CC BY
94
Клиническая онкогематология. 2019;12(3):263-70
Клиническая онкогематология. 2019;12(3):263-70
ЛИМФОИДНЫЕ ОПУХОЛИ LYMPHOID TUMORS
Мутации гена TP53 в опухолевых клетках у пациентов с агрессивными В-клеточными лимфомами
А.Е. Мисюрина1, С.К. Кравченко1, В.А. Мисюрин2, А.М. Ковригина1, А.У. Магомедова1, Е.А. Барях3, Ф.Э. Бабаева1, А.В. Мисюрин4
1 ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России,
Новый Зыковский пр-д, д. 4а, Москва, Российская Федерация, 125167
2 ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Каширское ш., д. 24, Москва, Российская Федерация, 115478
3 ГБУЗ «Городская клиническая больница № 52 ДЗМ»,
ул. Пехотная, д. 3, Москва, Российская Федерация, 123182
4 ООО «ГеноТехнология», ул. 800-летия Москвы, д. 11, Москва, Российская Федерация, 127247
РЕФЕРАТ
Актуальность. Наличие мутаций в гене TP53 затрудняет апоптоз в клетках и приводит к возникновению в них дополнительных онкогенных событий, способствующих прогрессированию опухоли.
Цель. Оценить частоту мутаций гена TP53 у пациентов с В-клеточными лимфомами высокой степени злокачественности «double-hit» (HGBL DH) и неуточненной (HGBL NOS); проанализировать связь с прогнозом заболевания.
Материалы и методы. Проанализирован ретроспективный материал из архива 10 больных с HGBL DH и 26 — с HGBL NOS. Медиана наблюдения составила 26,5 мес. (диапазон 0,6-160,9 мес.). Отбор выполняли по принципу наличия доступного биологического материала (парафиновые блоки) для проведения секвенирования по Сэнгеру последовательности гена TP53 с 5-го по 8-й эк-зон (кодирующих ДНК-связывающий домен гена TP53). Всем больным выполняли FISH-исследование опухоли с целью выявить транслокации с участием локусов генов c-MYC/8q24, BCL2/18q21 и BCL6/3q27. Для анализа различий между группами использовались тесты х2 и Манна—Уитни. Для оценки влияния молекулярных маркеров на прогноз заболевания проведен однофактор-ный событийный анализ (критерий Каплана—Мейера, лог-ранговый тест) и многофакторный регрессионный анализ Кокса.
Результаты. Мутации гена TP53 в клетках лимфомы выявлены у 13 (36 %) из 36 больных, 10 (77 %) из 13 — патогенные. У 8 из 10 больных с мутациями TP53 обнаружена транслокация с участием локуса гена c-MYC/8q24. Группы с диким (TP53-WT) и мутантным (TP53-MUT) типами гена TP53 были сопоставимы по основным клиническим характеристикам. Больные с TP53-MUT в опухолевых
TP53 Gene Mutations in Tumor Cells of Patients with Aggressive B-Cell Lymphomas
AE Misyurina1, SK Kravchenko1, VA Misyurin2, AM Kovrigina1, AU Magomedova1, EA Baryakh3, FE Babaeva1, AV Misyurin4
1 National Medical Hematology Research Center,
4a Novyi Zykovskii pr-d, Moscow, Russian Federation, 125167
2 NN Blokhin National Medical Cancer Research Center, 24 Kashirskoye sh., Moscow, Russian Federation, 115478
3 Municipal Clinical Hospital No. 52,
3 Pekhotnaya str., Moscow, Russian Federation, 123182
4 GenoTekhnologiya, 11 800-letiya Moskvy str., Moscow, Russian Federation, 127247
ABSTRACT
Background. TP53 gene mutations impede cell apoptosis and lead to additional oncogenic events contributing to tumor progression.
Aim. To assess TP53 gene mutation rate in patients with high-grade B-cell lymphoma double-hit (HGBCL DH) and not otherwise specified (HGBL NOS); to analyse its relationship with disease prognosis.
Materials & Methods. Retrospective materials from medical data of 10 HGBL DH and 26 HGBL NOS patients were analyzed. Median follow-up was 26.5 months (range 0.6-160.9 months). Selection was based on the presence of available biological materials (paraffin blocks) for Sanger sequencing of TP53 gene from exon 5 to exon 8 (encoding DNA-bind-ing domain of TP53 gene). FISH analysis of the tumor was performed in all patients to identify translocations involving c-MYC/8q24, BCL2/18q21, and BCL6/3q27 gene locus. To analyze differences between groups x2 and Mann-Whitney tests were applied. Univariate event analysis (Kaplan-Meier and log-rank tests) and Cox regression analysis were used to assess the influence of molecular markers on the disease prognosis.
Results. TP53 gene mutations in lymphoma cells were found in 13 (36 %) out of 36 patients, 10 (77 %) out of 13 mutations were pathogenic. In 8 out of 10 patients with TP53 mutations c-MYC/8q24 gene translocation was identified. Groups with wild (TP53-WT) and mutant (TP53-MUT) types of TP53 gene were similar in terms of main clinical characteristics. Patients with TP53-MUT in tumor cells showed worse 3-year overall survival (OS) compared with the group without TP53-MUT (30 % vs. 73 %; p = 0.026) as well as higher probability of disease progression in the period of 3 years (66 % vs. 15 %; p = 0.004). In multivariate analysis significant OS predictor was the presence of TP53 mutation (p = 0.006). Relapse/
© 2019 практическая медицина
263
клетках имели худшие показатели 3-летней общей выживаемости (ОВ) в сравнении с группой без TP53-MUT (30 vs 73 %; p = 0,026) и более высокую вероятность про-грессирования заболевания в течение 3 лет (66 vs 15 %; p = 0,004). При многофакторном анализе значимым фактором в отношении ОВ было наличие мутации гена TP53 (p = 0,006). Вероятность развития рецидивов/прогресси-рования повышалась при сочетании мутаций гена TP53 и транслокации с участием локуса гена c-MYC (p = 0,0003). Заключение. Сочетание транслокации с участием локуса гена c-MYC/8q24 и мутации гена TP53 в клетках опухоли при HGBL DH и HGBL NOS позволяет стратифицировать больных на группы риска рецидивов/прогрес-сирования лимфомы.
