CC BY
24
DOI: 10.21055/0370-1069-2021-1-95-102
УДК 616.98:578.824.11
Ю.о. Гончарова, и.В. Бахтеева, р.и. миронова, А.Г. Богун, к.В. хлопова, В.с. Тимофеев
мультилокусное сиквенс-типирование штаммов сибиреязвенного микроба, выделенных на территории россии и сопредельных государств
ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», п. Оболенск, Российская Федерация
цель - генотипирование методом мультилокусного сиквенс-типирования (MLST) и проведение филогенетического анализа выборки из 40 штаммов Bacillus anthracis, выделенных на территории России и сопредельных государств. материалы и методы. В работе осуществлена сборка последовательностей семи генов домашнего хозяйства штаммов B. anthracis на основе данных полногеномного секвенирования нового поколения, после чего описаны выявленные мутации и их координаты. Полученные последовательности использованы для генотипи-рования исследуемой выборки методом MLST. Результаты сравнены с данными, представленными в базе данных PubMLST. Филогенетический анализ проведен для слитых in silico последовательностей семи локусов выявленных сиквенс-типов. Для построения дендрограмм использован программный пакет MEGA 7.0. результаты и обсуждение. В исследованной выборке обнаружено два сиквенс-типа (ST): 35 штаммов относились к ST-1, а пять штаммов, отличающихся одной общей мутацией в локусе glpF, - к ST-3 (согласно кодировке PubMLST), что подчеркивает генетическую обособленность данной группы штаммов. У одного штамма обнаружена уникальная мутация в гене gmk, находящаяся за пределами участка локуса, используемого для MLST.
Ключевые слова: Bacillus anthracis, Bacillus cereus, MLST, генотипирование.
Корреспондирующий автор: Гончарова Юлия Олеговна, e-mail: info@obolensk.org.
Для цитирования: Гончарова Ю.О., Бахтеева И.В., Миронова Р.И., Богун А.Г., Хлопова К.В., Тимофеев В.С. Мультилокусное сиквенс-типирование штаммов сибиреязвенного микроба, выделенных на территории России и сопредельных государств. Проблемы особо опасных инфекций. 2021; 1:95-102. DOI: 10.21055/0370-1069-2021-1-95-102
Поступила 29.12.2020. Отправлена на доработку 22.01.2021. Принята к публ. 04.02.2021.
Yu.O. Goncharova, I.V. Bakhteeva, R.I. Mironova, A.G. Bogun, K.V. Khlopova, V.S. Timofeev
Multilocus sequence-Typing of Anthrax Microbe strains Isolated in Russia and Neighboring Countries
State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Russian Federation
Abstract. Objective - genotyping by multilocus sequence-typing (MLST) and phylogenetic analysis of 40 Bacillus anthracis strains isolated in Russia and neighboring countries. Materials and methods. In this study, the sequences of seven housekeeping genes of B. anthracis strains were assembled based on the data of a whole genome new generation sequencing, after which the identified mutations and their coordinates were described. The obtained sequences were used for genotyping of the investigated sample using the MLST method. The results are compared with the data presented in PubMLST database. A phylogenetic analysis was performed for the in silico fused sequences of the seven loci of the identified sequence types. The MEGA 7.0 software package was used to build the dendrograms. Results and discussion. Two sequence types (ST) have been found in the examined sample: 35 strains belong to ST-1, and five strains that differed by one common mutation at the glpF locus - to ST-3 (according to PubMLST coding), which emphasizes the genetic separation of this group of strains. One strain has a unique mutation in the gmk gene located outside the region used for MLST.
Key words: Bacillus anthracis, Bacillus cereus, MLST, genotyping.
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.
Corresponding author: Yulia O. Goncharova, e-mail: info@obolensk.org.
Citation: Goncharova Yu.O., Bakhteeva I.V., Mironova R.I., Bogun A.G., Khlopova K.V., Timofeev V.S. Multilocus Sequence-Typing of Anthrax Microbe Strains Isolated in Russia and Neighboring Countries. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2021; 1:95-102. (In Russian). DOI: 10.21055/0370-1069-2021-1-95-102
Received 29.12.2020. Revised 22.01.2021. Accepted 04.02.2021.
Goncharova Yu.O., ORCID: https://orcid.org/0000-0003-1682-8788 Bakhteeva I.V, ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6897-3613 Mironova R.I., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5710-4746
Группа Bacillus cereus, также известная как B. cereus sensu lato или B. cereus complex, состоит из девяти близкородственных видов: собственно B. cereus (B. cereus sensu stricto), B. anthracis, B. cytotoxi-cus, B. mycoides, B. pseudomycoides, B. thuringiensis, B. toyonensis, B. weihenstephanensis и B. wiedman-nii [1]. Большая часть ее представителей патогенна
Водип А^., ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5454-2459 Khlopova К.У, ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7611-3608 Timofeev ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9501-1380
для тех или иных групп животных, при этом спектр хозяев и тяжесть вызываемых инфекций значительно различаются. Наиболее эпидемически значимым является B. anthracis, так как вызывает сибирскую язву - высоколетальное инфекционное заболевание, поражающее преимущественно полорогих, то есть наиболее значимую для сельского хозяйства группу
животных, а также другие виды млекопитающих, в том числе и человека [2, 3]. В связи с высокой эпидемиологической значимостью сибирской язвы, при обнаружении в исследуемом образце микроорганизмов рода Bacillus важно правильно и быстро определить их видовую принадлежность, а также выяснить происхождение штамма.
В то же время виды B. cereus complex крайне близки на генетическом уровне, в связи с чем классификация членов этой группы давно является предметом дискуссий [4]. Генетическая близость не только мешает решению теоретических вопросов систематики и эволюции B. cereus complex, но и усложняет индикацию патогенов как на видовом уровне, так и на уровне отдельных штаммов. Тем не менее, как минимум для индикации B. anthracis, разработаны многочисленные сравнительно простые в применении иммунологические и ПЦР-тесты, позволяющие получать результат «да/нет» [5].
