CC BY
402017 т 7 № 3 крымскии журнал экспериментальной и клиническои медицины
УДК 615.37:591.471.427.44:599.323.4
МОРФОСТРУКТУРА СЕЛЕЗЁНКИ КРЫС ПОСЛЕ УДАЛЕНИЯ ТИМУСА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Кащенко С. А., Захаров А. А., Бобрышева И. В.
Кафедра гистологии, цитологии, эмбриологии ГУ «Луганский государственный медицинский университет им. Святителя Луки», 348045, кв. 50-летия Обороны Луганска, 1 г, Луганск
Для корреспонденции: Кащенко Светлана Аркадьевна, доктор медицинских наук, заведующая кафедрой гистологии, цитологии, эмбриологии ГУ «Луганский государственный медицинский университет», е-mail: kashchenko_s@list.ru
For correspondence: Svetlana A. Kashchenko, Dr. Sci. Med., head of the department of histology, cytology, embryology SI «Lugansk State Medical University», E-mail: kashchenko_s@list.ru
Information about authors:
Kashchenko S. A., http://orcid.org/0000-0001-6793-1975 Zakharov A. A., http://orcid.org/0000-0002-7377-2891 Bobrysheva I. V., http://orcid.org/0000-0003-3087-1600
РЕЗЮМЕ
В статье изложены результаты исследования селезенки крыс-самцов (60) репродуктивного возрастного периода на 7, 15, 30, 90 и 180 сутки после удаления тимуса в эксперименте. С применением органометрических, гистологических и морфометрических методов с последующим статистическим анализом результатов установлено изменение показателей площадей сечения белой пульпы селезенки, изменение морфометрических параметров лимфатических узелков, герминативных центров и маргинальной зоны. Наиболее высокий уровень реактивности со стороны селезенки наблюдается на 7, 15 и 30 сутки. У тимэктомированных животных на 7-30 сутки после операции численность лимфобластов и плазмобластов/плазмоцитов в белой пульпе селезенки была ниже в 1,4 раза, а макрофагов - в 1,2 в сравнении с контрольными данными.
Ключевые слова: крысы, тимэктомия, селезёнка.
Kashchenko S. A., Zakharov A. A., Bobrysheva I. V.
SI «Lugansk State Medical University»
SUMMARY
The results of the study of the spleen of male rats (60) of the reproductive age on 7, 15, 30, 90 and 180 days after extraction of the thymus in the experiment are presented in article. With the use of the organometric, histological and morphometric methods with subsequent statistical analysis of the results, the parameters of the cross-sectional area of the white pulp of the spleen, the change in the morphometric parameters of the lymph nodes, the germinal centers, and the marginal zone were established. The highest level of reactivity of the spleen on days 7, 15 and 30 is observed. In thymectomized animals on day 7 - 30 after the operation the number of lymphoblasts and plasmablasts/ plasmocytes in the white pulp of the spleen was in 1.4 times lower, and macrophages wasin 1.2 lower in comparison with the control data.
Keywords: rats, thymectomy, spleen.
Иммунокомпетентные органы в экспериментальных и клинических условиях выполняют огромную роль в поддержании иммунологического гомеостаза организма [1, 2]. Превалирующее количество публикуемых в медицинских периодических изданиях работ, касающихся состояния иммунитета, посвящено исследованиям клинического или иммунологического направления, морфологические работы встречаются намного реже. Строение органов иммунной системы в значительной степени зависит от экологической обстановки, возраста, состояния здоровья, стресса и других воздействий [3, 4, 5]. Структурные дефекты иммунокомпетент-ных органов являются главными маркёрами
нарушений иммунного статуса организма. О процессах, развивающихся в органах иммунной системы, можно объективно судить по изменению их массы, объемов, площади сечения Т-зависимых и В-зависимых зон на гистологических срезах. Опубликованные в периодической печати результаты исследований, выполненных на экспериментальных животных, преимущественно отражают информацию, освещающую строение тимуса [6]. Сведения относительно морфоструктуры селезёнки при иммунодефиците в литературе встречаются в ограниченном количестве. В этой связи целью нашей работы явилось изучение строения селезёнки крыс после удаления тимуса.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование проведено на 60-ти крысах-самцах в возрасте 10 мес. на начало эксперимента. Все манипуляции с животными соответствовали «Руководству по содержанию и использованию лабораторных животных» («Guideforthe Careand Use of Laboratory Animals», National Academy Press, USA, 2011). Тимэктомию производили хирургическим способом по стандартной методике, контролем служили ложноопери-рованные крысы. Выведение животных из эксперимента производили под эфирным наркозом на 7, 15, 30, 90 и 180 сутки. Забор органов проводился с 10 до 12 часов дня [7]. Селезёнку взвешивали на торсионных весах, измеряли органоме-трические параметры и фиксировали в 10 % растворе формалина. Гистологические срезы органа толщиной 5 мкм, произведенные на уровне её ворот, окрашивали гематоксилин-эозином.