Ключевые слова: B-клеточная лимфома высокой степени злокачественности «double-hit», B-клеточная лимфома высокой степени злокачественности, неуточненная, мутация TP53 в опухолевых клетках, транслокация с участием локуса гена c-MYC.
progression probability was higher in combined cases of TP53 mutation and translocation involving c-MYC gene locus (p = 0.0003).
Conclusion. Translocation involving c-MYC gene along with TP53 gene mutation in tumor cells can serve as a criterion for dividing HGBL DH and HGBL NOS patients into different lymphoma relapse/progression risk groups.
Keywords: high-grade B-cell lymphoma double-hit, high-grade B-cell lymphoma not otherwise specified, TP53 mutation in tumor cells, translocation involving c-MYC gene locus.
Получено: 25 января 2019 г. Принято в печать: 3 июня 2019 г.
Received: January 25, 2019 Accepted: June 3, 2019
Для переписки: Анна Евгеньевна Мисюрина, канд. мед. наук, Новый Зыковский пр-д, д. 4а, Москва, Российская Федерация, 125167; тел.: +7(909)637-32-49; e-mail: anna.lukina1@gmail.com Для цитирования: Мисюрина А.Е., Кравченко С.К., Мисюрин В.А. и др. Мутации гена TP53 в опухолевых клетках у пациентов с агрессивными В-клеточными лимфомами. Клиническая онкогематология. 2019;12(3):263-70.
doi: 10.21320/2500-2139-2019-12-3-263-270
For correspondence: Anna Evgen'evna Misyurina, MD, PhD, 4a Novyi Zykovskii pr-d, Moscow, Russian Federation, 125167; Tel.: +7(909)637-32-49; e-mail: anna.lukina1@gmail.com For citation: Misyurina AE, Kravchenko SK, Misyurin VA, et al. TP53 Gene Mutations in Tumor Cells of Patients with Aggressive B-Cell Lymphomas. Clinical oncohematology. 2019;12(3):263-70 (In Russ).
doi: 10.21320/2500-2139-2019-12-3-263-270
ВВЕДЕНИЕ
Ген ТР53 человека расположен на коротком плече хромосомы 17 (17р13.1) и состоит из 11 экзонов [1-3]. Белок, кодируемый геном ТР53, является ключевым опухолевым супрессором, опосредующим остановку клеточного цикла, репарацию ДНК, апоптоз [4, 5]. Мутации ТР53 приводят к нарушению структуры и функции белка р53, а также служат главным механизмом инактивации ТР53 при многих видах опухолей. Посредством координированной работы генов ТР53 и с-ЫУС, кодирующего мощный транскрипционный фактор, осуществляется регуляция клеточной пролиферации и проапоптотических стимулов, препятствующих злокачественной трансформации [6]. Так, ген с-МУС активирует сигнальный каскад p19(ARF)-MDM2-TP53, нарушение одного или нескольких звеньев которого может служить пусковым фактором развития лимфомы.
Дисфункция ТР53 является одной из причин, способствующих развитию и прогрессированию лим-фоидных опухолей [7, 8]. ДНК-связывающий домен белка р53, кодируемый экзонами 4-8 гена ТР53, представляется наиболее важным в связи с тем, что с его помощью реализуется программа защиты организма от опухолевой трансформации его клеток [9, 10].
Проанализировав опубликованные данные о мутациях гена ТР53 в опухолевых клетках, становится очевидно, что большинство из них вызывает нарушение взаимодействия ТР53 и ДНК, что приводит к частичной или полной потере его функциональности [11-13]. В то время как инактивирующие мутации большинства генов-супрессоров опухолевого роста обусловливают отсутствие или укорочение белкового продукта, более 80 % мутаций гена ТР53 являются миссенс-мутациями, которые приводят к синтезу стабильного белка обычной длины [14]. Часто аминокислотная замена происходит в центральной части — ДНК-связывающем домене гена ТР53, что вызывает нарушение связывания р53 с ДНК и невозможность активировать транскрипцию целевых генов.
Различные мутации имеют разные последствия в отношении функции белка р53 [15, 16]. Некоторые мутации связаны с потерей функции, в то время как другие — с ее усилением. По этой причине прогностическое значение мутаций ТР53 в опухолевых клетках оказывается противоречивым в зависимости от исследуемого типа опухоли, методов определения, вариантов мутаций ТР53, применяемой терапии, многообразия механизмов, приводящих к инактивации функции гена ТР53, а также дополнительных генетических событий [9, 17, 18].
Наиболее ранним исследованием, в котором проанализирована роль мутаций гена TP53 в клетках опухоли у больных В-клеточными лимфомами, была работа K.H. Young и соавт. [19]. У 21,4 % больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой (ДВКЛ) были выявлены мутации в экзонах 5-9, 66 % из которых произошли в нуклеотидных последовательностях, которые являются ключевыми в связывании ДНК [19-21]. Наличие мутаций TP53 в ДНК-связывающем домене было независимым прогностическим фактором, связанным с более низкой выживаемостью больных ДВКЛ, получавших терапию CHOP, R-CHOP-21, согласно данным P. Peroja и соавт. [22].
A. Clipson и соавт. в 2015 г. показали, что прогноз больных ДВКЛ с транслокацией с участием локуса гена c-MYC зависит от присутствия дополнительных генетических нарушений [23]. В частности, наиболее негативным сочетанием было выявление транслокации с участием локуса гена c-MYC и мутации гена TP53 в клетках лимфомы. Это оказалось даже более неблагоприятным фактором в отношении показателей общей выживаемости (ОВ), чем выявление транслокаций с участием локусов генов c-MYC и BCL2/ BCL6. Прогностической значимости наличия мутации гена TP53 в опухолевых клетках при ДВКЛ в отсутствие транслокации с участием локуса гена c-MYC не получено.