Важно отметить, что при современном уровне развития науки в процессе эпидрасследования представляет интерес не только видовая идентификация патогена, но и дифференцирование его индивидуальных штаммов. Решение этой задачи стало возможным благодаря разработке методов генотипиро-вания, позволяющих составить по уникальным маркерам «генетический портрет» отдельных штаммов или групп штаммов, объединенных общей эволюционной историей, для чего используются методы ге-нотипирования различной степени разрешения.
Один из таких подходов - мультилокусное сиквенс-типирование (MLST - Multilocus sequence typing) - основан на определении нуклеотидных последовательностей участков нескольких генов «домашнего хозяйства» (то есть генов, кодирующих белки, необходимые для выполнения базовых метаболических функций клетки), локализованных на бактериальной хромосоме (чтобы избежать влияния плазмидного профиля на результаты генотипирова-ния). Впервые метод был предложен для Neisseria meningitidis в 1998 г. [6]. Позднее схемы MLST были разработаны для многих других бактериальных патогенов [7-10]. Для генотипирования группы B. ce-reus также было разработано несколько схем MLST, использующих от пяти до семи локусов [4, 11-13]. результаты генотипирования этим методом доступны в открытой базе данных - PubMLST [14], что позволяет сравнивать вновь полученные данные с результатами работ других авторов.
Наиболее широко используется схема MLST, предложенная F.G. Priest et al. [1, 11, 15, 16]. Она основана на определении последовательностей ло-кусов, являющихся участками семи генов домашнего хозяйства: glpF (белок-посредник поглощения глицерина), gmk (гуанилаткиназа), ilvD (дегидратаза дигидроксикислот), pta (фосфат-ацетилтрансфераза), pur (фосфорибозиламиноимидазолкарбоксамид фор-милтрансфераза), русА (пируваткарбоксилаза) и tpi (триозофосфатизомераза) [11]. Именно эта схема
применена для MLST исследуемой выборки.
цель работы заключалась в генотипировании методом MLST и проведении филогенетического анализа выборки из 40 штаммов B. anthracis, выделенных на территории России и сопредельных государств.
Материалы и методы
Штаммы. В работе использованы 40 штаммов B. anthracis, имеющих различное географическое происхождение (таблица). В исследуемой выборке 39 штаммов природного происхождения являются вирулентными для мышей, штамм STI-1 - авиру-лентный, лабораторный.
Полногeномноe сeквeнированиe. Культуры штаммов B. anthracis выращивали на твердой питательной среде Luria Agar (LA, Sigma-Aldrich) в течение 8-12 часов при 37 °C. Геномная ДНК выделена с помощью набора Genomic DNA Purification Kit (ThermoFisher Scientific, США). Библиотеки подготовлены с помощью набора Nextera DNA Library Preparation Kit (Albiogen, Россия). Полногеномное секвенирование осуществляли с использованием приборов Illumina MiSeq и Ion Torrent PGM и соответствующих наборов реагентов: Ion PGM Reagents 400 Kit, Ion 318 Chip Kit (Life Technologies, Россия) и Miseq Reagent Kit v3 (Albiogen, Россия).
In silico анализ и MLST. Нами использована схема MLST, описанная в работе F.G. Priest et al. [11]. Получены сборки и исследованы последовательности следующих локусов: glpF, gmk, ilvD, pta, pur, pycA, tpi. Для сборки последовательностей использован программный пакет DNASTAR Lasergene (США) (https://www.dnastar.com/). В качестве референсно-го генома использовали геном штамма B. anthracis Ames Ancestor (GenBank: GCA_000008445.1), в соответствии с которым описывали выявленные мутации и их координаты. Полученным последовательностям локусов присваивали номера в соответствии с сервисом базы данных PubMLST [14]. На основе комбинации номеров аллелей используемых локу-сов определяли сиквенс-тип (далее - ST) штаммов в соответствии с работой [11] и сервисом указанной выше базы данных.
Филогeнeтичeский анализ. Для филогенетического анализа использовали слитые in silico последовательности семи локусов выявленных сиквенс-типов исследуемой выборки, а также тринадцати других известных сиквенс-типов B. anthracis и других видов B. cereus complex, используемых в работе [11] и загруженных с PubMLST [14]. Множественное выравнивание осуществляли в программе ClustalW. Для построения дендрограмм использовали программный пакет MEGA 7.0 (http://www.megasoftware.net). Дендрограммы построены с использованием метода невзвешенного попарного среднего (UPGMA). Достоверность топологии филогенетических древ оценивали методом bootstrap на основании анализа 1000 псевдореплик.
