Научная статья на тему 'Мультиплексный анализ наркотических средств на основе технологии иммуночипов Фосфан'

Мультиплексный анализ наркотических средств на основе технологии иммуночипов Фосфан Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
226
82
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ФОСФАН / МУЛЬТИПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ / MULTIPLEX ANALYSIS / БИОЧИПЫ / НАРКОТИКИ / МОРФИН / MORPHINE / КОКАИН / COCAINE / КАННАБИНОИДЫ / CANNABINOIDS / АМФЕТАМИНЫ / AMPHETAMINES / БЕНЗОДИАЗЕПИНЫ / БАРБИТУРАТЫ / BARBITURATES / PHOSPHAN / BIOCHIP / NARCOTICS / BENZODIAZEPINE

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Бекман Наталья Игоревна, Помелова В.Г., Осин Н.С.

Разработан новый метод мультиплексного количественного анализа наркотических, психотропных средств на основе технологии Фосфан с использованием иммуночипов в формате стандартных 96-луночных планшетов, моноклональных антител к наркотическим соединениям и Pt-копропорфирина в качестве длительно люминесцирующего метчика. Для мультиплексного анализа используется 20 мкл биологической жидкости человека (мочи, сыворотки крови или слюны) или 2 диска диаметром 3,2 мм из высушенного на бумаге пятна мочи. Не требуется предварительная обработка или разведение исследуемой пробы. Продемонстрирован широкий диапазон измеряемых концентраций при высокой чувствительности анализа: 1 нг/мл морфина и метадона, 0,5 нг/мл барбитуратов, 2 нг/мл бензоилэкгонина, метамфетамина, каннабиноидов и бензодиазепинов, 8 нг/мл амфетамина при вариабельности результатов не более 15%. Апробация метода на аттестованных образцах мочи (n = 197) и сывороток крови (n = 98) показала, что метод позволяет правильно определять опиаты, кокаин, каннабиноиды, метадон, бензодиазепины, барбитураты и амфетамины при отсутствии ложноположительных результатов при исследовании образцов, содержащих ненаркотические лекарственные средства. Результаты исследования высушенных на бумаге проб мочи (n = 50) хорошо совпадали с результатами анализа жидких проб для всех исследуемых аналитов. На основе предложенного мультиплексного анализа разработана тест-система Нарк-Фосфан для количественного исследования одновременно до 96 проб различных биологических жидкостей, в том числе в виде высушенных на бумаге пятен. Продемонстрированные высокая чувствительность, специфичность и точность анализа при определении наиболее распространённых наркотических средств позволяют предложить его в качестве первичного теста при массовых обследованиях населения для выявления наркомании, особенно на ранней стадии.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Бекман Наталья Игоревна, Помелова В.Г., Осин Н.С.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

THE MULTIPLEX ANALYSIS OF DRUG MEDICINALS ON THE BASIS OF TECHNOLOGY OF IMMUNOCHIPS PHOSPHAN

The new technique of multiplex qualitative analysis of narcotic, psychotropic remedies is developed on the basis of technology Phosphan using immunochips in the format of standard 96-wells plates, monoclonal antibodies to narcotic compounds and Pt-coproporphyrin as a long luminescent marker. The multiplex analysis was implemented using 20 mkl of human biological fluid (urine, blood serum or saliva) of 2 discs of 3.2 mm in diameter made of dried urine spot on paper. No preliminary processing or dilution of analyzed sample is required. The large range of measured concentrations was demonstrated under high sensitivity of analysis: 1 ng/ml of morphine and methadone, 0.5 ng/ml of barbiturates, 2 ng/ml of benzoylecgonine, methamphetamine, cannabinoids and benzodiazepines, 8 ng/ml amphetamine at variability of results no more than 15%. The approbation of technique was implemented using valid samples of urine (n=197) and blood serum (n=98) demonstrated that the technique permits to detect properly opiates, cocaine, cannabinoids, methadone, benzodiazepine, barbiturates and amphetamines at absence of false positive results in case of analysis of samples containing non-narcotic medications. The results of study of samples of dried urine spot on paper (n=50) well coincided with the results of analysis of fluid samples for all analyzed analytes. On the basis of proposed multiplex analysis a test-system Narc-Phosphan was developed for quantitative studying simultaneously up to 96 samples of various biological fluids, including as dried spots on paper. The analysis demonstrated high sensitivity, specificity and exactness during detection of the most prevailed narcotic substances that permits to propose this technique as a primary test during mass check-ups of population with purpose of detection of drug abuse, especially at the earlier stage.

Текст научной работы на тему «Мультиплексный анализ наркотических средств на основе технологии иммуночипов Фосфан»

ИММУНОЛОГИЯ

mas and transplantation of solid organs. Al'manah klinicheskoy med-itsiny. 2014;30:61-9. (in Russian)

5. Rummler S., Barz D. Extracorporeal photopheresis - a benifical treatment for cardiac and lung transplant rejection. Transplant international. 2011;24:5.