Ранее, в 2014 г., S.M. Aukema и соавт. показали, что «single-hit» лимфомы характеризуются столь же плохим прогнозом, как и «double-hit» лимфомы в условиях применения схемы R-CHOP-21 [24]. Это может объясняться тем, что помимо выявления транслокации с участием локуса гена c-MYC в клетках опухоли возможно присутствие и других генетических нарушений, в частности мутации гена TP53, которые не определялись в данном исследовании. Кроме того, объяснением может служить тот факт, что терапия по схеме R-CHOP-21 не является оптимальной у больных с реаранжировкой гена c-MYC.
Известно, что среди агрессивных В-клеточных лимфом наиболее трудно поддается лечению группа «double-hit» лимфом (в классификации опухолей кроветворной и лимфоидной тканей Всемирной организации здравоохранения 2017 г. — High-grade B-cell lymphoma double-hit, HGBL DH, — В-клеточная лим-фома высокой степени злокачественности «doublehit») [25]. Лишь половине больных удается преодолеть медиану ОВ в 24 мес. Группа больных с В-клеточной лимфомой высокой степени злокачественности, не-уточненной (High-grade B-cell lymphoma not otherwise specified, HGBL NOS) является более гетерогенной по составу и результатам лечения. Так, у части больных при цитогенетическом исследовании может выявляться транслокация с участием локуса гена c-MYC.
Прогностическое значение обнаружения мутации гена TP53 в опухолевых клетках у больных HGBL NOS и HGBL DH ранее не было исследовано. В 2015 г. опубликованы данные секвенирования гена TP53 в образцах опухоли больных HGBL DH (экзоны 4-11) [26]. N. Gebauer и соавт. показали, что чаще мутации гена TP53 в биоптатах опухоли встречаются у больных с MYC+/BCL2+, чем у больных с MYC+/BCL6+ «doublehit» лимфомой. Прогностическое значение выявления
мутаций гена TP53 в клетках лимфомы у исследуемой группы пациентов не изучалось. Авторы предполагают, что мутации TP53 в опухолевых клетках могут быть ранним событием развития лимфомы «doublehit», т. к. они чаще выявлялись у больных с фолликулярной лимфомой в анамнезе.
В контексте обсуждения роли мутаций TP53 следует подчеркнуть различия между терминами «мутация» и «делеция». Так, в ряде случаев при цитоге-нетическом исследовании опухолевого образца может выявляться делеция короткого плеча хромосомы 17, приводящая к моносомии гена TP53/17p13 (потере гетерозиготности гена TP53). Прогностическая роль этого события неоднозначна. По данным имеющихся публикаций, аллельная делеция TP53/17p13 сама по себе не связана с плохим прогнозом при ДВКЛ [27], т. к. может быть компенсирована функцией нормальной копии гена. Возможно, потеря гетерозиготности гена TP53 происходит вслед за появлением мутации гена TP53, которая, в свою очередь, предрасполагает к иммортализации опухолевых клеток и дальнейшему прогрессированию заболевания. Другими же авторами была опубликована работа о прогностической значимости аномалий гена TP53 у больных ДВКЛ без учета механизма ее возникновения (мутация либо делеция), однако правомочность такого объединения представляется спорной [28].
Таким образом, мутации в гене TP53 (TP53-MUT) приводят к усилению жизнеспособности опухолевых клеток и возникновению в них дополнительных онкогенных событий, способствующих опухолевой прогрессии.
Цель настоящего исследования — оценить частоту мутаций гена TP53 у пациентов с HGBL NOS и HGBL DH, проанализировать связь с прогнозом заболевания.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Нами проанализирован ретроспективный материал из архива 10 больных HGBL DH и 26 больных HGBL NOS. Отбор осуществляли по принципу наличия доступного биологического материала (парафиновые блоки) для проведения секвенирования по Сэнгеру гена TP53 с 5-го по 8-й экзон. Выделение ДНК из парафиновых блоков биоптатов опухоли проводилось с помощью набора Extra-DNA («ГеноТехнология», Россия) по инструкции, предоставленной разработчиками. Амплификация последовательности гена TP53 выполнялась с помощью пар праймеров TGTTCACTTGTGCCCTGACT и GGAGGGCCACTGACAACCA (экзоны 5-6), ACTGGCCTCATCTTGGGCCT и GTCAGAGG-CAAGCAGAGGCT (экзон 7), TAAATGGGACAGGTAGGACC и TCCACCGCTTCTTGTCCTGC (экзон 8). Секвенирование полученных ампликонов проводилось на генетическом анализаторе ABPrizm 310 (Applied Biosystems, США) в полном соответствии с протоколами, предоставленными разработчиками. Всем больным выполнялось цитогенетическое исследование методом флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) на би-опсийном материале с целью выявить транслокации с участием локуса генов c-MYC/8q24, BCL2/18q21 и
BCL6/3q27. У 2 больных не удалось определить статус гена c-MYC ввиду низкого качества парафинового материала. Стандартное цитогенетическое исследование проведено в дебюте заболевания 8 больным с целью установить развернутый кариотип опухолевых клеток. Диагнозы HGBL NOS и HGBL DH подтверждены в референсной лаборатории ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России в соответствии с классификацией опухолей кроветворной и лимфоидной тканей ВОЗ 2017 г. Из анализа исключены пациенты, у которых опухоль возникла в результате трансформации фолликулярной лимфомы. Было получено информированное согласие пациентов на анализ клинических данных, результатов лечения и проведения дополнительной лабораторной диагностики биологического материала опухолевой ткани из архива.