Штаммы B. anthracis, использованные в работе B. anthracis strains used in the study
№ Штамм Strain Место выделения Site of isolation Дата выделения Date of isolation Источник Source
1 44 н/д N/D н/д N/D н/д N/D
2 1173 Ставропольский край Stavropol Territory 19.07.1995 Труп коровы Corpse of a cow
3 1183 Кабардино-Балкарская Республика Kabardino-Balkar Republic 21.07.1998 Почва Soil
4 1199 Дагестан Dagestan 30.10.1998 Материал от больного человека Material from a sick person
5 1259 Ставропольский край Stavropol Territory 27.09.2004 Мясо барана Mutton
6 1273 Волгоградская область Volgograd Region 19.09.2008 Материал от больного человека Material from a sick person
7 1298 Волгоград Volgograd 09.08.2010 Материал от больного человека Material from a sick person
8 53169 н/д N/D н/д N/D н/д N/D
9 1(14) Stavropol Украина Ukraine 13.11.1957 Шкура козы, завезенная из Эфиопии Goat skin imported from Ethiopia
10 1030/213 Карачаево-Черкессия Karachay-Cherkess Republic н/д N/D н/д N/D
11 1055/38 Самарская область Samara Region 15.04.1993 Очаг сибирской язвы Anthrax outbreak
12 1056/51 Ставропольский край Stavropol Territory 21.07.1993 Труп человека Body of a human
13 11(1940) Туркменистан Turkmenistan 24.05.1971 Труп яка Corpse of a yak
14 15(1345) Таджикистан Tajikistan 24.05.1971 Труп коровы Corpse of a cow
15 157(B-1107) Эстония Estonia 01.11.1978 Труп коровы Corpse of a cow
16 219/6 Узбекистан Uzbekistan 29.08.1976 Труп коровы Corpse of a cow
17 331/214 Азербайджан Azerbaijan 14.09.1979 Почва Soil
18 34(738) Казахстан Kazakhstan 05.1972 Труп коровы Corpse of a cow
19 367/17 Тульская область Tula Region 14.07.1979 Труп человека Body of a human
20 46/27 Чечено-Ингушетия Chechen-Ingush Republic 01.07.1968 Соскоб со стены Swab from the wall
21 47/28 Чечено-Ингушетия Chechen-Ingush Republic 29.07.1968 н/д N/D
22 48/29 Чечено-Ингушетия Chechen-Ingush Republic 13.08.1968 н/д N/D
23 52/33 Чечено-Ингушетия Chechen-Ingush Republic 23.08.1968 н/д N/D
24 531/17 Калмыкия Kalmyk Republic 28.08.1981 Труп человека Body of a human
25 546/714 Воронежская область Voronezh Region 19.06.1982 Материал от больного человека Material from a sick person
26 555/288 Оренбургская область Orenburg Region 28.07.1982 Материал от больного человека Material from a sick person
27 592/10 Молдавия Moldavia 20.10.1982 Сточные воды кожевенного завода до очистки Tannery waste water before treatment
28 644/268 Украина Ukraine н/д N/D Почва Soil
29 68/12 Азербайджан Azerbaijan 12.08.1967 Содержимое карбункула больного человека Contents of a sick person's carbuncle
30 7(992) Новгородская область Novgorod Region 01.06.1967 Труп коровы Corpse of a cow
31 8(2099) Татарстан Tatarstan 01.10.1971 Труп коровы Corpse of a cow
32 822/7 Чечено-Ингушетия Chechen-Ingush Republic 27.08.1986 Содержимое карбункула больного человека Contents of a sick person's carbuncle
33 914/213 Чечено-Ингушетия Chechen-Ingush Republic 05.07.1988 Мясо Meat
Окончание таблицы / Ending of the table
№ Штамм Strain Место выделения Site of isolation Дата выделения Date of isolation Источник Source
34 I-271 Полуостров Ямал Yamal Peninsula н/д N/D Труп оленя Corpse of a deer
35 I-364 Бурятия Buryatia 10.07.2008 Труп овцы Corpse of a sheep
36 3YA Якутия Yakutia 2016 Глубокие слои почвы Deep soil layers
37 4YA Якутия Yakutia 2017 Глубокие слои почвы Deep soil layers
38 5YA Якутия Yakutia 2018 Глубокие слои почвы Deep soil layers
39 STI-1 Лабораторный штамм Laboratory strain 1940 н/д N/D
40 Yamal 2 Полуостров Ямал Yamal Peninsula 20.10.2017 Шейный лимфатический узел мертвого оленя Cervical lymph node of dead deer
Примечание: Н/Д - нет данных.
Note : N/D - no data.
результаты и обсуждение
После сборки последовательностей локусов, используемых для MLST по [11] с помощью программного пакета DNASTAR Lasergene, выявленным аллелям локусов каждого штамма присвоены номера в соответствии с сервисом PubMLST [14], а на основе комбинации аллелей штамм относили к тому или иному сиквенс-типу в соответствии с тем же сервисом.
В исследованной выборке обнаружены два ранее описанных сиквенс-типа: ST-1 и ST-3. Большинство исследованных штаммов B. anthracis относятся к ST-1 (аллельный профиль: glpF- 1; gmk - 1; ilvD - 1; pta - 1; pur - 1; pycA - 1; tpi - 1). Пять штаммов: 44, 157(B-1107), I-364, 5YA, Yamal 2 - относятся к ST-3 (аллельный профиль: glpF - 2; gmk - 1; ilvD - 1; pta - 1; pur - 1; pycA - 1; tpi - 1). Выборка оказалась высокомономорфной: по 6 локусам выявлено по одному аллелю (1), и только локус glpF представлен двумя аллелями (1 и 2). Причем представленность этих аллелей не одинакова - аллель 2 обнаружен лишь у 5 штаммов из 40. Таким образом, из исследованной выборки выделяются 5 штаммов наличием одной однонуклеотидной замены 386 A^C в гене glpF. Эта нуклеотидная замена несинонимична и приводит к аминокислотной замене 129 N^-T
В численном выражении столь высокую генетическую мономорфность можно проиллюстрировать расчетом индекса биоразнообразия Симпсона (D), составляющим для данной выборки 0,224 [17]. Такое распределение по сиквенс-типам в целом отражает частоту встречаемости различных сиквенс-типов в глобальной популяции B. anthracis. К настоящему моменту из 640 штаммов B. anthracis, представленных в PubMLST [14], к ST-1 относятся 508 штаммов, к ST-2 - 19 штаммов и к ST-3 - 94 штамма. Остальные 12 сиквенс-типов (ST-134, ST-135, ST-552, ST-553, ST-933, ST-1659, ST-2006, ST-2007, ST-778, ST-1799, ST-1887 и ST-2005) представлены преимущественно одним штаммом (лишь в ST-778 входят 2 штамма, в ST-2005 - 2 штамма и 6 штаммов в ST-933). За счет
наличия «слабораспространенных» сиквенс-типов индекс Симпсона в представленной на PubMLST выборке увеличивается до 0,348, что тем не менее ниже, чем у других методов генотипирования [18]. Отсутствие в исследованной нами выборке третьего по распространенности ST-2 можно объяснить небольшим размером выборки, низкой распространенностью ST-2 или его отсутствием на территории России и сопредельных государств, где были выделены все описываемые в настоящей работе штаммы.