6. Kusztal M., Koscielska-Kasprzak K., Gdowska W., Zabinska M., Myszka M., Klak R. et al. Extracorporeal photopheresis as an an-tirejection prophylaxis in kidney transplant recipients: preliminary results. TransplantProc. 2011;43(8): 2938-40.

7. Barten M.J., Dieterlen M.T. Extracorporeal photopheresis after heart transplantation. Immunotherapy. 2014;6(8):927-44.

8. Haitov R.M., Trofimov D.U., Alexeev L.P. Human immunogenom-ics and genodiagnosis. National leadership. [Immunogenomika i gen-odiagnostika cheloveka. Nacionalnoe rukovodstvo]. Kofiadi I.A., ed. Moscow: GEOTAR-Media; 2017. (in Russian)

9. Lamioni A., Parisi F., Isacchi G., Giorda E., Di Cesare S., Landolfo A. et al. The immunological effects of extracorporeal photophere-sis unraveled: induction of tolerogenic dendritic cells in vitro and regulatory T cells in vivo. Transplantation. 2005;79(7):846-50.

10. Vatazin A.V., Zul'karnaev A.B., Kil'djushevskij A.V. Some of the mechanisms of extracorporeal photochemotherapy in solid organ transplantation. Vestnik transplantologii i iskusstvennykh organov. 2014;1(XVI):76-84. (in Russian)

11. Fedulkina V.A., Vatazin A.V., Kildyushevskij A.V., Olshanskij A.Y., Faenko A.P. The value of extracorporeal photochemotherapy in renal transplant rejection inhibition. Vestnik transplantologii i iskusstven-nyh organov.2016;2(18):46-55. (in Russian)

12. Biagi E., Di Biaso I., Leoni V., Gaipa G., Rossi V., Bugarin C. et al. Extracorporeal photochemotherapy is accompanied by increasing levels of circulating CD4+ CD25+ GITR+ Foxp3+ CD62L+ functional regulatory T-cells in patients with graft-versus-host disease. Transplantation. 2007;84(1):31-9.

13. Fife B.T., Bluestone J.A. Control of peripheral T - cell tolerance and autoimmunity via the CTLA - 4 and PD - 1 pathways. Immunological reviews. 2008;224(1):166-82.

14. Dieterlen MT, Bittner HB, Pierzchalski A, Dhein S, Mohr FW, Barten MJ. Immunological monitoring of extracorporeal photopheresis after heart transplantation. Clinical & Experimental Immunology. 2014;176(1):120-8.

15. Holtick U., Wang X.N., Marshall S.R., Scheid C., von Bergwelt-Baildon M., Dickinson A.M. Immature DC isolated after co-culture with PUVA-treated peripheral blood mononuclear cells downregu-late graft-versus-host reactions in the human skin explant model. Curr. Stem Cell Res. Ther.2013;8(4):324-32.

Поступила 23.10.17 Принята к печати 08.11.17

©КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2018 УДК 616-008.949-078.33

Бекман Н.И.1, Помелова в.Г.1, Осин Н.С.2

МУЛЬТИПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ ТЕХНОЛОГИИ ИММУНОЧИПОВ ФОСФАН

1 ФГУП «Государственный НИИ биологического приборостроения» ФМБА РФ, 125424, Москва, Россия;

2 ЗАО «Иммуноскрин», 125424, Москва, Россия

Разработан новый метод мультиплексного количественного анализа наркотических, психотропных средств на основе технологии Фосфан с использованием иммуночипов в формате стандартных 96-луночных планшетов, моноклональных антител к наркотическим соединениям и Pt-копропорфирина в качестве длительно люминесцирующего метчика. Для мультиплексного анализа используется 20 мкл биологической жидкости человека (мочи, сыворотки крови или слюны) или 2 диска диаметром 3,2 мм из высушенного на бумаге пятна мочи. Не требуется предварительная обработка или разведение исследуемой пробы. Продемонстрирован широкий диапазон измеряемых концентраций при высокой чувствительности анализа: 1 нг/мл морфина и метадона, 0,5 нг/мл барбитуратов, 2 нг/мл бензоилэкгонина, метамфетамина, каннабиноидов и бензодиазепинов, 8 нг/мл амфетамина при вариабельности результатов не более 15%. Апробация метода на аттестованных образцах мочи (n = 197) и сывороток крови (n = 98) показала, что метод позволяет правильно определять опиаты, кокаин, каннабиноиды, метадон, бензодиазепины, барбитураты и амфетамины при отсутствии ложноположительныхрезультатов при исследовании образцов, содержащих ненаркотические лекарственные средства. Результаты исследования высушенных на бумаге проб мочи (n = 50) хорошо совпадали с результатами анализа жидких проб для всех исследуемых аналитов. На основе предложенного мультиплексного анализа разработана тест-система Нарк-Фосфан для количественного исследования одновременно до 96 проб различных биологических жидкостей, в том числе в виде высушенных на бумаге пятен. Продемонстрированные высокая чувствительность, специфичность и точность анализа при определении наиболее распространённых наркотических средств позволяют предложить его в качестве первичного теста при массовых обследованиях населения для выявления наркомании, особенно на ранней стадии.