Статистический анализ
Анализ клинических характеристик в группах больных проводился с помощью критериев х2 и Манна—Уитни. Для оценки влияния мутаций гена TP53 в клетках лимфомы на параметры ОВ и вероят-
Таблица 1. Клиническая характеристика больных
Медиана (диапазон) возраста, лет 46 (25-77) 46 (30-69) 0,97
Вовлечение ЦНС 3/25 (12 %) 2/10 (20 %) 0,54
ECOG — Eastern Cooperative Oncology Group; HGBL DH — В-клеточная лимфома высокой степени злокачественности «double-hit»; HGBL NOS — В-клеточная лимфома высокой степени злокачественности «double-hit», неуточненная; ЛДГ — лактатдегидрогеназа.
ность рецидивов/прогрессирования заболевания проведен однофакторный событийный анализ (критерий Каплана—Мейера, лог-ранговый тест) и многофакторный регрессионный анализ Кокса ^ТАТ^Т!СА 10).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Медиана наблюдения за больными составила 26,5 мес. (диапазон 0,6-160,9 мес.). Клиническая характеристика пациентов с HGBL NOS и HGBL DH в дебюте заболевания представлена в табл. 1. Больные были сопоставимы по основным клиническим характеристикам, которые отражали агрессивные варианты В-клеточных лимфом.
Из 10 больных HGBL DH 4 имели транслокации c-MYC/BCL6, 6 — c-MYC/BCL2. У 7 больных HGBL NOS выявлена транслокация с участием локуса гена c-MYC/8q24. Секвенирование по Сэнгеру экзонов 5-6, 7 и 8 гена TP53 выполнено всем больным. У всех пациентов получены результаты секвенирования хотя бы по двум регионам (экзонам 5-6, и/или 7, и/ или 8 гена TP53). У 13 (36 %) больных выявлены миссенс-мутации гена TP53 (TP53-MUT) в опухолевых клетках. У 10 (77 %) из 13 пациентов TP53-MUT были патогенные, согласно базе данных COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) (табл. 2). При HGBL DH патогенные мутации TP53 выявлены в клетках опухоли у 3 (30 %) из 10 больных, при HGBL NOS — у 7 (27 %) из 26. Ввиду небольшого объема выборки трудно экстраполировать наши данные на частоту обнаружения TP53-MUT у больных HGBL NOS и HGBL DH, тем не менее она оказалась выше, чем при ДВКЛ (20 %). В анамнезе у пациентов и их родственников не было первично-множественных опухолей, что косвенно может свидетельствовать об отсутствии синдрома Ли—Фраумени.
Группы больных с диким типом гена TP53 (TP53-WT) и TP53-MUT в опухолевых клетках были сопоставимы по основным клиническим характеристикам (табл. 3). У большинства больных выявлялись распространенная стадия заболевания по классифи-
HGBL NOS, HGBL DH,
Показатель n = 26 n = 10 p
Соотношение мужчин/женщин 14:12 4:6 0,46
Вовлечение костного мозга 9/26 (35 %) 6/10 (60 %) 0,17
В-симптомы 11/26 (42 %) 7/10 (70 %) 0,14
Активность ЛДГ выше нормы 22/26 (85 %) 8/9 (89 %) 0,75
Таблица 2. Характеристика мутации гена TP53 в опухолевых клетках
Мутация ДНК, Тип функциональности Когда-либо Пациент Тип доля мутантного Аминокислотные согласно COSMIC, подтверждена как №_лимфомы_аллеля_замены в белке_Тип мутации_(баллы)_соматическая
1 HGBL DH c.487T>A, 25,2 % p.Y163N Замена - миссенс Патогенная (0,99) Да
2 HGBL DH c.524G>C, 15,6 % p.R175P Замена - миссенс Патогенная (0,99) Нет
3 HGBL DH c.770T>A, 32,4 % p.L257Q Замена - миссенс Патогенная (0,99) Да
4 HGBL NOS c.541C>T, 29 % p.R181C Замена - миссенс Патогенная (0,99) Да
5 HGBL NOS c.523C>T, 10,1 % p.R175C Замена - миссенс Патогенная (0,97) Да
6 HGBL NOS c.535C>T, 45,6 % p.H179Y Замена - миссенс Патогенная (1,00) Да
7 HGBL NOS c.824G>A, 75 % p.C275Y Замена - миссенс Патогенная (1,00) Да
8 HGBL NOS c.713G>A, 87,7 % p.C238Y Замена - миссенс Патогенная (0,99) Да
9 HGBL NOS c.517G>A, 22,4 % p.V173M Замена - миссенс Патогенная (0,99) Да
10 HGBL NOS c.745A>G, 31,9 % p.R249G Замена - миссенс Нейтральная (0.41) Да
11 HGBL NOS c.639A>G, 41,8 % p.R213R Замена - молчащая Нейтральная (0,19) Да
12 HGBL NOS c.639A>G, 48,5 % p.R213R Замена - молчащая Нейтральная (0,19) Да
13 HGBL NOS c.743G>A, 75,6 %
p.R247Q Замена - миссенс Патогенная (0,98) Да
HGBL DH - В-клеточная лимфома высокой степени злокачественности «double-hit»; HGBL NOS - В-клеточная лимфома высокой степени злокачественности «double-hit», неуточненная.
Таблица 3. Клиническая характеристика больных с TP53-MUT и TP53-WT
TP53-MUT, TP53-WT,
Показатель n = 13 n = 23 P
Соотношение мужчин/женщин 7:6 11:23 0,18
Медиана (диапазон) возраста, лет 37 (25-62) 51 (23-77) 0,51
III-IV стадия по классификации Ann Arbor 12/13 (92 %) 19/23 (83 %) 0,42
Статус по шкале ECOG > 2 баллов 10/13 (77 %) 20/23 (87 %) 0,44
Поражение > 1 экстранодальной области 11/13 (85 %) 15/23 (65 %) 0,21
Вовлечение ЦНС 2/12 (17 %) 3/23 (13 %) 0,77
Вовлечение костного мозга 4/13 (31 %) 11/23 (48 %) 0,32
В-симптомы 9/13 (69 %) 9/23 (39 %) 0,08
Активность ЛДГ выше нормы 13/13 (100 %) 17/23 (74 %) 0,05
«Double-hit» лимфома 3/12 (25 %) 7/22 (32 %) 0,68
Транслокация с участием локуса гена c-MYC/8q24 3/12 (25 %) 4/22 (18 %) 0,64
ECOG — Eastern Cooperative Oncology Group; TP53-MUT — мутантный тип TP53; TP53-WT — дикий тип TP53; ЛДГ — лактатдегидрогеназа.
