации RAF-MEK-ERK-каскада сделало обоснованным применение тар-гетной терапии ВКЛ с использованием протеинкиназных ингибиторов, целенаправленно подавляющих активацию мутантной BRAF-киназы и киназ МЕК1/2 [5, 6]. В то же время в недавних исследованиях было показано, что больные, имеющие перестройку вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулинов 4-34 (ЮБУ4-34), не несут мутацию BRAF V600E и в значительной части случаев характеризуются различными активирующими мутациями в гене МАР2К1, кодирующем киназу МЕК1 [7, 8]. Все эти факты указывают на необходимость расширения панели генов, исследуемых при ВКЛ, а также углубления знаний о молекулярных особенностях данного заболевания. Также при анализе литературных данных до сих пор остается неясным патогенез СЛКМЗ [9—12].
В данной работе мы исследовали мутации в генах BRAF и MAP2K1 у больных ВКЛ и СЛКМЗ с целью оценить их частоту и диагностическую значимость на собственной выборке пациентов.
Гемобластозы: диагностика, лечение, сопроводительная терапия
35
Материалы и методы
Были исследованы 40 пациентов с диагнозом ВКЛ и 24 пациента с диагнозом СЛКМЗ. Диагноз устанавливали, основываясь на стандартных общепринятых диагностических критериях [9, 13, 14], включающих исследование морфологии и иммунофенотипа лимфоидных клеток крови и/или костного мозга [15]. Также проводилось исключение диагноза селезеночных неклассифи-цируемых лимфом (вариантной формы ВКЛ и лимфомы селезенки с диффузным поражением красной пульпы) [16]. Во всех случаях была выявлена клональная реаран-жировка генов тяжелых цепей иммуноглобулинов. Для анализа мутаций была использована геномная ДНК, выделенная из образцов периферической крови, аспи-ратов костного мозга и биоптатов селезенки пациентов.
Мутацию V600E гена BRAF определяли с помощью аллель-специфичной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) на приборе StepOne-PlusTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems) по методике, описанной ранее [17].
Мутации в экзонах 11 и 15 гена BRAF и экзонах 2, 3 и 11 гена MAP2K1 исследовали методом прямого секвенирования по Сэнгеру с применением набора Big Dye 1.1 XTerminator Cycle Sequencing Kit и капиллярного секвенатора ABI Prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Для секвенирования использовали следующие праймеры: BRAF-E11F: 5'-CTTCCTGTATCCCTCTCAGGC-3', BRAF-E11R: 5'-TGGAGGAGTCCTGAACTAATCA-3', BRAF-E15F: 5'-TACCTAAACTCTTCATAATGCTTGC-3', BRAF-E15R: 5'-GTAACTCAGCAGCATCTCAGGG-3', MEK1-E2F: 5'-GACCTGGAGCTTTCTTTCCA-3', MEK1-E2R: 5'-TCCCCAGGCTTCTAAGTACC-3', MEK1-E3F: 5'-CCAATGCCTGCCTTAGTACA-3', MEK1-E3R: 5'-TCACCTCCCAGACCAAAGAT-3', MEK1-E11F: 5'-AGGCAGAGTTACTGTCTCCA-3', MEK1-E11R: 5'-GCCAATCCACTTAGGGGAAC-3'.
Мутационный статус вариабельных участков тяжелых цепей генов иммуноглобулинов определяли по методике, описанной ранее [18].
Результаты и обсуждение
Мутация BRAF V600E была выявлена в 39 из 40 случаев ВКЛ и ни в одном из случаев СЛКМЗ. Принимая во внимание, что патогенные мутации в гене BRAF не ограничиваются вариантом V600E [19] и что основное число активирующих мутаций локализовано в экзонах 11 и 15 [19], мы просеквенировали соответствующие экзоны данного гена у всех пациентов, вошедших в исследование. Ни у одного из больных ВКЛ или СЛКМЗ не были выявлены активирующие мутации в экзонах 11 и 15 гена BRAF.