Ключевые слова: Фосфан; мультиплексный анализ; биочипы; наркотики; морфин; кокаин; каннабиноиды; амфетамины; бензодиазепины; барбитураты. Для цитирования: Бекман Н.И., Помелова В.Г, Осин Н.С. Мультиплексный анализ наркотических средств на основе технологии иммуночипов Фосфан. Клиническая лабораторная диагностика. 2018; 63 (3): 178-183. DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0869-2084-2018-63-3-178-183 BekmanN.I.1, Pomelova V.G.1, OsinN.S.2

THE MULTIPLEX ANALYSIS OF DRUG MEDICINALS ON THE BASIS OF TECHNOLOGY OF IMMUNOCHIPS PHOSPHAN

1The Federal state unitary Institution "The state Research Institute of Biological Instrument-Making Industry" of the Federal Medical biological Agency of Russia, 125424, Moscow, Russia 2the Closed Corporation "Immunoskrin" 125424, Moscow, Russia

Для корреспонденции: Бекман Наталья Игоревна, канд. хим. наук, ст.науч. сотр. лаборатории молекулярных методов диагностики инфекционных и соматических заболеваний ; e-mail: nibeckman@mail.ru

russian clinical laboratory diagnostics. 2018; 63(3)

DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-3-178-183

immunology

The new technique ofmultiplex qualitative analysis ofnarcotic, psychotropic remedies is developed on the basis of technology Phosphan using immunochips in the format of.standard 96-wells plates, monoclonal antibodies to narcotic compounds and Pt-coproporphyrin as a long luminescent marker. The multiplex analysis was implemented using 20 mkl of human biological fluid (urine, blood serum or saliva) of 2 discs of 3.2 mm in diameter made of dried urine spot on paper. No preliminary processing or dilution of analyzed sample is required. The large range ofmeasured concentrations was demonstrated under high sensitivity of analysis: 1 ng/ml of morphine and methadone, 0.5 ng/ml of barbiturates, 2 ng/ml of benzoylecgonine, methamphetamine, cannabinoids and benzodiazepines, 8 ng/ml amphetamine at variability ofresults no mote than 15%. The approbation of technique was implemented using valid samples ofurine (n=197) and blood serum (n=98) demonstrated that the technique permits to detect properly opiates, cocaine, cannabinoids, methadone, benzodiazepine, barbiturates and amphetamines at absence of false positive results in case of analysis of samples containing non-narcotic medications. The results of study of samples of dried urine spot on paper (n=50) well coincided with the results of analysis offluid samples for all analyzed analytes. On the basis of proposed multiplex analysis a test-system Narc-Phosphan was developed for quantitative studying simultaneously up to 96 samples of various biological fluids, including as dried spots on paper. The analysis demonstrated high sensitivity, specificity and exactness during detection of the most prevailed narcotic substances that permits to propose this technique as a primary test during mass check-ups of population with purpose of detection of drug abuse, especially at the earlier stage.

Keywords: Phosphan; multiplex analysis; biochip; narcotics; morphine; cocaine; cannabinoids; amphetamines; benzodiaz-epine; barbiturates.

For citation: Bekman N.I., Pomelova V.G., Osin N.S. The multiplex analysis of drug medicinals on the basis of technology of immunochips Phosphan. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2018; 63(3): 178-183. (inRuss.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-3-178-183

For correspondence: Bekman N.I., candidate of chemical sciences, senior researcher of the laboratory of molecular methods of diagnostic of infectious and somatic diseases, e-mail: nibeckman@mail.ru

Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests.

Acknowledgment. The study had no sponsor support.

Received 01.11.2017 Accepted 18.11.2017

В последние годы распространение заболеваний наркоманией в России и за рубежом приобретает всё более угрожающие масштабы, причём наркомания имеет опасную тенденцию к омоложению. В связи с этим очевидна необходимость усиления мер по своевременному выявлению и предупреждению наркомании, среди которых важное место занимает профилактическое обследование различных групп населения - учащихся, военнослужащих, призывников, иммигрантов, работников опасных производств и др. Для эффективного развития программ наркологического скрининга нужны новые методы анализа наркотических соединений (НС) или их метаболитов. Предложенные к настоящему времени методы газовой и жидкостной хроматографии [1-3], масс-спектрометрии [4], иммунохроматографии [5], имму-ноферментные [6-8], иммунофлуоресцентные [9] и другие, в том числе мультиплексные, методы [10-12] не в полной мере удовлетворяют таким критериям массового скрининга, как возможность одновременного анализа большого числа исследуемых образцов на широкую панель аналитов, низкая стоимость, простота пробоподготовки, высокая точность и чувствительность для детектирования наркозависимости на ранней стадии. Помимо этого, большое значение имеет возможность анализа биологических жидкостей человека в виде высушенных на бумаге пятен как более безопасных и удобных при транспортировке и хранении [13, 14]. Совокупности этих критериев, по нашему мнению, в наибольшей степени отвечает биочип-технология мультиплексного фос-форесцентного иммуноанализа Фосфан (Иммуноскрин, РФ), эффективность которой для скрининга различных патологий была продемонстрирована ранее [15-17].