кации Ann Arbor, отягощенный соматический статус, поражение более одной экстранодальной области. Активность ЛДГ была повышена у больных с TP53-MUT (p = 0,05).
У 2 больных HGBL DH с наличием TP53-MUT в опухолевых клетках выявлены транслокации с участием локусов генов c-MYC/8q24 и BCL6/3q27, у 1 — c-MYC/8q24 и BCL2/18q21. У 3 пациентов из группы HGBL NOS с TP53-MUT обнаружена транслокация с участием локуса гена c-MYC. Из 8 больных, которым выполнялось комплексное исследование кариотипа, делеция 17p13 была у 2, у 1 — дериват хромосомы 17, у 1 — дополнительный сигнал от хромосомы 17.
При оценке влияния TP53-MUT на параметры ОВ и вероятность развития рецидивов/прогрессирования заболевания учитывались только патогенные мутации (10 из 13).
Лечение проводилось по интенсифицированным программам большинству пациентов. Так, лишь 4 (12 %) из 33 больных с TP53-WT в опухолевых клетках получили лечение по схеме R-CHOP-21, 8 (24 %) — по схеме R-DA-EPOCH, 21 (64 %) — ЛБ-М-04 с ритукси-мабом. Соотношение в группах больных с TP53-MUT и TP53-WT по видам терапии было сопоставимо. У 6 (60 %) из 10 больных с TP53-MUT отмечено раннее прогрессирование заболевания (2 — HGBL DH и 4 — HGBL NOS) в сравнении с 4 (17 %) из 23 с TP53-WT (из них 1 — HGBL DH и 3 — HGBL NOS). Летальный исход от осложнений произошел у 1 (10 %) из 10 и 1 (4 %) из 23 больных с TP53-MUT и TP53-WT соответственно. Трансплантация аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (аутоТГСК) выполнена всего 9 больным: 3 (30 %) из 10 в группе с TP53-MUT и 6 (26 %) из 23 — с TP53-WT(p > 0,05). В группе TP53-MUT3 из 10 больных HGBL DH, которым проведена аутоТГСК, остаются под наблюдением в ремиссии. У 2 из 10 больных из группы TP53-WT отмечались рецидивы/прогрессирование заболевания, несмотря на аутоТГСК. Мы не наблюдали неудач аутоТГСК в группе TP53-MUT. Тем не менее возможность реализовать аутоТГСК была только у больных, достигших полной ремиссии.
По результатам однофакторного анализа больные с TP53-MUT имели худшие показатели ОВ и более высокую вероятность прогрессирования HGBL DH и HGBL NOS в сравнении с пациентами из группы с TP53-WT. Так, 3-летняя ОВ больных с TP53-MUTв сравнении с группой TP53-WT составила 30 vs 73 % (p = 0,026), вероятность рецидивов/прогрессирования заболевания в течение 3 лет — 66 vs 15 % соответственно (p = 0,004). Сочетание двух генетических аномалий в клетках лимфомы MYC+/TP53+ оказывало негативное влияние на ОВ и вероятность рецидивов/прогрес-сирования заболевания в течение 3 лет наблюдения (3-летняя ОВ составила 17 и 68 % в группах больных с MYC+/TP53+ и без сочетания указанных аномалий, p = 0,04; вероятность рецидивов/прогрессирования заболевания — 83 и 18 % соответственно, p = 0,002) (рис. 1 и 2).
По результатам анализа влияния мутации гена TP53 в опухолевых клетках у больных с транслокацией с участием локуса гена c-MYC мы получили данные о том, что ее наличие значимо повышает вероятность рецидивов/прогрессирования HGBL DH и HGBL NOS (83 % в группе MYC+/TP53+ vs 20 % в группе с MYC+/ TP53-; p = 0,01) и имеет тенденцию к прогностической значимости в отношении влияния на 3-летнюю ОВ (17 vs 71 % соответственно; p = 0,06). Многофакторный анализ проведен путем пошаговой селекции. Исходно в анализ были включены такие факторы, как транслокация с участием гена c-MYC, «double-hit» лимфома, мутация гена TP53 в клетках лимфомы, сочетание мутации гена TP53 и транслокации гена c-MYC (MYC+/ TP53+), мутации гена TP53 в сочетании со статусом «double-hit», аутоТГСК. При регрессионном анализе Кокса единственным значимым фактором, влияющим на ОВ у больных HGBL DH и HGBL NOS, была мутация гена TP53, выявляемая в биоптате опухолевой ткани (p = 0,04). На вероятность рецидивов/прогрессирования HGBL DH и HGBL NOS влияло сочетание мутации гена TP53 и транслокации с участием локуса гена c-MYC (MYC+/TP53+) (p = 0,002).
ОБСУЖДЕНИЕ
Мутации TP53 в клетках ДВКЛ выявляются в 20 % случаев и статистически значимо связаны с худшими показателями ОВ как в ABC-(non-GCB), так и GCB-подгруппе при лечении по схеме R-CHOP-21 [19, 27, 29].
В исследовании, проведенном Z.Y. Xu-Monette и соавт. в 2012 г., показано, что у больных ДВКЛ с транслокацией гена c-MYC с высокой частотой обнаруживаются мутации гена TP53 в опухолевых клетках. Показатели ОВ больных с транслокацией гена c-MYC и мутацией TP53 даже хуже, чем у пациентов с MYC+/ BCL2+ ДВКЛ, что обосновывает необходимость выявления мутации гена TP53 с целью определить группу риска неблагоприятного исхода у этих больных. В проведенном нами исследовании впервые оценена частота обнаружения мутаций у больных HGBL DH и HGBL NOS. Мутация TP53 в клетках опухоли выявлена с одинаковой частотой в группах больных с реаран-жировкой гена c-MYC и без нее (7/18 и 5/16; p = 0,64).