В соответствии с литературными данными активирующие мутации в гене MAP2K1, кодирующем МАР-киназу MEK1, выявляются при вариантной форме ВКЛ и в тех случаях, когда при ВКЛ экспрессируется IGHV4-34 [8]. Протеинкиназа MEK1 является важным
элементом механизма передачи сигнала через МАР-киназный каскад и, будучи фосфорилированной про-теинкиназой BRAF, передает сигнал нижележащим участникам каскада — протеинкиназам ЕЯЮ и ЕЯК2. Поскольку активирующие мутации киназы МЕК1 чаще всего затрагивают ^концевой ауторегуляторный домен [8, 20, 21] и активационный сегмент киназного домена [20, 21], мы просеквенировали экзоны 2, 3 и 11 гена МАР2К1. Мутация с.167А>С, приводящая к замене Q56P в аминокислотной последовательности белка МЕК1, была обнаружена у 1 пациента с ВКЛ. В результате определения мутационного статуса генов иммуноглобулинов было выяснено, что это единственный пациент в нашей выборке, относящийся к подгруппе ЮИ¥4-34-положительных ВКЛ. Важно отметить, что этот случай имел нетипичную картину поражения костного мозга — морфологически выявлялись лишь рассеянные лимфоидные клетки, но при иммуноги-стохимическом исследовании обнаруживалась выраженная интерстициальная лимфоидная инфильтрация CD20+CD79a+ В-клетками. При этом в биоптате удаленной селезенки морфологически, иммуногисто-химически и фенотипически диагноз ВКЛ был подтвержден, в то время как повторное исследование показало наличие мутации МАР2К1 Q56P и отсутствие мутации BRAF У600Е в ткани селезенки. Ни у одного из 24 пациентов с СЛКМЗ не было обнаружено мутаций в гене МАР2К1. Важно отметить, что среди больных СЛКМЗ также были 2 пациента с экспрессией ЮИ¥4-34, что хорошо согласуется с данными других исследователей [22].
В результате нашего исследования на выборке пациентов, обратившихся в Гематологический научный центр в период с 2005 по 2015 г., было показано, что мутация BRAF У600Е встречается не во всех случаях ВКЛ (в нашем исследовании — 98 % (39/40)). Было подтверждено, что у BRAF К600Е-отрицательных больных могут выявляться активирующие мутации в других генах, кодирующих протеинкиназы — компоненты МАР-киназного каскада, таких как МАР2К1. Исследование мутационного статуса генов тяжелых цепей иммуноглобулинов выявляет в данном случае использование гена ЮНУ4-34 в перестроенном опухолевом клоне. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что именно активация RAF-MEK-ERK-каскада лежит в основе патогенеза ВКЛ, а конкретные мутации, приводящие к образованию конститутивно активированных форм различных киназ, должны рассматриваться как причины данной активации. Также можно предположить, что спектр возможных причин вышеописанной активации не ограничивается обнаруженными на данный момент мутациями, а имеет потенциально значительно больший масштаб как за счет различных мутаций одного и того же гена, так и за счет мутаций в других генах каскада. Отсутствие же экспериментальных данных, подтверждающих это предположение, объясняется низкой частотой подобных явлений вместе с относительной
са
а
cv
CS
(в
а
CV
са
а
cv
CS
редкостью данного заболевания и, как следствие, небольшими выборками пациентов. Полученные нами данные согласуются с уже имеющимися сообщениями других исследователей о редких случаях BRAF V600E-негатив-ного ВКЛ [7, 8], а также явно указывают на большое значение исследования мутационного статуса генов иммуно-
глобулинов и необходимость расширения панели мутаций и генов, исследуемых при диагностике ВКЛ. Более того, эти данные указывают на возможность применения новых таргетных препаратов, нацеленных на подавление активности RAF-MEK-ERK-каскада (ингибиторы МЕК и ERK), для лечения резистентных форм ВКЛ.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
са
а
cv
1. Tiacci E., Trifonov V., Schiavoni G. et al. BRAF mutations in hairy-cell leukemia. N Engl J Med 2011;364(24): 2305-15.
