CC BY
3УДК 577.29
МУЛЬТИОМИКСНЫЙ ПОДХОД К ИЗУЧЕНИЮ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ ФЕРРОПТОЗА
DOI
Ледяева В. С.1*, Сулягин В. К.1, Корженевский Д. А.2' Кудряшова О. М. 2, Шохина А. Г. 1,23
1 Лаборатория экспериментальной онкологии НИИ трансляционной медицины РНИМУ им. Н. И. Пирогова, 117997, Москва, Россия
2 Федеральный центр мозга и нейротехнологий ФМБА России, 117997, Москва, Россия
3 Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, Россия
e-mail: *veronika. s.ledyaeva@gmail.com
Аннотация: Ферроптоз был выделен как отдельный вид программируемой клеточной гибели на основании следующих характерных черт: зависимость от внутриклеточного железа и накопление продуктов перекисного окисления липидов [1]. Нарушение целостности клеточной мембраны, изменение редокс-статуса клетки, взаимодействие ферментных систем с образующимися свободными радикалами являются основными причинами гибели клеток. Установлено, что в гиппокампе пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, регистрируется повышенный уровень содержания железа и накопление активных форм кислорода [2, 3]. Есть основания полагать, что внутри ферроптоза, как фундаментального механизма клеточной гибели, можно выделить субмодальности: так, при индукции ферроптоза путем ингибирования синтеза глутатиона особенности и динамика постепенной гибели клеток отличны от той, что наблюдается при индукции ферропто-за путем ингибирования компонентов системы синтеза жирных кислот [4]. На данный момент существует ряд работ, указывающих, что мембранные белки отдельных клеточных компартментов, например, митохондрий, ЭПР или эндосом могут привносить специфический вклад в развитие ферроптоза. Анализ изменения профиля белковой экспрессии мембранных белков определенных клеточных компартментов в условиях индукции ферроптоза возможен при использовании методики proximity labelling, в основе которой лежит реакция биотинилирования близлежащих белков рекомбинант-ной аскорбатпероксидазой — APEX2 [5].
Ключевые слова: ферроптоз, GPX4, APEX2, протеомический анализ.
Целью данной работы является анализ изменений транс-криптомного и протеомного профилей клеток при индукции ферроптоза генетически и различными химическими агентами. В качестве модельной использовали клеточную линию Pfal — 4-ОН-ТАМ-индуцибельные Gpx4/- иммортализованные мышиные фибробласты. Ферроптоз индуцировали внесением тамок-сифена, приводящего к нокауту гена глутатионпероксидазы-4. Помимо тамоксифена для индукции ферроптоза использовали ML210, как селективный ингибитор GPX4, BSO — ингибитор биосинтез глутатиона и эрастин — ингибитор транспортерной системы xc-, опосредующей регуляцию количества внутриклеточного цистеина. Анализ тотального протеома клеточной линии Pfa-1 проводили методом тандемной масс-спектрометрии. Для анализа выбрали три временные точки — 0, 24 и 48 часов после индукции ферроптоза. Для мониторинга изменений с помощью метода Proximity Labeling в белковой фракции мембран ЭПР и митохондрий при индукции ферроптоза создали и охарактеризовали модельные клеточные линии Pfa1-APEX2-ERM и Pfa-1-APEX2-MICU1, соответственно.
Клеточные линии, несущие APEX2, локализованный на внешней мембране ЭПР (Pfa1-APEX2-ERM) и в межмембранном пространстве митохондрий (Pfa1-APEX2-MICU1) получили с помощью лентивирусной трансдукции. В ходе моноклональной селекции отобрали по 6 клонов каждой клеточной линии. Оптимальный уровень экспрессии определили методом qRT-PCR, на основании полученных данных для дальнейшей работы выбрали по 1 клону каждой линии. Локализацию рекомбинантного белка в пределах митохондрий и ЭПР подтвердили методом иммуноцитохимии. Качественный анализ наличия белкового продукта APEX2 провели методом Western Blotting. Для подтверждения функциональной активности APEX2 в полученных клеточных линиях в культуральную среду PRMI1640 добавляли 1 мМ биотинфенола и 0,5 мМ H2O2 для индукции свободорадикальной реакции и функционального цикла биотинилирования близлежащих белков [5]. Результаты валиди-ровали методом иммуноцитохимии с использованием конъюгатов нейтравидин-FITC, высокоаффинно связывающихся с биотиновой меткой, и методом Western Blotting c использованием конъюгата стрептавидин-HRP. Эффективность обогащения биотинилирован-ных фракций мембранных белков выбранных клеточных компарт-ментов проверили методом Western Blotting.