100
90 ■
80'
¡2 70
и о
= 60
50
m 40 ■ в ш
3 30 \о О 20 j-
10
Кривые Каплана—Мейера О завершившие + цензурированные
к
■ Без TP53+/MYC+, n = 25
■ TP53+/MYC+, n = 6 p = 0,04
10 20 30 40 50 60 Время, мес.
v»100 в
s 90 ■
<s
m
о 80 И 70 f
о 60'
О.
50
70 80 90 100
g 40 ■
20
о 10
ф Dû
Кривые Каплана—Мейера О завершившие + цензурированные
■ Без TP53+/MYC+, n =
■ TP53+/MYC+, n = 6 p = 0,002
25
Рис. 1. Общая выживаемость в группах больных с сочетанием мутации гена TP53 и транслокации с участием локуса гена c-MYC (TP53+/MYC+) в опухолевых клетках и отсутствием TP53+/MYC+
Fig. 1. Overall survival in combined cases of TP53 mutation and translocation involving c-MYC gene locus (TP53+/MYC+) in tumor cells and in cases without TP53+/MYC+
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Время, мес.
Рис. 2. Вероятность развития рецидивов/прогрессирования в группах больных с сочетанием мутации гена TP53 и транслокации с участием локуса гена c-MYC (TP53+/MYC+) в опухолевых клетках и отсутствием TP53+/MYC+
Fig. 2. Relapse/progression probability in combined cases of TP53 mutation and translocation involving c-MYC gene locus (TP53+/ MYC+) in tumor cells and in cases without TP53+/MYC+
& 30
0
0
C. Schuster и соавт. в 2011 г. показали, что у Em-Myc-мышей при потере функции p53 выживаемость была значительно хуже, чем у мышей, лимфоидные опухоли которых характеризовались гиперэкспрессией Bcl2 [30]. Таким образом, в настоящее время концепция молекулярного патогенеза лимфоидных опухолей подразумевает поиск кооперирующих генетических событий, которыми могут быть опосредованы различия в чувствительности к иммунохимиотерапии. В отношении агрессивных В-клеточных лимфом с реаранжировкой гена c-MYC верно то, что их прогноз зависит от наличия дополнительных генетических нарушений [31]. Так, у ряда больных следует проводить цитогенетическое исследование для выявления транслокаций с участием локусов генов BCL2 и BCL6, а также секвенирование для определения мутаций гена TP53 [27].
Следует подчеркнуть, что иммуногистохимиче-ский метод позволяет судить о наличии мутаций гена TP53 с поправкой на тип мутации. Это обусловлено тем, что в 17 % случаев мутации гена TP53, такие как сдвиг рамки считывания и нонсенс-мутации, приводят к укорочению белкового продукта, который не определяется с помощью иммуногистохимического исследования [29]. В связи с этим в настоящем исследовании не проводилась иммуногистохимическая оценка экспрессии белка p53.
В ретроспективном исследовании A.I. Schiefer и соавт. оценивалась прогностическая значимость сочетания наличия делеций или мутаций гена TP53 (TP53+) в опухолевых образцах и транслокаций с участием локусов генов c-MYC и BCL2 у 101 больного ДВКЛ [28]. У 53 пациентов выявлена транслокация с участием локуса гена c-MYC. Больные ДВКЛ с TP53+ имели худшие результаты терапии в сравнении с
группой TP53- (частота полных ремиссий составила 34,4 vs 60,9 %; p = 0,01). Аномалии гена TP53 были независимым прогностическим фактором при многофакторном анализе (p = 0,01). На первый взгляд результаты этой исследовательской группы противоречат концепции о том, что наиболее сильным негативным фактором прогноза является статус «double-hit». Так, больные с одной транслокацией с участием локуса гена c-MYC/8q24, а также пациенты с аномалиями TP53 в сочетании с транслокациями генов c-MYC и BCL2 имели наиболее благоприятные результаты терапии (медиана выживаемости не достигнута), так же как и в отсутствие данных аномалий (медиана выживаемости 65 мес.). У больных с MYC+/BCL2+ «double-hit» лимфомой медиана выживаемости составила 28 мес., у больных с MYC+/ TP53+ — 10 мес., у больных с аномалиями гена TP53 в клетках лимфомы — 12 мес. Это соотносится c полученными нами результатами в отношении больных HGBL NOS и HGBL DH и свидетельствует о том, что необходимо детальное исследование дополнительных механизмов молекулярного патогенеза лимфоидных опухолей. Однако авторы не оценивают вклад определенного типа аномалий гена TP53 (мутации/делеции) отдельно, которые могут иметь различное функциональное значение в опухолевой клетке.
A. Clipson и соавт. в 2015 г. показали, что случаи с сочетанием всех трех событий MYC+/BCL2+/TP53+ (n = 9) имели худшие показатели ОВ, чем больные с MYC+/TP53+ (n = 13) и MYC+/BCL2+ (n = 25). При многофакторном анализе неблагоприятное влияние на прогноз заболевания оказывало именно сочетание MYC+/ TP53+ вне зависимости от наличия или отсутствия перестройки гена BCL2 [23].
В проведенном нами исследовании сочетание MYC+/TP53+ в опухолевых клетках значимо повышало вероятность рецидивов/прогрессирования HGBL DH и HGBL NOS в течение 3-лет (83 и 20 % в группах больных с транслокацией локуса гена c-MYC и наличием TP53-MUT либо TP53-WT в клетках опухоли; p = 0,01) и имело тенденцию к прогностической значимости в отношении 3-летней ОВ (14 и 71 % соответственно; p = 0,06).