Исследование препаратов селезенки производили с помощью аппаратно-программного комплекса на основе микроскопа Olympus BX 41. Для морфометрического анализа снимков селезенки использовали оригинальную морфометрическую программу Morphologic Light. Линейные показатели (диаметр лимфатических узелков белой пульпы селезёнки и её герминативных центров, ширина маргинальной зоны) регистрировались с помощью создания «объекта-расстояния» между двумя точками (в мкм). Площади сечения структурных компонентов селезёнки (белой и красной пульпы) определялись способом «наложения масок». В дальнейшем эти показа-
тели выражались в процентах по отношению к общей площади среза. Морфометрию производили в шести полях зрения, анализировались шесть срезов с каждого объекта. Подсчет клеток в различных лимфоидных структурах селезенки проводился с помощью шестнадцатиузловой морфометрической сетки А. А. Глаголева (1941) в модификации С. В. Стефанова (1974), вмонтированной в окуляр (х40) микроскопа. Определялось абсолютное количество клеток на единицу площади и процентное количество разных функциональных генераций клеток. Протокол исследования включал идентификацию и подсчет бластных форм, макрофагов, плазмоцитов/ плазмобластов. Статистический анализ результатов проводился с использованием методов параметрической ^-критерий Стъюдента, р<0,05) статистики в программном пакете 81а1М1са 6.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Селезенка - это крупный паренхиматозный орган иммунной системы, активно реагирующий на любой иммунопатологический процесс в организме. Масса селезёнки отражает динамический баланс и функциональную активность иммунной системы в целом. У половозрелых крыс контрольной группы абсолютная масса селезёнки при наблюдении на протяжении 6 месяцев постепенно увеличивалась (рис. 1), а относительная масса уменьшалась от 4,31±0,46 в начале наблюдения до 2,65±0,31 в конце. У экспериментальных животных масса селезенки достоверно превышала контрольные данные на 7, 15 и 30 сутки.
Рис. 1. Динамика изменения абсолютной массы селезёнки (мг) половозрелых белых крыс после ти-
мэктомии и в контроле (M±m, п=6).
Морфоструктураструктура селезёнки крыс содержит основные компоненты белой и красной пульпы. В красной пульпе различают эллипсо-
идные макрофагально-лимфоидные муфты (эллипсоиды или ПАЛМ) и лимфатические узелки, окружающие центральную артерию. В послед-
2017, т. 7, № 3
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
них вокруг центральной артерии располагаются фибробластические, ретикулярные, дендритные клетки, макрофаги и большое количество мигрирующих лимфоцитов. У крыс лимфатические узелки имеют сферическую или полусферическую форму и через определенное расстояние прикрепляются к внешней стороне ПАЛМ. Нередко в селезенке крыс обнаруживаются лимфатические узелки, которые не прилегают к ПАЛМ. В центральной области узелка находится герминативный центр, окруженный мантийной зоной, содержащей рециркулирующие малые темные В-лимфоциты. Маргинальная зона заселена преимущественно В-лимфоцитами с относительно бледными ядрами и обильной цитоплазмой, которые морфологически отличаются от В-лимфоцитов мантийной зоны [8]. В составе маргинальной зоны В-лимфоциты расположены в 4-5 слоев. Макрофаги в белой пульпе органа занимают маргинальное положение и, вероятно, ограничивают доступ высокомолекулярных веществ из красной в белую пульпу. У крыс большинство В-лимфоцитов маргинальной зоны дифференцируется в плазматические клетки, вырабатывающие ^М [9].