Интересно, что штаммы, отнесенные к ST-3 -44, 157(B-1107), I-364, 5YA и Yamal 2, - оказываются сгруппированными в один кластер и при использовании других широко распространенных методов генотипирования - canSNP-типирования (Canonical Single Nucleotide Polymorphism) и MLVA (Multiple Locus Variable-Number Tandem Repeat Analysis). В частности, они относятся к одной эволюционной линии B, обладают сходным MLVA-генотипом и крайне близкородственны по результатам полногеномного SNP-анализа, что вместе с приуроченностью мест их выделения к одному, пусть и достаточно протяженному, региону - северу Евразии - дало основания объединить их в северо-евразийский филогеографический кластер и предложить историческую модель их распространения в указанном регионе [19]. Кроме того, при исследовании аллельного полиморфизма гена одного из факторов вирулентности сибиреязвенного микроба - летального фактора - мы обнаружили, что именно у штаммов 44, 157(B-1107), I-364 и 5YA выявляется уникальная мутация (2126 A^-G), приводящая к аминокислотной замене глутаминовой кислоты на глицин в положении 709 соответствующего белка [20].
Основываясь на результатах MLST-генотипи-рования, мы провели кластерный анализ исследуемой выборки. На рисунке изображена UPGMA-дендрограмма, построенная для слитых in silico последовательностей семи локусов общим размером 2829 п.н. Оба сиквенс-типа (ST-1 и ST-3), к которым отнесены исследуемые штаммы, относятся к линии сибирской язвы, принадлежащей к кладе 1, описан-
ной в работе [11]. К этой же линии принадлежат штаммы B. anthracis, относящиеся к тринадцати другим описанным ранее сиквенс-типам.
Также обнаружена синонимичная замена 558 T^C в гене gmk у штамма 219/6. Эта мутация расположена за пределами участка гена, который используется для генотипирования по [11], поэтому сведения о ее распространенности у B. anthracis и группы B. cereus complex в PubMLST [14] отсутствуют. Удалось ее обнаружить потому, что вместо секвенирования только генотипически значимых участков генов мы оперировали несравнимо более информативными данными полногеномного секвенирования. Для того чтобы оценить распространенность выявленной мутации гена gmk, использовали BLAST-анализ [21], который показал, что она не
уникальна для штамма 219/6. Идентичная нуклео-тидная замена обнаруживается еще у 25 штаммов, представленных в GenBank, из которых 14 относятся к B. cereus, 9 - к B. thuringiensis, один штамм с неу-точненной видовой принадлежностью и только один принадлежит к B. anthracis (штамм MCCC 1A02161). Этот единственный штамм сибиреязвенного микроба с аналогичной мутацией относится к ST-778 по MLST. Более того, этот сиквенс-тип представлен в PubMLST [14] всего двумя штаммами - B. anthracis MCCC 1A02161 и B. anthracis N1ZF2, выделенными из донных отложений Южно-Китайского моря. Но нетипичное для сибиреязвенного микроба место выделения штаммов и результаты анализа SNP-профиля указывают на то, что эти штаммы были отнесены к виду B. anthracis ошибочно [22] и, скорее
UPGMA-дендрограмма исследуемой выборки штаммов B. anthracis, иллюстрирующая их филогенетическое положение
Примечание: Линия сибирской язвы [11]; Ba -
B. anthracis; Bc - B. cereus; ST - сиквенс-тип
UPGMA-dendrogram of the investigated sample of B. anthracis strains, illustrating their phylo-genetic position
Note : Anthrax lineage [11]; Ba - B. anthracis; Bc -B. cereus; ST - sequence type
всего, относятся к видам B. cereus complex. Такая нетипичная для B. anthracis замена в гене gmk тем не менее едва ли может сама по себе указывать на принадлежность штамма 219/6 не к виду B. anthracis. Тем более что этот штамм абсолютно типичен по своим культуральным и фаготипическим свойствам, обладает плазмидами вирулентности B. anthracis и вирулентен для мышей (LD50 = 101 КОЕ). По всей видимости, мы имеем дело с генетическим маркером, уникальным для штамма 219/6.
B. anthracis - относительно молодой патоген, эволюционная история которого насчитывает, по общепринятым представлениям, не более нескольких десятков тысяч лет. При этом особенность его жизненного цикла - заражение животного, быстрое наращивание в нем численности за 20-40 генераций, гибель хозяина и длительное нахождение в споровой форме в почве годами, десятилетиями и даже столетиями до нового цикла заражения - привели к тому, что за свой эволюционный путь B. anthracis прошел относительно небольшое число циклов клеточного деления и не успел накопить большое число мутаций, которые обеспечили бы заметное генетическое разнообразие [23]. К тому же специфичность сибиреязвенного микроба в отношении преимущественно копытных травоядных, то есть наиболее используемых человеком животных, привела к тому, что B. anthracis мог распространяться на значительные расстояния синантропно, вместе с перегоняемым скотом и/или перевозимыми товарами животного происхождения (кожа, шерсть, упряжь и т.д.) во время массовых переселений, колонизаций, военных мероприятий и торговых операций. В результате в один регион могли быть занесены штаммы различного географического происхождения, при этом не вытесняя ранее занесенные штаммы, а наравне с ними консервируясь в почве в споровой форме.
Поэтому генетическое разнообразие B. anthracis в пределах одного эпидемического очага или одного географического региона может отражать не столько эволюцию патогена, сколько историю хозяйственного использования этого региона [24]. Таким образом, с одной стороны, генетическое разнообразие внутри вида B. anthracis оказывается сравнительно небольшим, с другой стороны, географическое распределение успевших сформироваться филогенетических групп B. anthracis оказывается мозаичным. В качестве яркого примера можно привести штаммы 3Ya, 4Ya, 5Ya, которые были выделены из разных слоев почвы в одном раскопе в Якутии. При этом штамм 5Ya отличается от двух остальных по canSNP-, MLVA- и полногеномному SNP-профилю [19] и, как показано в данной работе, по MLST-сиквенс-типу, но близкородственен штамму Yamal 2.