Цель исследования - разработать на основе технологии Фосфан метод мультиплексного количественного анализа основных наркотических, психотропных средств в биологических жидкостях человека (в том числе в виде высушенных на бумаге пятен) и оценить перспективы его применения для наркологического скрининга.

Материал и методы. Для проведения исследований использовали указанные ниже иммунобиологические препараты.

Мышиные моноклональные антитела (МКА) к морфину (MOR) бензоилэкгонину (BZE), амфетамину (AMP), ме-тамфетамину (mAMP), метадону (MTD), бензодиазепинам

(BZD), барбитуратам (BAR) и А9-тетра-гидроканнабинолу (THC) (Calbioreagents, США), меченные биотином по стандартной методике (SIGMA, США).

Конъюгаты MOR, BZE, AMP, mAMP, MTD, BZD, BAR и THC с бычьим сывороточным альбумином (Calbioreagents, США).

Референтный образец мочи «Detectabuse Liquid Control Urine +25%» (Biochemical diagnostics, США), содержащий 2500 нг/мл MOR, 375 нг/мл BZE, 65,5 нг/мл D9-THC-COOH, 1250 нг/мл d-AMP, 1250 нг/мл d-mAMP, 375 нг/мл MTD, 375 нг/мл пропоксифена, 375 нг/мл оксазепама, 375 нг/мл нор-триптилина, 375 нг/мл секобарбитала, 375 нг/мл метаквалона и 31 нг/мл фенциклидина.

Исследуемые аттестованные образцы (любезно предоставлены Первым МГМУ им. И.М. Сеченова) включали 197 проб мочи человека, отобранных по результатам химико-токсикологической экспертизы, и 98 образцов мочи и сыворотки крови пациентов наркологического диспансера с известными сведениями о составе, дозе и времени приёма НС. Сухие образцы (n = 50) готовили путём нанесения 20 мкл аттестованных образцов мочи на бланк фильтровальной бумаги (Whatman 903, США) и высушивания на воздухе. Жидкие образцы хранили при температуре -200С, сухие пятна мочи - при температуре 40С с осушителем.

Иммуночипы представляли собой 16 микрозон (диаметром 0,5 мм), напечатанных контактным способом на дне лунок 96-луночного полистиролового планшета (Nunc, Дания) [16]. Иммуночипы печатали с использованием конъюгатов НС в различных конфигурациях: моночипы с одним типом аналита, чипы с четырьмя типами аналитов в разных сочетаниях (по 4 идентичные микрозоны для каждого аналита) или чип с восемью аналитами (по 2 микрозоны для каждого), представленный на рис. 1. Печать идентичных микрозон применяли для повышения точности измерения [18].

Схема проведения иммуноанализа (см. рис. 1) состояла в следующем. В лунки планшета с напечатанными иммуночи-пами вносили по 20 мкл исследуемых проб мочи или сыворотки крови либо два диска диаметром 3,2 мм, вырезанных из высушенного на бумаге пятна мочи. Затем добавляли по 100 мкл смеси биотинилированных мышиных МКА к анализируемым НС и инкубировали в течение часа. После отмывки в лунки добавляли по 25 мкл конъюгата стрептавидина

ИММУНОЛОГИЯ

с Pt-копропорфирином (Иммуноскрин, РФ) и инкубировали 15 мин. Разведения МКА и конъюгата готовили в буфере (рН 7,75), содержащем 12,1 мг/мл трис-(гидроксиметил)-аминометана, 0,1 мл/л твина-20, 0,5 мг/мл БСА, 8,7 мг/мл хлорида натрия, 0,5 мг/мл азида натрия (все реагенты фирмы Sigma, США). Все инкубации проводили при перемешивании при комнатной температуре. Затем планшет промывали и высушивали.

Регистрацию фосфоресцентного сигнала осуществляли на биочип-анализаторе ИфИ-04 (ГосНИИБП, РФ) путём сканирования дна лунки планшета лучом с длиной волны излучения 365 нм в режиме выделения длительной люминесценции с максимумом 645 нм. Обработка и представление результатов осуществлялись с помощью программных средств биочип-анализатора.

Чувствительность анализа (предел детекции) каждого НС рассчитывали по калибровочной кривой как концентрацию НС, которая соответствует значению интенсивности регистрируемого сигнала при анализе пробы, не содержащей данное НС, минус два стандартных отклонения.