2. Kamiguti A.S., Harris R.J., Slupsky J.R. et al. Regulation of hairy-cell survival through constitutive activation of mitogen-activated protein kinase pathways. Oncogene 2003;22(15):2272-84.
3. Tiacci E., Schiavoni G., Martelli M.P. et al. Constant activation of the RAF-MEK-ERK pathway as a diagnostic and therapeutic target in hairy cell leukemia. Haematologica 2013;98(4):635-9.
4. Pettirossi V., Santi A., Imperi E. et al. BRAF inhibitors reverse the unique molecular signature and phenotype of hairy cell leukemia and exert potent antileukemic activity. Blood 2015;125(8):1207-16.
5. Урнова Е.С., Аль-Ради Л.С., Кузьмина Л.А. и др. Успешное применение вемурафениба у больного с резистентной формой волосатоклеточного лейкоза. Терапевтический архив 2013;85(7):76-8. [Urnova E.S., Al'-Radi L.S., Kuz'mina L.A. et al. Successful use of vemurafenib in a patient with resistant hairy cell leukemia. Terapevtiches-kiy arkhiv = Therapeutic Archives 2013;85(7):76-8. (In Russ.)].
6. Peyrade F., Re D., Ginet C. et al. Low-dose vemurafenib induses complete remission incase of hairy-cell leukemia with a V600E mutation. Haematologica 2013;98(2):е20-2.
7. Xi L., Arons E., Navajo W et al. Both variant and IGHV4-34-expressing hairy cell leukemia lack the BRAF V600E mutation. Blood 2012;119(14):3330-2.
8. Waterfall J.J., Arons E., Walker R.L. et al. High prevalence of MAP2K1 mutations
in variant and IGHV4-34-expressing hairy-cell leukemias. Nat Genet 2014;46(1):8-10.
9. Джулакян У.Л., Гриншпун Л.Д. Селезеночная лимфома из клеток маргинальной зоны (лимфоцитома селезенки)
у пожилых пациентов: клиника, диагностика, лечение. В сб.: Гериатрическая гематология. Заболевания системы крови в старших возрастных группах. Под ред. Л.Д. Гриншпун, А.В. Пивника. М., 2012. С. 237-44. [Dzhulakyan U.L., Grinshpun L.D. Splenic marginal zone lymphoma (spleen lymphocytoma) in elderly patients: clinical features, diagnosis, treatment. In: Geriatric hematology. Blood disorders in the older age groups. Ed. by L.D. Grinshpun, A.V. Pivnik. Moscow, 2012. Pp. 237-44. (In Russ.)].
10. Джулакян У.Л., Обухова Т.Н., Капланская И.Б. Лимфоцитома селезенки с перестройкой локуса гена BCL-6/3q27. Гематология и транс-фузиология 2009;54(3):48-52. [Dzhulakyan U.L., Obukhova T.N., Kaplanskaya I.B. Spleen lymphocytoma with BCL-6/3q27 rearrangement. Gematologiya
i transfuziologiya = Hematology and Trans-fusiology 2009;54(3):48-52. (In Russ.)].
11. Джулакян У.Л. Вирусные гепатиты
и лимфома из клеток маргинальной зоны селезенки: подходы к терапии. Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика 2012;6(1):120—3. [Dzhulakyan U.L. Viral hepatitis and splenic marginal zone lymphoma: therapy approaches. Fundamental'nye issledovaniya i klinicheskaya praktika = Basic Research and Clinical Practice 2012;6(1):120-3. (In Russ.)].
12. Никитин Е.А., Баранова А.В. Патогенез В-клеточных лимфатических опухолей. В кн.: Клиническая онкогематология. Под ред. проф. М.А. Волковой. М.: Медицина, 2007. С. 645-78. [Nikitin E.A., Baranova A.V. The pathogenesis of B-cell lymphoid tumors. In: Clinical oncohematology. Ed. by prof. M.A. Volkova. Moscow: Meditsina, 2007. Pp. 645-78.