Реконструкция истории географического распространения филогенетических групп B. anthracis оказывается крайне непростой задачей. Тем не менее в некотором приближении она решается с использованием ряда широко используемых методов генотипирования B. anthracis. Более того, суще-
ствуют алгоритмы последовательного применения этих методов по мере увеличения их разрешающей способности. Например, PHRANA (Progressive Hierarchical Resolving Assays using Nucleic Acids) [23, 25], предполагающий последовательное определение canSNP-группы, MLVA-профиля и SNR-профиля (Single Nucleotide Repeat), что позволяет увеличить значение индекса Симпсона до 0,98 [25]. Последовательное использование canSNP-, MLVA-и SNR-типирования в PHRANA позволяет достичь большей разрешающей способности и более точного определения филогенетических паттернов в рамках вида B. anthracis, чем любой из этих трех видов анализов, используемых независимо [25].
MLST в пределах вида B. anthracis обладает небольшой разрешающей способностью. поэтому он не используется в алгоритмах типирования, таких как PHRANA. Однако секвенирование нуклеотид-ных последовательностей, используемое для гено-типирования методом MLST, обусловливает его преимущества по сравнению с перечисленными методами. Полученные данные хорошо воспроизводимы среди лабораторий, а широкая доступность полных последовательностей геномов различных штаммов позволяет проводить исследования in silico. Так, существует база данных PubMLST [14], в которой представлены MLST-профили большого количества патогенных микроорганизмов, полученные в работах по исследованию методом MLST, в том числе штаммов B. cereus complex и B. anthracis в частности.
стоимость полногеномного секвенирования штамма вплотную приблизилась к стоимости сек-венирования панели локусов, используемых для MLST. При этом использовать прочитанную последовательность генома возможно для canSNP-, полногеномного SNP- и MLST-анализа, а при использовании гибридных технологий секвенирования, объединяющих данные, полученные на разных аппаратных платформах, например Illumina и Nanopore, - еще и для MLVA. При этом набор локусов для MLST и их размер исследователь может подбирать исходя из своих задач. Такое расширение панели используемых последовательностей может увеличить разрешающую способность MLST и выявить если не новые крупные филогенетически значимые группы, то уникальные для отдельных штаммов маркеры, такие как замена 558 T^C в гене gmk у штамма 219/6 из исследованной нами выборки.
Разрешающая сила того или иного метода гено-типирования напрямую связана с вариабельностью используемых маркеров, которая зависит не только от частоты возникновения мутаций, но и от влияния этих мутаций на жизнеспособность клетки. Если од-нонуклеотидная замена (SNP) или увеличение кратности тандемного повтора в некодирующем регионе (MLVA), скорее всего, не снизят жизнеспособность и закрепятся в популяции, то несинонимичная мутация в гене домашнего хозяйства имеет шанс повлиять на уровень экспрессии или конформацию белка, обеспечивающего основные метаболические пути клетки,
что может снизить скорость размножения бактериальных клеток и привести к элиминации мутантного генотипа. То есть генетические локусы, на которых основан метод MLST, находятся под действием стабилизирующего отбора, что, с одной стороны, снижает их вариабельность, но с другой - значительно уменьшает вероятность независимого возникновения аналогичных мутаций в филогенетически удаленных группах и увеличивает эволюционную значимость каждой мутации в них и, соответственно, филогенетическую значимость каждого MLST-сиквенс-типа. То есть MLST-сиквенс-типы можно, пусть и несколько спекулятивно, счесть филогенетическими группами более высокого порядка, чем даже canSNP-группы, не говоря уже об MLVA-генотипах. Таким образом, методы с низким разрешением, такие как canSNP-типирование и MLST-генотипирование, мало значимые для санитарной эпидемиологии, тем не менее выявляют филогенетические группы более высокого порядка, что важно для реконструкции эволюционной истории вида B. anthracis и B. cereus complex в целом. Кроме того, поэтапное генотипирование разного уровня разрешения, а именно: MLST, MLVA и SNP-типирование - является одной из основных точек паспортизации штаммов.
Молекулярные методы обнаружения B. anthracis в образцах, основанные на ПЦР, нацелены на гены вирулентности, локализованные на плазмидах [5]. Они позволяют различать вакцинные и вирулентные штаммы, но имеют ограничения для лишенных плаз-мид штаммов B. anthracis или близкородственных видов бацилл, содержащих трансформированные плазмиды pXO или гены вирулентности B. anthracis. например, известны изоляты B. cereus, способные вызвать схожие с сибирской язвой симптомы из-за наличия в их геноме плазмид вирулентности [3]. поскольку все используемые для MLST локусы находятся на хромосоме, метод не имеет ограничений для штаммов, лишенных плазмид вирулентности, например вакцинных штаммов B. anthracis или штаммов B. cereus, содержащих в геноме эти плазмиды.
Таким образом, результаты генотипирования с использованием подходов MLST, SNP-типирования и MLVA, полученные нами и рядом авторов [19, 20], коррелируют. А результаты, полученные в этой работе, подчеркивают генетическую обособленность штаммов B. anthracis, выделенных нами в ST-3, поскольку ранее уже предложено отнести эти штаммы в отдельный филогенетический кластер, что особенно интересно с учетом того, что MLST используется как метод дифференцирования видов B. cereus complex или крупных групп штаммов [19].
конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
список литературы
1. Carroll L.M., Kovac J Miller R.A., Wiedmann M. Rapid, high-throughput identification of anthrax-causing and emetic Bacillus cereus group genome assemblies via BTyper, a computational tool for virulence-based classification of Bacillus cereus group isolates
by using nucleotide sequencing data. Appl. Environ. Microbiol. 2017; 83(17):e01096-17. DOI: 10.m8/AEM01096-17.
2. Маринин Л.И., дятлов И.А., Шишкова н.А., Герасимов
B.н. Сибиреязвенные скотомогильники: проблемы и решения. М.: династия; 2017. 215 с.