Результаты. При разработке метода мультиплексного анализа наркотических средств (Нарк-Фосфан) первоочередная задача состояла в оценке специфичности используемых иммунологических реакций. С этой целью были исследованы характеристики восьми МКА к MOR, BZE, THC, MTD, BZD, BAR, AMP и mAMP, предназначенных для выявления соответственно опиатов, кокаина, каннабиноидов, метадона, бензодиазепинов, барбитуратов и амфетаминов. Проведённые исследования показали высокую специфичность иммунореакций выбранных МКА и конъюгатов НС. Перекрестные реакции не превышали 0,01% за исключением амфетаминов, перекрест между которыми достигал 20%. Не было обнаружено значительных отличий результатов мультиплексного анализа НС на иммуночипах разных конфигураций. Для одного анализа было достаточно 0,5 - 1,8 нг меченных биотином антител (при этом максимальный регистрируемый сигнал превышал фоновый более чем в 1000 раз). Для выбора оптимальной методики постановки анализа объём исследуемой пробы варьировали от 10 до 50 мкл с предварительным разведением в 2-10 раз буфером или мечеными антителами непосредственно на иммуночипах в лунке планшета и временем инкубации от 15 мин до 2 ч. Выбранная методика (20 мкл пробы с разведением в 6 раз в лунке с иммуночипами и инкубацией 1 ч) обеспечивала необходимую чувствительность анализа при снижении вариабельности и влияния неспецифических взаимодействий с компонентами биологических жидко-

Рис. 2. Графическое представление результатов сканирования 96-луночного планшета после проведения анализа исследуемых проб мочи на кокаин (BZE) , каннабиноиды (ТНС), амфетамин (АМР) и опиаты (MOR).

Справа приведена схема иммуночипа (квадратом выделена зона сканирования дна лунки планшета).

Рис.1. Схема мультиплексного анализа НАРК-ФОСФАН наркотических соединений (НС).

1 - лунка 96-луночного микропланшета; 2 - дно лунки; 3-10 - микрозоны, специфические к восьми НС; 11 - исследуемый образец; 12 - исследуемые НС из образца; 13 - меченные биотином антитела к НС; 14 - конъюгат стрептавидин-Р^копропорфирин.

стей. Это позволило использовать данную методику для исследования различных биологических жидкостей человека (мочи, сыворотки крови или слюны), а также приготовленных из них высушенных на бумаге образцов.

На рис. 2 приведены результаты мультиплексного анализа проб мочи на кокаин, каннабиноиды, амфетамин и опиаты. Данные сканирования 96-луночного планшета представлены в виде диаграммы пространственного распределения интенсивности регистрируемого сигнала фосфоресценции внутри зоны сканирования дна лунки планшета. При визуальной оценке результатов анализа отсутствие окрашенных пятен свидетельствует о высоком уровне соответствующего НС в исследуемой пробе (например, в пробе, анализируемой в лунке планшета D4, присутствуют BZE и MOR, а в пробе в лунке

С12 - ТНС и АМР).

Калибровочные кривые для количественного измерения НС в анализируемых пробах были построены по результатам мультиплексного исследования (в варианте одновременного определения восьми аналитов) референтного образца, содержащего НС в известных концентрациях (рис. 3). Полученные кривые имели характер обратной зависимости. В таблице суммированы аналитические характеристики метода Нарк-Фосфан, рассчитанные по калибровочным кривым. Согласно полученным данным, метод обеспечивает высокочувствительное количественное определение большинства исследуемых НС в широком диапазоне концентраций. Так,

RUSSIAN CLINICAL LABORATORY DIAGNOSTICS. 2018; 63(3) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-3-178-183

IMMUNOLOGY

Рис. 3. Калибровочные кривые для одновременного определения методом НАРК-ФОСФАН кокаина (BZE) и каннабиноидов (ТНС) (а), опиатов (MOR) и метадона (MTD) (б), бензодиазепинов (BZD) и барбитуратов (BAR) (в), амфетаминов (АМР и mAMP) (г).

По оси абсцисс - концентрация исследуемого наркотического соединения (НС), нг/мл; по оси ординат - степень ингибирования регистрируемого сигнала (В/В0), %.

при выявлении опиатов, возможно измерение MOR до 2000 нг/мл при пределе детекции 1 нг/мл (см.таблицу ). Вариабельность результатов анализа каждого НС не превышала 15%, а воспроизводимость соответствовала интервалу 80-120%.

С помощью разработанного метода Нарк—Фосфан исследовано 197 образцов мочи, аттестованных в рамках химико-токсикологической экспертизы на присутствие НС (в том числе, синтетических), их метаболитов, а также различных лекарственных препаратов. Во всех образцах, которые по предварительным данным содержали НС, были выявлены высокие уровни соответствующих НС: MOR (n = 31), BZE (n = 2), THC (n = 37), AMP (n = 21), mAMP (n = 7), MTD (n = 15), BZD (n = 20) и BAR (n = 32). В образцах, содержащих ненаркотические лекарственные средства, уровни исследуемых аналитов не превышали пороговых значений си off, приведённых в таблице. Из 62 образцов мочи с наличием разных

синтетических НС (в основном AB-Chminaca AB-Pinaca и PB-22) в 37 получены положительные реакции на один из аналитов. Параллельный анализ образцов сыворотки крови и мочи (n = 98) подтвердил соответствие (с учётом характера метаболизма НС в крови и моче) наших результатов сведениям о составе, дозе и времени приёма НС, собранным при поступлении пациентов в стационар.