Красная пульпа селезенки содержит венозные синусы, трабекулы, селезёночные (пульпар-ные) тяжи, в которых наряду с эритроцитами находятся макрофаги, лимфоциты, мегакарио-циты и другие форменные элементы. Ретикулярная строма селезенки крыс имеет костно-моз-говое происхождение [10]. Основу лимфатического узелка составляют дендритные клетки.
У контрольных животных лимфатические узелки белой пульпы в начале наблюдения имеют преимущественно округлую форму и довольно крупные размеры. Герминативные центры наблюдаются не во всех лимфатических узелках. В последующем размеры лимфатических узелков по морфометрическим параметрам отличаются несущественно. Диаметры герминативных центров варьируют, ширина краевой зоны имеет стабильные параметры. Площадь белой пульпы селезёнки постепенно уменьшается (табл. 1).
Селезёнка, являясь периферическим органом иммунопоэза, принимает непосредственное участие в коррекции дефекта иммунитета, вызванного тимэктомией. Микроанатомическое строение селезёнки у тимэктомированных животных после операции не отличается от структуры органа контрольных крыс (рис. 2). Лимфатические узелки имеют округлую форму, встречаются группы, состоящие из нескольких узелков. Основные морфометрические параметры белой пульпы селезёнки от контрольных значений существенно не отличаются, за исключением площади белой пульпы, величина которой по отно-
шению к контролю на 7-е сутки после тимэкто-мии снижается на 11,50 %. Во все сроки наблюдения (7-180 сут.) у тимэктомированных животных размеры лимфатических узелков имеют сходные морфометрические параметры. Герминативные центры обнаруживаются в единичном количестве (7 сут.), на 15-е - 30-е сут. их количество значительно возрастает, что свидетельствует в пользу активизации гуморального иммунитета. В поздний период наблюдения (90, 180 сут.) количество герминативных центров в лимфатических узелках постепенно снижается. Ширина краевой зоны у подопытных крыс меньше, чем в контроле, на 4,02 % (7 сут.), 21,78 % (15 сут.), 21,02 % (30 сут.), 21,12 % (90 сут.), 34,15 % (180 сут.). Ширина краевой зоны у подопытных крыс меньше, чем в контроле, на 4,02 % (7 сут.), 21,78 % (15 сут.), 21,02 % (30сут.), 21,12 % (90 сут.), 34,15 % (180 сут.).
Площадь сечения белой пульпы селезёнки у тимэктомированных животных снижается и отличается от аналогичных показателей контрольной группы на 11,51 % (7 сут.), 15,93 % (15 сут.), 16,75 % (30 сут.), 8,09 % (90 сут.) и 7,86 % (180 сут.).
Подсчитывались показатели клеточности в лимфатических узелках с герминативным центром (1) и без него (2) у контрольных животных: лимфобласты - 5,4±0,08 и 0,6±0,13; макрофаги -5,1±0,02 и 1,5±0,04; плазмобласты/плазмоциты -1,8±0,03 и 1,5±0,03. У тимэктомированных животных на 7 и 15 сутки после операции численность лимфобластови плазмобластов/плазмоцитов снизилась в 1,4 раза, а макрофагов - в 1,2. В дальнейшие сроки (90, 180 сут.) эти показатели приближались к контрольным. Однонаправленные результаты на мышах были получены в работах Резник Е. Ю. с соавт. [11], это касается динамики изменения массы селезенки, а также численности молодых делящихся клеток и макрофагов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Результаты проведенного гистоморфоме-трического исследования свидетельствуют о том, что: 1) тимэктомия у половозрелых крыс вызывает иммуноморфологическую перестройку в селезенке животных; 2) удаление тимуса влияет на количество клеток, способных осуществлять фагоцитоз; незначительная вариабельность площади белой пульпы в селезёнке животных указывает на стабильность функциональной активности её тимусзависимых зон; наличие единичных герминативных центров в лимфатических узелках селезёнки в одни сроки опыта (7, 15 суток) и полное их отсутствие в другие (180 сут.), а также уменьшение численности бластов позволяет предположить снижение степени активности гуморального звена иммунитета в ответ на тимэктомию.