3. Hoffmann C., Zimmermann F., Biek R., Kuehl H., Nowak K., Mundry R Agbor A., Angedakin S., Arandjelovic M., Blankenburg A., Brazolla G., Corogenes K., Couacy-Hymann E., Deschner TT, Dieguez P., Dierks K., Düx A., Dupke S., Eshuis H., Formenty P., Yuh Y.G., Goedmakers A., Gogarten J.F., Granjon A.C., McGraw S., Grunow R., Hart J., Jones S., Junker J., Kiang J., Langergraber K., Lapuente J., Lee K., Leendertz S.A., LeguillonP., Leinert V., Löhrich T., Marrocoli S., Mätz-Rensing K., Meier A., Merkel K Metzger S., Murai M., Niedorf S., De Nys H., Sachse A., van Schijndel J., Thiesen U., Ton E., Wu D., Wieler L.H., Boesch C., Klee S.R., Wittig R.M., Calvignac-Spencer S., Leendertz F.H. Persistent anthrax as a major driver of wildlife mortality in a tropical rainforest. Nature. 2017; 548(7665):82-6. DOI: 10.1038/nature23309.
4. Helgason E., Tourasse N.J., Meisal R., Caugant D.A., Kolsto
A.B. Multilocus sequence typing scheme for bacteria of the Bacillus cereus group. Appl. Environ. Microbiol. 2004; 70(1):191-201. DOI: 10.1128/aem.7(H.191-201.2004.
5. Agren J., Hamidjaja R.A., Hansen T., Ruuls R., Thierry S., Vigre H., Janse I., Sundstrom A., Segerman B., Koene M., Löfström
C., Van Rotterdam B., Derzelle S. In silico and in vitro evaluation of PCR-based assays for the detection of Bacillus anthracis chromosomal signature sequences. Virulence. 2013; 4(8):671-85. DOI: 10.4161/viru.26288.
6. Maiden M.C., Bygraves J.A., Feil E., Morelli G., Russell J.E., Urwin R., Zhang Q., Zhou J., Zurth K., Caugant D.A., Feavers I.M., Achtman M., Spratt B.G. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998; 95(6):3140-5. DOI: 10.1073/pnas.95.6.3140.
7. Enright M.C., Spratt B.G., Kalia A., Cross J.H., Bessen
D.E. Multilocus sequence typing of Streptococcus pyogenes and the relationships between emm type and clone. Infect. Immun. 2001; 69(4):2416-27 DOI: 10.1128/iai.69.4.2416-2427.2001.
8. Van Loo I.H.M., Heuvelman K.J., King A.J., Mooi F.R. Multilocus sequence typing of Bordetella pertussis based on surface protein genes. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(6):1994-2001. DOI: 10.n28/jcm.40.6.1994-2001.2002.
9. Noller A.C., McEllistrem M.C., Stine O.C., Morris J.G.Jr., Boxrud D.J., Dixon B., Harrison L.H. Multilocus sequence typing reveals a lack of diversity among Escherichia coli O157:H7 isolates that are distinct by pulsed-field gel electrophoresis. J. Clin. Microbiol. 2003; 41(2):675-9. DOI: 10.1128/jcm.41.2.675-679.2003.
10. Kotetishvili M., Stine O.C., Kreger A., Morris J.G., Sulakvelidze A. Multilocus sequence typing for characterization of clinical and environmental Salmonella strains. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(5):1626-35. DOI: 10.1128/jcm.40.5.1626-1635.2002.
11. Priest F.G., Barker M., Baillie L.W.J., Holmes E.C., Maiden M.C.J. Population structure and evolution of the Bacillus cereus group. J. Bacteriol. 2004; 186(23):7959-70. DOI: 10.1128/ jb.186.23.7959-7970.2004.
12. Sorokin A., Candelon B., Guilloux K., Galleron N., Wackerow-Kouzova N., Ehrlich S.D., Bourguet D., Sanchis V. Multiple-locus sequence typing analysis of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis reveals separate clustering and a distinct population structure of psychrotrophic strains. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72(2):1569-78. DOI: 10.1128/aem.7Z2.1569-1578.2006.
13. Tourasse N.J., Helgason E., Okstad O.A., Hegna I.K., Kolsto A.B. The Bacillus cereus group: novel aspects of population structure and genome dynamics. J. Appl. Microbiol. 2006; 101(3):579-93. DOI: 10.1111/j.1365-2672.2006.03087.x.
14. PubMLST - Public databases for molecular typing and microbial genome diversity. [Электронный ресурс]. URL: https:// pubmlst.org/bcereus/ (дата обращения 20.11.2020).
15. Ogawa H., Fujikura D., Ohnuma M., Ohnishi N., Hang'ombe
B.M., Mimuro H., Ezaki T., Mweene A.S., Higashi H. A novelmulti-plex PCR discriminates Bacillus anthracis and its genetically related strains from other Bacillus cereus group species. PLoS One. 2015; 10(3):e0122004. DOI: 10.1371/journaLpone.0122004.
16. Venkateswaran K, Singh N.K, Checinska Sielaff A., Pope R.K., Bergman N.H., van Tongeren S.P., Patel N.B., Lawson P.A., Satomi M, Williamson C., Sahl J.W., Keim P., Pierson D Perry J. Non-toxin-producing Bacillus cereus strains belonging to the B. an-thracis clade isolated from the international space station. mSystems. 2017; 2(3):e00021-17. DOI: 10.1128/mSystems.00021-17.
17. Hunter P.R., Gaston M.A. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity. J. Clin. Microbiol. 1988; 26(11):2465-6. DOI: 10.1128/ JCM.26.1L2465-2466.1988.
18. Sue D., Marston C.K., Hoffmaster A.R., Wilkins P.P. Genetic diversity in a Bacillus anthracis historical collection (1954 to 1988). J. Clin. Microbiol. 2007; 45(6):1777-82. DOI:10.1128/ JCM.02488-06.