Сравнение результатов выявления НС в жидких и высушенных на бумаге пробах мочи (n = 50) продемонстрировало хорошее совпадение. Вместе с тем при использовании для анализа только одного вырезаемого из сухого пятна диска диаметром 3,2 мм (содержит примерно 1 мкл пробы) не удалось определить AMP и BZE при концентрации ниже 150 нг/мл. С учётом этого число анализируемых дисков было увеличено до двух, что позволило правильно выявить все НС: BZE (n = 4), THC (n = 18), MOR (n = 22), AMP (n = 8), mAMP (n = 6),

ИММУНОЛОГИЯ

Аналитические характеристики метода Нарк-Фосфан

Наркотические, Аналит Рекомендованный предел Характеристики Нарк-Фосфан,

психотропные детекции тестов*, нг/мл нг/мл

средства предвари- подтверж- предел рабочий rat off**

тельных дающих детекции диапазон

Опиаты MOR 300 10 1,0 0-2000 50

Кокаин BZE 25 50 2,0 0 -500 50

Каннабиноиды THC 15 15 2,0 0 -100 50

Амфетамин AMP 25 20 8,0 0—1500 100

Метамфетамин mAMP 25 20 2,0 0-1000 100

Метадон MTD 25 50 1,0 0 -500 100

Бензодиазепины BZD 20 50 2,0 0—600 200

Барбитураты BAR 50 100 0,5 0 -300 100

Примечание. * - согласно требованиям к техническим средствам химико-токсикологических исследований (см. Методические рекомендации Ассоциации специалистов и организаций лабораторной службы «Федерация лабораторной медицины». Изотов Б.Н., Кочетов А.Г., ред. М.; 2015); **- си off - пороговое значение концентрации НС в пробе, при превышении которого результат анализа признаётся положительным.

MTD (n = 10), BZD (n = 13) и BAR ( n= 15). Большинство образцов содержало несколько исследуемых НС. Изучение стабильности НС в сухих образцах мочи показало, что в процессе их хранения в течение года не был потерян ни один положительный результат анализа.

Обсуждение. Разработанный мультиплексный анализ Нарк-Фосфан предназначен для определения НС в образцах биологических жидкостей человека. Метод основан на технологии Фосфан с использованием иммуночипов в формате стандартного многолуночного планшета [15, 16]. Принцип анализа базируется на конкурентной реакции между НС из исследуемой пробы и конъюгатами НС в микрозонах иммуночипа за связывающие центры специфических МКА, меченных биотином. Для проявления образующихся иммунных комплексов используют конъюгат стрептавидина с длительно люминесцирующим метчиком Pt-копропорфирином и последующую регистрацию в режиме временного разрешения интенсивности фосфоресценции различных микрозон иммуночипа (см.рис. 1).

Использование длительно люминесцирующего метчика обеспечило широкий динамический диапазон измерения концентрации НС (см.таблицу ). При этом достигнуты высокие значения чувствительности анализа большинства исследуемых НС, многократно превышающие значения, рекомендованные как для предварительных, так и подтверждающих химико-токсикологических исследований (см.таблицу). Продемонстрирована высокая специфичность используемых иммунореакций и возможность правильного одновременного определения всех исследуемых аналитов с хорошей воспроизводимостью получаемых результатов. С учётом этого применение метода Нарк-Фосфан может позволить точно детектировать не только высокие уровни НС непосредственно после приёма препарата, но и остаточные уровни НС, в том числе при однократном употреблении, что очень важно для выявления наркомании на ранней стадии.

Апробация разработанного метода показала возможность определения основных НС в различных клинических образцах. Были правильно выявлены все образцы, содержащие исследуемые НС в концентрации выше выбранных значений пороговых уровней си off (см.таблицу). Отсутствовали лож-ноположительные результаты анализа образцов с различными ненаркотическими соединениями, хотя в некоторых их них были зафиксированы невысокие (ниже си off) уровни исследуемых аналитов. Для уточнения интерпретации этих результатов необходимы дополнительные исследования на расширенной выборке таких образцов, охарактеризованных с помощью высокочувствительных референтных методов.

В последние годы помимо основных НС получают распространение новые синтетические НС. Тот факт, что при анализе

большинства образцов, содержащих такие НС, были зафиксированы положительные результаты Нарк-Фосфан, по крайней мере, на один из аналитов, открывает перспективу использования этого метода в качестве предварительного теста с последующим определением конкретного состава употребляемого синтетического препарата с помощью подтверждающих тестов.

Благодаря высокой чувствительности метод позволяет исследовать образцы биологических жидкостей в виде высушенных на бумаге пятен. Проведённые исследования продемонстрировали хорошее совпадение результатов анализа на все исследуемые НС как в жидких, так и сухих образцах мочи, в том числе с низким содержанием НС. Разработанный метод не требует предварительной пробоподготовки обоих видов проб и выполняется по единой методике.

Внедрение в практику высушенных образцов может значительно упростить скрининговые обследования и существенно снизить затраты на их проведение.