Интересен факт нивелирования негативного влияния, оказываемого наличием одновременно 2 транслокаций с участием локусов генов c-MYC/8q24 и BCL2/18q21 в присутствии мутации гена TP53 [28]. Известно, что c-MYC способен препятствовать злокачественной опухолевой трансформации двумя способами. Во-первых, путем индукции p19ARF происходит активация p53, что по принципу обратной связи блокирует MDM2, вызывая апоптоз и старение клеток [32]. Во-вторых, высокий уровень экспрессии c-MYC подавляет экспрессию антиапоптотического фактора BCL2 и факторов семейства BCL-xL [33, 34]. Это взаимодействие в норме обеспечивает баланс между про-и антиапоптотическими факторами, что увеличивает чувствительность клеток к проапоптотическим стимулам. TP53 может индуцировать апоптоз путем прямого связывания с BCL2 и членами его семейства, приводя к активации BAX и индукции формирования апоптосомы. При условии нарушения этого механизма вследствие потери функции TP53 по причине делеций или мутаций либо гиперэкспрессии BCL2 может произойти бесконтрольная клеточная пролиферация [30]. Однако в 2011 г. C. Schuster и соавт. описан феномен «уравновешивания» негативного влияния BCL2 в комбинации с потерей функции TP53 на модели трансгенных Em-Myc-мышей. Блокирование апоптоза в клетках с дефицитом р53 вследствие гиперэкспрессии BCL2 может замедлить прогрессиро-вание лимфоидной опухоли посредством попадания злокачественных клеток в «окно иммунологической видимости» для NK- и Т-клеток [30]. Таким образом, для развития лимфомы требуются дополнительные генетические изменения, которые часто включают потерю TP53 или избыточную экспрессию BCL2.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Мутация гена TP53 в опухолевых клетках встречается с высокой частотой у больных HGDL DH и HGBL NOS (30 и 27 % соответственно). Нет определенных клинических признаков, позволяющих заподозрить наличие TP53-MUT, за исключением того, что больные с TP53-MUT чаще имеют высокие значения активности ЛДГ. Сочетание мутации гена TP53 в опухолевых клетках и транслокации с участием локуса гена c-MYC позволяет стратифицировать HGDL DH и HGBL NOS на группы риска рецидивов/прогрессирования заболевания. Целесообразно проводить скрининг мутаций гена TP53 в клетках лимфомы у больных HGDL DH и HGBL NOS ввиду того, что транслокация локуса гена c-MYC в них обнаруживается чаще, нежели у больных ДВКЛ. В случае первично-резистентных HGDL DH и HGBL NOS необходимы новые подходы к терапии.
КОНФЛИКТЫ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов. А.М. Ковригина, член редакционной коллегии журнала «Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика», не участвовала в рецензировании рукописи.
ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ
Исследование не имело спонсорской поддержки.
ВКЛАД АВТОРОВ
Концепция и дизайн: А.Е. Мисюрина, С.К. Кравченко, В.А. Мисюрин.
Сбор и обработка данных: А.Е. Мисюрина, В.А. Мисюрин, А.М. Ковригина, А.У Магомедова, Е.А. Барях, Ф.Э. Бабаева.
Анализ и интерпретация данных: А.Е. Мисюрина, В.А. Мисюрин, А.В. Мисюрин.
Подготовка рукописи: А.Е. Мисюрина, В.А. Мисюрин. Окончательное одобрение рукописи: А.Е. Мисюрина, С.К. Кравченко, В.А. Мисюрин.
БЛАГОДАРНОСТИ
Авторы статьи выражают благодарность всем сотрудникам лабораторий и клинических подразделений, участвовавших в проведении исследования.
flMTEPATYPA/REFERENCES
1. Matlashewski G, Lamb P, Pim D, et al. Isolation and characterization of a human p53 cDNA clone: expression of the human p53 gene. EMBO J. 1984;3(13):3257-62. doi: 10.1002/j.1460-2075.1984.tb02287x.
2. Kern SE, Kinzler KW, Bruskin A, et al. Identification of p53 as a sequence-specific DNA-binding protein. Science. 1991;252(5013):1708-11. doi: 10.1126/ science.2047879.
3. McBride OW, Merry D, Givol D. The gene for human p53 cellular tumor antigen is located on chromosome 17 short arm (17p13). Proc Natl Acad Sci USA. 1986;83(1):130-4. doi: 10.1073/pnas.83.1.130.
4. Levine AJ, Oren M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat Rev Cancer. 2009;9(10):749-58. doi: 10.1038/nrc2723.
5. Vousden KH, Prives C. Blinded by the light: the growing complexity of p53. Cell. 2009;137(3):413-31. doi: 10.1016/j.cell.2009.04.037.
6. Eischen CM, Weber JD, Roussel MF, et al. Disruption of the ARF-Mdm2-p53 tumor suppressor pathway in Myc-induced lymphomagenesis. Genes Dev. 1999;13(20):2658-69. doi: 10.1101/gad.13.20.2658.
7. Donehower LA, Harvey M, Slagle BL, et al. Mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to spontaneous tumours. Nature. 1992;356(6366):215-21. doi: 10.1038/356215a0.
8. Gudkov AV, Komarova EA. The role of p53 in determining sensitivity to radiotherapy. Nat Rev Cancer. 2003;3(2):117-29. doi: 10.1038/nrc992.
9. Xu-Monette ZY, Medeiros LJ, Li Y, et al. Dysfunction of the TP53 tumor suppressor gene in lymphoid malignancies. Blood. 2012;119(16):3668-83. doi: 10.1182/ blood-2011-11-366062.
10. Mihara M, Erster S, Zaika A, et al. p53 has a direct apoptogenic role at the mitochondria. Mol Cell. 2003;11(3):577-90. doi: 10.1016/s1097-2765(03)00050-9.
11. Petitjean A, Mathe E, Kato S, et al. Impact of mutant p53 functional properties on TP53 mutation patterns and tumor phenotype: lessons from recent developments in the IARC TP53 database. Hum Mutat. 2007;28(6):622-9. doi: 10.1002/humu.20495.