19. Timofeev V., Bahtejeva I., Mironova R., Titareva G., Lev I., Christiany D., Borzilov A., Bogun A., Vergnaud G. Insights from
Bacillus anthracis strains isolated from permafrost in the tundra zone of Russia. PLoS One. 2019; 4(5):e0209140. DOI: 10.1371/journal. pone.0209140.
20. Гончарова Ю.О., Бахтеева И.В., Титарева Г.М., Миронова Р.И.,Кисличкина A.A., Майская H.B Мокриевич А.Н., Тимофеев B.C. Аллельный полиморфизм гена lefу штаммов возбудителя сибирской язвы из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов («ГКПМ-Оболенск»). Бактериология. 2019; 4(2)7-12. DOI: 10.20953/2500-1027-2019-2-7-12.
21. BLAST. [Электронный ресурс]. URL: https://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi (дата обращения 01.11.2020).
22. Pisarenko S.V., Eremenko E.I., Ryazanova A.G., Kovalev D.A., Buravtseva N.P., Aksenova L.Y., Evchenko A.Y, Semenova O.V., Bobrisheva O.V., Kuznetsova I.V., Golovinskaya T.M., Tchmerenko D.K., Kulichenko A.N., Morozov V.Y. Genotyping and phylogenetic location of one clinical isolate of Bacillus anthracis isolated from a human in Russia. BMC Microbiol. 2019; 19(1):165. DOI: 10.1186/s12866-019-1542-3.
23. Braun P., Grass G., Aceti A., Serrecchia L., Affuso A., Marino L., Grimaldi S., Pagano S., Hanczaruk M., Georgi E., Northoff B., Schöler A., Schloter M., Antwerpen M., Fasanella A. Microevolution of anthrax from a young ancestor (M.A.Y.A.) suggests a soil-borne life cycle of Bacillus anthracis. PLoS One. 2015; 10(8):e0135346. DOI: 10.1371/journal.pone.0135346.
24. Vergnaud G. Bacillus anthracis evolution: taking advantage of the topology of the phylogenetic tree and human history to propose dating points. Erciyes Med. J. 2020; 42(4):362-9. DOI: I0.14744/etd.2020.64920.
25. Keim P., Van Ert M.N., Pearson T., Vogler A.J., Hynh L.Y., Wagner D.M. Anthrax molecular epidemiology and forensics: using the appropriate marker for different evolutionary scales. Infect. Genet. Evof. 2004; 4(3):205-13. DOI: 10.1016/j.meegid.2004.02.005.
References
1. Carroll L.M., Kovac J Miller R.A., Wiedmann M. Rapid, high-throughput identification of anthrax-causing and emetic Bacillus cereus group genome assemblies via BTyper, a computational tool for virulence-based classification of Bacillus cereus group isolates by using nucleotide sequencing data. Appl. Environ. Microbiol. 2017; 83(17):e01096-17. DOI: 10.lf28/AEM:01096-17.
2. Marinin L.I., Dyatlov I.A., Shishkova N.A., Gerasimov V.N. [Anthrax Cattle Burial Grounds: Problems and Solutions]. Moscow: "Dynasty"; 2017. 215 p.
3. Hoffmann C., Zimmermann F., Biek R., Kuehl H., Nowak K., Mundry R., Agbor A., Angedakin S., Arancljelovic M., Blankenburg A., Brazolla G., Corogenes K., Couacy-Hymann E., Deschner T., Dieguez P., Dierks K., Düx A., Dupke S., Eshuis H., Formenty P., Yuh Y.G., Goedmakers A., Gogarten J.F., Granjon A.C., McGraw S., Grunow R., Hart J., Jones S., Junker J., Kiang J., Langergraber K., Lapuente J., Lee K., Leendertz S.A., LeguillonF., Leinert V., Löhrich T., Marrocoli S., Mätz-Rensing K., Meier A., Merkel K Metzger S., Murai M., Niedorf S., De Nys H., Sachse A., van Schijndel J., Thiesen U., Ton E., Wu D., Wieler L.H., Boesch C., Klee S.R., Wittig R.M., Calvignac-Spencer S., Leendertz F.H. Persistent anthrax as a major driver of wildlife mortality in a tropical rainforest. Nature. 2017; 548(7665):82-6. DOI: 10.1038/nature23309.
4. Helgason E., Tourasse N.J., Meisal R., Caugant D.A., Kolsto A.B. Multilocus sequence typing scheme for bacteria of the Bacillus cereus group. Appl. Environ. Microbiol. 2004; 70(1):191-201. DOI: 10.1128/aem.7(H.191-201.2004.
5. Agren J., Hamidjaja R.A., Hansen T., Ruuls R., Thierry S., Vigre H., Janse I., Sundstrom A., Segerman B., Koene M., Löfström
C., Van Rotterdam B., Derzelle S. In silico and in vitro evaluation of PCR-based assays for the detection of Bacillus anthracis chromosomal signature sequences. Virulence. 2013; 4(8):671-85. DOI: 10.4161/viru.26288.
6. Maiden M.C., Bygraves J.A., Feil E., Morelli G., Russell J.E., Urwin R., Zhang Q., Zhou J., ZuTth K., Caugant D.A., Feavers I.M., Achtman M., Spratt B.G. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998; 95(6):3140-5. DOI: 10.1073/pnas.95.6.3140.
7. Enright M.C., Spratt B.G., Kalia A., Cross J.H., Bessen
D.E. Multilocus sequence typing of Streptococcus pyogenes and the relationships between emm type and clone. Infect. Immun. 2001; 69(4)2416-27. DOI: 10.1128/iai.69.4.2416-2427.2001.
8. Van Loo I.H.M., Heuvelman K.J., King A.J., Mooi F.R. Multilocus sequence typing of Bordetella pertussis based on surface protein genes. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(6):1994-2001. DOI: 10.n28/jcm.40.6.1994-2001.2002.