Метод Нарк-Фосфан защищен патентом РФ [19]. На его основе создана тест-система, включающая отрицательный и три положительных мультианалитных контролей с низким, средним и высоким уровнем исследуемых НС, смесь биотинилиро-ванных антител к НС, универсальный проявляющий реагент и 96-луночный планшет с нанесёнными на дно лунок иммуночи-пами. Использование стандартных полистироловых планшетов существенно снижает стоимость тест-системы и упрощает постановку мультиплексного анализа благодаря возможности использования обычного лабораторного оборудования.

Тест-система Нарк-Фосфан может быть предназначена для выявления разных панелей НС в биологических жидкостях (моче, сыворотке крови или слюне). Оптимальным представляется вариант с панелью из восьми наиболее распространённых НС, перечисленных в таблице. Также найдут применение специализированные тест-системы, предназначенные для выявления психотропных лекарственных средств, амфетаминов или курительных смесей. В настоящее время изучается возможность дополнения панели исследуемых НС некоторыми синтетическими наркотиками, а также метилендиоксиметам-фетамином (МДМА), фентанилом и котинином.

Заключение. На базе технологии иммуночипов Фосфан разработан новый высокочувствительный метод мультиплексного анализа основных наркотических средств. С его помощью можно исследовать одновременно до 96 проб различных биологических жидкостей, в том числе в виде высушенных на бумаге пятен, без предварительной пробо-подготовки. Достигнутые характеристики Нарк-Фосфан позволяют предложить его в качестве первичного теста для наркологического скрининга населения.

Благодарность. Авторы выражают благодарность А.Е. Носыреву и другим сотрудникам кафедры аналитической и судебно-медицинской токсикологии под руководством Б.Н. Изотова Первого МГМУ им. И.М. Сеченова за консультации при подготовке исследований и предоставление аттестованных образцов.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА (пп. 1-4, 6-12, 14 см. REFERENCES)

5. Шанин И.А., Хан О.Ю., Петухов А.Е., Смирнов А.В., Еремин С.А. Детектирование амфетаминов в моче с помощью иммунохроматографиче-ских тест-полосок. Судебно-медицинская экспертиза. 2012; 55(4): 33-7.

Russian clinical laboratory diagnostics. 2018; 63(3)

DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-3-183-186

13. Помелова В.Г., Осин Н.С. Перспективы интеграции технологии сухого пятна крови в популяционные исследования здоровья и среды обитания человека. Вестник РАМН. 2007; 12:10-6.

15. Осин Н.С., Помелова В.Г., Быченкова Т.А., Соколов А.С. Способ многоаналитного иммуноанализа. Патент РФ № 2184970; 2002.

16. Осин Н.С., Помелова В.Г., Соколов А.С., Быченкова Т.А., Бекман Н.И. Шарафудинова Т.Ю. и др. Фосфоресцентный микроанализ как новая технологическая платформа для молекулярной диагностики. Вестник РАМН. 2007; 12: 3-10.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

17. Бекман Н.И., Ларичева С.Ю., Быченкова Т.А., Помелова В.Г., Осин Н.С. Применение технологии иммуночипов ФОСФАН для исследования маркеров щитовидной железы. Клиническая лабораторная диагностика. 2015; 5: 23-6.

18. Бекман Н.И., Быченкова Т.А., Ларичева С.Ю., Помелова В.Г. и др. Способ одновременного детектирования тиротропина и общего тироксина в сухих пятнах крови. Патент РФ № 2480772; 2013.

19. Осин Н.С., Бекман Н.И., Помелова В.Г., Гранцева Н.Х. Способ мно-гоаналитного иммуноанализа. Патент РФ № 2593787; 2016.

REFERENCES

1. Raikas N., Christopoulou K., Theodoridis G., Tsoukali H., Psaroulis D. Determination of amphetamines in human urine by headspace solidphase microextraction and gas chromatography. J. Chromatogr. B. 2003; 789: 59-63.

2. Sun Q.R., Xiang P., Yan H., Shen M. Simultaneous analyses of cocaine and its metabolite benzoylecgonine in urine by LC-HPLC. J. Forensic Sci. 2008; 24: 268-72.

3. Nakashima R. Development of ultra sensitive HPLC determination for drugs of abuce. Chromatography. 2009; 30: 57-60.

4. Wohlfarth A., Scheidweiler K.B., Chen X., Liu H., Huestis M.A. Qualitative confirmation of 9 synthetic cannabinoids and 20 metabolites in human urine using LC-MS/MS and library search. Anal. Chem. 2013; 85: 3730-8.

5. Shanin I.A., Khan Olu, Petukhov A.E., Smirnov A.V., Eremin S.A. The detection of amphetamines in urine samples using immunochromato-graphic test strips. Sudebno-meditsinskaya ekspertiza. 2012; 55(4): 33-7. (in Russian)

6. Crooks C.R., Brown S. Roche DAT immunoassay: sensitivity and specificity testing for amphetamines, cocaine, and opiates in oral fluid. J. of Analytical Toxicology. 2010; 34: 103-9.

7. Snyder M.L., Jarolim P., Melanson S.E. A new automated urine 8. fentanyl immunoassay: technical performance and clinical utility for monitoring

immunology

fentanyl compliance. Clin Chim Acta. 2011; 412(11-12): 946-51.