(In Russ.)].
13. Foucar K., Falini B., Catovsky D. et al.(eds.) WHO classification of tumours
of haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC, 2008. Рр. 188-90.
14. Аль-Ради Л.С., Пивник А.В., Зыбунова Е.Е. и др. Волосатоклеточный лейкоз у пожилых: клиника, диагностика, лечение аналогом пурина 2-CdA. Клиническая геронтология 2004;(5):7-13. [Al'-Radi L.S., Pivnik A.V., Zybunova E.E. et al. Hairy cell leukemia in the elderly: clinical features, diagnosis, treatment with purine analogue 2-CdA. Klinicheskaya gerontologiya = Clinical Gerontology 2004;(5):7-13. (In Russ.)].
15. Хвастунова А.Н., Аль-Ради Л.С., Капранов Н.М. и др. Использование клеточного биочипа в диагностике волоса-токлеточного лейкоза. Онкогематология 2015;(1):37-45. [Khvastunova A.N., Al'-Radi L.S., Kapranov N.M. et al. Using a cell biochip in the diagnosis of hairy cell leukemia. Onkogematologiya = Oncohematology 2015;(1):37-45. (In Russ.)].
16. Julhakyan H.L., Al-Radi L.S., Moiseeva T.N. et al. The experience
of diagnostic and treating splenic diffUse red pulp lymphoma. Clin Lymphoma Myeloma Leuk 2015;15 Suppl 2:69-70.
17. Якутик И.А., Аль-Ради Л.С., Бидерман Б.В. и др. Применение аллель-специфичной ПЦР-РВ для определения мутации B-RAF V600E у больных волосатокле-точным лейкозом. Гематология
и трансфузиология 2014;59(2):16-9. [Yakutik I.A., Al'-Radi L.S., Biderman B.V. et al. Detection of B-RAF V600E mutation in patients with hairy cell leukaemia by allele-specific RT-PCR. Gematologiya i transfuziologiya = Haematology and Transfusiology 2014;59(2):16-9. (In Russ.)].
18. Бццерман Б.В., Никитин Е.А., Сергиенко Т.Ф. и др. Репертуар генов тяжелой цепи иммуноглобулинов при В-клеточном хроническом лимфолейкозе в России и Беларуси. Онкогематология 2012;(3):38-43. [Biderman B.V., Nikitin E.A., Sergienko T.F. et al. The repertoire of heavy chain immunoglobulin genes in B-cell chronic lymphocytic leukemia in Russia and Belarus. Onkogematologiya = Oncohematology 2012;(3):38-43. (In Russ.)].
19. Dahlman K.B., Xia J., Hutchinson K. et al. BRAF (L597) mutations in melanoma are associated with sensitivity to MEK inhibitors. Cancer Discov 2012;2(9):791-7.
20. Chakraborty R., Hampton O.A., Shen X. et al. Mutually exclusive recurrent somatic mutations in MAP2K1 and BRAF support
a central role for ERK activation in LCH pathogenesis. Blood 2014;124(19):3007-15.
21. Van Allen E.M., Wagle N.,
Sucker A. et al. The genetic landscape of clinical resistance to RAF inhibition in metastatic melanoma. Cancer Discov 2014;4(1):94-109.
22. Джулакян У.Л., Бидерман Б.В., Гемджян Э.Г. и др. Молекулярный анализ генов иммуноглобулина в опухолевых B-клетках при лимфоме селезенки из клеток маргинальной зоны. Терапевтический архив 2015;87(7):58-63. [Dzhulakyan U.L., Biderman B.V., Gemdzhyan E.G. et al. Molecular analysis of immunoglobulin
genes in tumor cells in splenic marginal zone B-cell lymphoma. Terapevticheskiy arkhiv = Therapeutic Archives 2015;87(7):58-63. (In Russ.)].