Анализ транскриптома и протеома клеточной линии Pfa1 в условиях индукции ферроптоза путем воздействия на разные компоненты цистеин/глутатион/Орх4 оси позволил выделить отдельные паттерны генов-ответчиков. Среди последних мы обнаружили как общие, так и специфические для определенных способов индукции ферроптоза. Полученные данные позволяют предположить, что воздействие на различные компоненты цистеин/глутатион/Орх4 оси активирует специфические внутриклеточные каскады, которые могут не совпадать для разных способов индукции, но в конечном счете приводят к одному результату — гибели клетки в ферроптозной модальности. Дальнейший анализ обогащенной фракции мембранных белков ЭПР и межмембранного пространства митохондрий позволит уточнить вклад данных внутриклеточных компартментов в процесс инициации ферроптоза.
Список литературы
1. Stockwell BR, Friedmann Angeli JP, Bay ir H, Bush AI, Conrad M, Dixon SJ, Fulda S, Gascón S, Hatzios SK, Kagan VE, Noel K, Jiang X, Linkermann A, Murphy ME, Overholtzer M, Oyagi A, Pagnussat GC, Park J, Ran Q, Rosenfeld CS, Salnikow K, Tang D, Torti FM, Torti SV, Toyokuni S, Woerpel KA, Zhang DD. Ferroptosis: A Regulated Cell Death Nexus Linking Metabolism, Redox Biology, and Disease. Cell. 2017 Oct 5;171 (2):273—285.
2. Raven, E. P., Lu, P. H., Tishler, T. A., Heydari, P. & Bartzokis, G. Increased iron levels and decreased tissue integrity in hippocampus of Alzheimer's disease detected in vivo with magnetic resonance imaging. J. Alzheimers Dis. 37, 127—136 (2013).
3. Lane, D. J. R., Ayton, S. & Bush, A. I. Iron and Alzheimer's disease: an update on emerging mechanisms. J. Alzheimers Dis. 64, S379-S395 (2018).
4. Jiang, X., Stockwell, B. R. & Conrad, M. Ferroptosis: mechanisms, biology and role in disease. Nat Rev Mol Cell Biol 22, 266—282 (2021).
5. Hung, V., Udeshi, N., Lam, S. et al. Spatially resolved proteomic mapping in living cells with the engineered peroxidase APEX2. Nat Pro-toc 11, 456—475 (2016).
MULTI-OMICS APPROACH TO THE STUDY OF MOLECULAR FEATURES OF FERROPTOSIS
Ledyaeva V. S.1*, Sulyagin V. K.1, Korzhenevsky D. A.2, Kudryashova O. M. 2, Shokhina A. G.123
1 Laboratory of Experimental Oncology of the Pirogov National Research Institute of Translational Medicine, 117997, Moscow, Russia,
2 Federal Center of Brain and Neurotechnologies of the FMBA of Russia, 117997, Moscow, Russia,
3 Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry 117997, Moscow, Russia e-mail: *veronika. s.ledyaeva@gmail.com
Annotation. Ferroptosis was defined as a form of programmed cell death based on the following features: dependence on intracellular iron and accumulation of lipid peroxidation products. There is reason to believe that within ferroptosis, as a fundamental mechanism of cell death, submodalities can be distinguished. At the moment, there are a number of studies indicating that membrane proteins of individual cell compartments are differ in contribution to ferroptosis. Analysis of membrane protein expression profile of certain cellular compartments under conditions of ferroptosis induction is possible using the proximity labeling technique, which is based on the biotinylation reaction of nearby proteins with recombinant ascorbate peroxidase APEX2.
The study focused on multi-omics analysis of ferroptosis induced in model cell line Pfa-1 and validation of APEX2 functional activity and localization within cells. Key words: ferroptosis, GPX4, APEX2, proteomic analysis.