8. Carney S., Wolf C.E., Tarnai-Moak L., Poklis A. Evaluation of two enzyme immunoassays for the detection of the cocaine metabolite benzoylecgonine in 1,398 urine specimens. J. Clin. Lab. Anal. 2012; 26(3): 130-5.

9. Gandhi S., Sharma P., Capalash N., Verma R.S., Suri R.C. Group-selective antibodies based fluorescence immunoassay for monitoring opiate drugs. Analytical andBioanalytical Chemistry. 2008; 392 (1-2): 215—22.

10. Bruls D.M., Evers T.H., Kahlman J.A., van Lankvelt P.J., Ovsyanko M., Pelssers E.G. Rapid integrated biosensor for multiplexed immunoassays based on actuated magnetic nanoparticles. Lab. Chip. 2009; 9(24): 3504-10.

11. Smith J., Sammons D., Robertson S., Biagini R., Snawder J. Measurement of multiple drugs in urine, water, and on surfaces using fluorescence covalent microbead immunosorbent assay. Toxicol. Mech. Methods. 2010;20(9): 587-93.

12. Ellefsen K.N., Anizan S., Castaneto M.S., Desrosiers N.A., Martin T.M., Klette K.L. Validation of the only commercially available immunoassay for synthetic cathinones in urine: Randox Drugs of Abuse V Biochip Array Technology. Drug Test Anal. 2014; 6(0): 728-38.

13. Pomelova V.G., Osin N.S. Prospects of the integration of dry blood spot technology with human health and environmental population studies. Vestnik RAMN; 2007; 12:10-6. (in Russian)

14. Stove C.P., Ingels A.S., De Kesel P.M., Lambert W.E. Dried blood spots in toxicology: from the cradle to the grave? Crit Rev Toxicol. 2012; 42(3):230-43.

15. Osin N.S., Pomelova V.G., Bychenkova T.A., Sokolov A.S. Method of mul-tianalyte immunoassay. PatentRF, N 2184970; 2002. (in Russian)

16. Osin N.S., Pomelova V.G., Sokolov A.S., Bychenkova T.A., Bekman N.I., Sharafudinova T.Yu. et.al. Phosphorescent microanalysis as a new technical platform for molecular diagnostics. Vestnik RAMN. 2007; 12: 3-10. (in Russian)

17. Bekman N.I., Laricheva S.Iu., Bychenkova T.A, Pomelova V.G., Osin N.S. The application of technology of immune chips for investigation of markers of thyroid gland. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika. 2015; 5:23-6. (in Russian)

18. Bekman N.I., Bychenkova Т.А., Laricheva S.Yu., Pomelova V.G. et al. The method of simultaneous detection of TSH and total thyroxin in dried blood spots. Patent RF, N 2480772; 2013. (in Russian)

19. Osin N.S, Bekman N.I., Pomelova V.G., Grantseva N.H. Method of multi-analyte immunoassay. Patent RF, N 2593787; 2016. (in Russian)

Поступила 01.11.17 Принята к печати 18.11.17

© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2018 УДК 578.891:578.1].083.3

Личная Е.в.1, Климашевская С.в.2, Обрядина А.П.2, Бербов в.Н.1, Белопольская М.А.3,4, Эсауленко Е.в.1, Калинина О.в.1,5

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТЕЛ К БЕЛКУ F ВИРУСА ГЕПАТИТА С МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА

1ФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера», 197101, Санкт-Петербург, Россия;

2ООО «НПО «Диагностические системы», 603093, Нижний Новгород, Россия;

3СПбГБУЗ «Клиническая инфекционная больница им. С.П. Боткина», 195067, Санкт-Петербург, Россия; 4ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», 197376, Санкт-Петербург, Россия;

5ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр им. в.А. Алмазова», 197341, Санкт-Петербург, Россия

В области core гена вируса гепатита С (ВГС) располагается альтернативная рамка считывания, кодирующая один белок, известный как белок F, или core+1/ARFP. Наличие антител к белку FВГС в сыворотке крови больных хроническим гепатитом С свидетельствует об экспрессии белка in vivo. В данной работе отработана методика иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием синтетического пептида F10, соответствующего антигенной детерминанте белка F ВГС субтипа 1b, для определения антител к белку F в образцах сыворотки крови. Иммуногенность и иммунохимическая специфичность синтетического пептида F10 доказана на лабораторных животных (мышах).

Ключевые слова: вирус гепатита С; хронический гепатит С; белок F; иммуноферментный анализ.

Для цитирования: Личная Е.В., Климашевская С.В., Обрядина А.П., Вербов В.Н. Белопольская М.А., Эсауленко Е.В., Калинина О.В. Определение антител к белку F вируса гепатита С методом иммуноферментного анализа с использованием синтетического пептида. Клиническая лабораторная диагностика. 2018; 63(3): DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-3-183-186

Для корреспонденции: Личная Евгения Викторовна, мл. науч. сотр. лаборатории вирусных гепатитов; e-mail: evlichnaya@gmail.com

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.