12. Young KH, Weisenburger DD, Dave BJ, et al. Mutations in the DNA-binding codons of TP53, which are associated with decreased expression of TRAIL receptor-2, predict for poor survival in diffuse large B-cell lymphoma. Blood. 2007;110(13):4396-405. doi: 10.1182/blood-2007-02-072082.
13. Haupt S, Raghu D, Haupt Y. Mutant p53 drives cancer by subverting multiple tumor suppression pathways. Front Oncol. 2016;6:12. doi: 10.3389/ fonc.2016.00012.
14. Soussi T, Beroud C. Assessing TP53 status in human tumours to evaluate clinical outcome. Nat Rev Cancer. 2001;1(3):233-9. doi: 10.1038/35106009.
15. Soussi T, Lozano G. P53 mutation heterogeneity in cancer. Biochem Bio-phys Res Commun. 2005;331(3):834-42. doi: 10.1016/j.bbrc.2005.03.190.
16. Kato S, Han SY, Liu W, et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100(14):8424-9. doi: 10.1073/pnas.1431692100.
17. Xu-Monette ZY, Young KH. The TP53 tumor suppressor and autophagy in malignant lymphoma. Autophagy. 2012;8(5):842-5. doi: 10.4161/auto.19703.
18. Vousden KH, Prives C. P53 and prognosis: new insights and further complexity. Cell. 2005;120(1):7-10. doi: 10.1016/s0092-8674(04)01252-8.
19. Young KH, Leroy K, Moller MB, et al. Structural profiles of TP53 gene mutations predict clinical outcome in diffuse large B-cell lymphoma: an international collaborative study. Blood. 2008;112(8):3088-98. doi: 10.1182/blood-2008-01-129783.
20. Joerger AC, Ang HC, Fersht AR. Structural basis for understanding oncogenic p53 mutations and designing rescue drugs. Proc Natl Acad Sci USA. 2006;103(41):15056-61. doi: 10.1073/pnas.0607286103.
21. Joerger AC, Fersht AR. Structural biology of the tumor suppressor p53. Annu Rev Biochem. 2008;77(1):557-82. doi: 10.1146/annurev.biochem.77.060806.091238.
22. Peroja P, Pedersen M, Mantere T, et al. Mutation of TP53, translocation analysis and immunohistochemical expression of MYC, BCL-2 and BCL-6 in patients with DLBCL treated with R-CHOP. Sci Rep. 2018;8(1):14814. doi: 10.1038/ s41598-018-33230-3.
23. Clipson A, Barrans S, Zeng N, et al. The prognosis of MYC translocation positive diffuse large B-cell lymphoma depends on the second hit. J Pathol Clin Res. 2015;1(3):125-33. doi: 10.1002/cjp2.10.
24. Aukema SM, Kreuz M, Kohler CW, et al. Biological characterization of adult MYC-translocation-positive mature B-cell lymphomas other than molecular Burkitt lymphoma. Haematologica. 2014;99(4):726-35. doi: 10.3324/ haematol.2013.091827.
25. Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al. Classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. WHO classification of tumours. Revised 4th edition, Vol. 2. Lyon: IARC Press; 2017.
26. Gebauer N, Bernard V, Gebauer W, et al. TP53 mutations are frequent events in double-hit B-cell lymphomas with MYC and BCL2 but not MYC and BCL6 translocations. Leuk Lymphoma. 2015;56(1):179-85. doi: 10.3109/10428194.2014.907896.
27. Xu-Monette ZY, Wu L, Visco C, et al. Mutational profile and prognostic significance of TP53 in diffuse large B-cell lymphoma patients treated with R-CHOP: report from an International DLBCL Rituximab-CHOP Consortium Program Study. Blood. 2012;120(19):3986-96. doi: 10.1182/blood-2012-05-433334.
28. Schiefer AI, Kornauth C, Simonitsch-Klupp I, et al. Impact of Single or Combined Genomic Alterations of TP53, MYC, and BCL2 on survival of patients with diffuse large B-cell lymphomas: A retrospective cohort study. Medicine (Baltimore). 2015;94(52):e2388. doi: 10.1097/MD.0000000000002388.
29. Hu S, Xu-Monette ZY, Tzankov A, et al. MYC/BCL2 protein coexpression contributes to the inferior survival of activated B-cell subtype of diffuse large B-cell lymphoma and demonstrates high-risk gene expression signatures: a report from the international DLBCL rituximab-CHOP consortium program. Blood. 2013;121(20):4021-31. doi: 10.1182/blood-2012-10-460063.
30. Schuster C, Berger A, Hoelzl MA, et al. The cooperating mutation or "second hit" determines the immunologic visibility toward MYC-induced murine lymphomas. Blood. 2011;118(17):4635-45. doi: 10.1182/blood-2010-10-313098.
31. Tzankov A, Xu-Monette ZY, Gerhard M, et al. Rearrangements of MYC gene facilitate risk stratification in diffuse large B-cell lymphoma patients treated with rituximab-CHOP. Mod Pathol. 2014;27(7):958-71. doi: 10.1038/modpathol.2013.214.
32. Moll UM, Wolff S, Speidel D, Deppert W. Transcription-independent pro-apoptotic functions of p53. Curr Opin Cell Biol. 2005;17(6):631-6. doi: 10.1016/j. ceb.2005.09.007.
33. MacLean KH, Keller UB, Rodriguez-Galindo C, et al. c-Myc augments gamma irradiation-induced apoptosis by suppressing Bcl-XL. Mol Cell Biol 2003;23(20):7256-70. doi: 10.1128/mcb.23.20.7256-7270.2003.
34. Adams JM, Harris AW, Pinkert CA, et al. The c-myc oncogene driven by immunoglobulin enhancers induces lymphoid malignancy in transgenic mice. Nature. 1985;318(6046):533-8. doi: 10.1038/318533a0.