9. Noller A.C., McEllistrem M.C., Stine O.C., Morris J.G.Jr., Boxrud D.J., Dixon B., Harrison L.H. Multilocus sequence typing reveals a lack of diversity among Escherichia coli O157:H7 isolates that are distinct by pulsed-field gel electrophoresis. J. Clin. Microbiol. 2003; 41(2):675-9. DOI: 10.1128/jcm.41.2.675-679.2003.
10. Kotetishvili M., Stine O.C., Kreger A., Morris J.G., Sulakvelidze A. Multilocus sequence typing for characterization of clinical and environmental Salmonella strains. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(5):1626-35. DOI: 10.1128/jcm.40.5.1626-1635.2002.
11. Priest F.G., Barker M., Baillie L.W.J., Holmes E.C., Maiden M.C.J. Population structure and evolution of the Bacillus cereus group. J. Bacteriol. 2004; 186(23):7959-70. DOI: 10.1128/ jb.186.23.7959-7970.2004.
12. Sorokin A., Candelon B., Guilloux K., Galleron N., Wackerow-Kouzova N., Ehrlich S.D., Bourguet D., Sanchis V. Multiple-locus sequence typing analysis of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis reveals separate clustering and a distinct population structure of psychrotrophic strains. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72(2):1569-78. DOI: l0.1128/aem.72:2.1569-1578.2006.
13. Tourasse N.J., Helgason E., Okstad O.A., Hegna I.K., Kolsto A.B. The Bacillus cereus group: novel aspects of population structure and genome dynamics. J. Appl. Microbiol. 2006; 101(3):579-93. DOI: 10.1111/j.1365-2672.2006.03087.x.
14. PubMLST - Public databases for molecular typing and microbial genome diversity. (Cited: November 20, 2020). [Internet]. Available from: https://pubmlst.org/bcereus/.
15. Ogawa H., Fmikura D., Ohnuma M., Ohnishi N., Hang'ombe B.M., Mimuro H., Ezaki T., Mweene A.S., Higashi H. A novel multiplex PCR discriminates Bacillus anthracis and its genetically related strains from other Bacillus cereus group species. PLoS One. 2015; 10(3):e0122004. DOI: 10.1371/journal.pone.0122004.
16. Venkateswaran K, Singh N.K, Checinska Sielaff A., Pope R.K., Bergman N.H., van Tongeren S.P., Patel N.B., Lawson P.A., Satomi M, Williamson C., Sahl J.W., Keim P., Pierson D Perry J. Non-toxin-producing Bacillus cereus strains belonging to the B. anthracis clade isolated from the international space station. mSystems. 2017; 2(3):e00021-17. DOI: 10.1128/mSystems.00021-17.
17. Hunter P.R., Gaston M.A. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity. J. Clin. Microbiol. 1988; 26(11):2465-6. DOI: 10.1128/ JCM.26.11.2465-2466.1988.
18. Sue D., Marston C.K., Hoffmaster A.R., Wilkins P.P. Genetic diversity in a Bacillus anthracis historical collection (1954 to 1988). J. Clin. Microbiol. 2007; 45(6):1777-82. DOI:10.1128/ JCM.02488-06.
19. Timofeev V., Bahtejeva I., Mironova R., Titareva G., Lev I., Christiany D., Borzilov A., Bogun A., Vergnaud G. Insights from Bacillus anthracis strains isolated from permafrost in the tundra zone of Russia. PLoS One. 2019; 4(5):e0209140. DOI: 10.1371/journal. pone.0209140.
20. Goncharova Yu.O., Bakhteeva I.V., Titareva G.M., Mironova R.I., Kislichkina A.A., Mayskaya N.V., Mokrievich A.N., Timofeev V.S. [Allelic polymorphism of the lef gene in anthrax pathogen strains from the State collection of pathogenic microorganisms ("GKPM-Obolensk")]. Bakteriologiya [Bacteriology]. 2019; 4(2):7-12. (In Russian). DOI: 10.20953/2500-1027-2019-2-7-12.
21. BLAST. (Cited: November 01, 2020). [Internet]. Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
22. Pisarenko S.V., Eremenko E.I., Ryazanova A.G., Kovalev D.A., Buravtseva N.P., Aksenova L.Y., Evchenko A.Y., Semenova O.V., Bobrisheva O.V., Kuznetsova I.V., Golovinskaya T.M., Tchmerenko D.K., Kulichenko A.N., Morozov V. Y. Genotyping and phylogenetic location of one clinical isolate of Bacillus anthracis isolated from a human in Russia. BMC Microbiol. 2019; 19(1):165. DOI: 10.1186/s12866-019-1542-3.
23. Braun P., Grass G., Aceti A., Serrecchia L., Affuso A., Marino L., Grimaldi S., Pagano S., Hanczaruk M., Georgi E., Northoff B., Schöler A., Schloter M., Antwerpen M., Fasanella A. Microevolution of anthrax from a young ancestor (M.A.Y.A.) suggests a soil-borne life cycle of Bacillus anthracis. PLoS One. 2015; 10(8):e0135346. DOI: 10.1371/journal.pone.0135346.
24. Vergnaud G. Bacillus anthracis evolution: taking advantage of the topology of the phylogenetic tree and human history to propose dating points. Erciyes Med. J. 2020; 42(4):362-9. DOI: 10.14744/etd.2020.64920.
25. Keim P., Van Ert M.N., Pearson T., VoglerA.J., Huynh L.Y., Wagner D.M. Anthrax molecular epidemiology and forensics: using the appropriate marker for different evolutionary scales. Infect. Genet. Evof. 2004; 4(3):205-13. DOI: 10.1016/j.meegid.2004.02.005.
Authors:
Goncharova Yu.O., Bakhteeva I.V., Mironova R.I., Bogun A.G., KhlopovaK.V., Timofeev V.S. State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology. Obolensk, Moscow Region, 142279, Russian Federation. E-mail: info@obolensk.org.
об авторах:
Гончарова Ю.О., Бахтеева И.В., Миронова Р.И., Богун А.Г., Хлопова К.В., Тимофеев В.С. Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. Российская Федерация, 142279, Московская обл., п. Оболенск. E-mail: info@obolensk.org.