Рис. 2. Селезёнка половозрелых крыс: а - через 30 сут. после тимэктомии; б - через 30 сут. после ложной тимэктомии: 1 - лимфатический узелок, 2 - герминативный центр, 3 - краевая зона, 4 - периарте-риальная лимфоидная муфта, 5 - трабекулы, 6 -красная пульпа. Гематоксилин-эозин. Приближение:
Zoom 162. Объекти в: Plan 4х
Таблица 1
Морфометрические показатели белой пульпы селезёнки (в мкм) крыс при тимэктомии и в контроле
(M±m, n=36)
Группы животных Сроки в сутках Диаметры лимфатических узелков Диаметры герминативных центров Ширина маргинальной зоны Площадь поперечного сечения белой пульпы селезёнки, %
1 2 3 4 5 6
После тимэктомии 7 359,17±10,82 131,83±3,22 123,01±1,94 28,39±1,04*
15 377,17±3,39* 115,33±2,99 93,86±1,31* 20,19±1,19*
30 395,73±1,41* 119,81±1,36* 81,01±0,41* 19,83±1,21*
90 350,06±1,33* 62,17±1,35* 82,01±1,34* 18,15±1,21
180 354,91±1,12* 65,45±1,31 69,82±2,95* 17,59±1,26
Контроль к тим-эктомии 7 375,09±1,35 130,42±1,36 128,15±1,21 30,08±1,34
15 479,82±1,31 104,15±2,46 120,01±1,42 24,02±1,27
30 455,81±1,27 98,99±1,21 96,99±1,17 23,82±1,48
90 416,56±9,22 139,92±1,29 103,97±1,26 19,75±1,12
180 447,72±1,05 67,12±2,54 106,03±1,11 19,09±1,32
Примечание: * - достоверное отличие от контрольных данных (p<0,05)
2017, т. 7, № 3
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Сапин М. Р., Этинген Л. Е. Иммунная система человека. М.: Медицина, 199б.
2. Бабичев В. Н. Организация и функционирование нейроэндокринной системы. Проблемы эндокринологии. 2G13; S9 (1):62-69.DOI:10.14341/probl201359162-69.
3. Маткина О. В. Патогистологические изменения в тимусе и селезенке неинбредных белых крыс при остром стрессе. Пермский медицинский журнал.2G14; 31 (1):121 — 12S.
4. Вовкогон А. Д. Изменения лимфоидной ткани и массы селезёнки в условиях потребления воды с различным содержанием микроорганизмов. Морфология. 1997; 112(6):SG-S3.
5. Цыренова Д. З., Гуляев С. М., Хобрако-ва В. Б. Влияние экстракта Phlomoidestuberose [L]Moench на структуру селезёнки мышей при иммуносупрессии. Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2G17; 1S (1):S3-S7. DOI: 1G.17S16/RCF1S1S3-S7.
6. Ярилин А. А. Старение иммунной системы и тимуса. Клиническая геронтология.2GG3;(3):S-17.
7. Баркова Э. Н., Шатилович Л. Н., Кашуба Э. А. Сезонные особенности циркадианных ритмов содержания лейкоцитов в периферической крови у крыс линии Вистар. Бюллетень экспериментальной биологии. 1992;63(3):3G6-3GS.
S. Birte S. Human spleen microanatomy: why mice do not suffice. Immunology. 2G1S;14S(3):334-346. DOI: 1G.1111/imm.12469.
9. Dammers PM, Visser A, Popa ER, Nieuwenhuis P, Kroese FG. Most marginal zone B cells in rat express germline encoded Ig VH genes and are ligand selected. J Immunol. 2GGG;16S:61S6-69. DOI: 1G.4G49/jimmunol.16S.11.61S6.
1G. Katakai T. Marginal reticular cells: a stromal subset directly descended from the lymphoid tissue organizer. FrontiersinImmunology. 2G12;3. DOI: 1 G.33S9/fimmu.2G 12.GG2GG.
11. Резник E. Ю., Родниченко А. E., Васильев Р. Г., Лабунец И. Ф. Влияние тимэктомии на иммунный ответ у мышей линии СВА/Са. бб-я Всероссийская научно-практическая конференция молодых учёных и студентов «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения», УГМА. Апрель 2G11. Доступно по: http://nomus.ucoz.net/index/G-2.
REFERENSES
1. Sapin M.R., Etingen L.E. The human immune system. M.: Meditsina;1996 (In Russ).
2. Babichev V.N. Organization and functioning of the neuroendocrine system. Problemyendokrinologii. 2013; 59 (1):62-69. (In Russ) DOI: 10.14341/probl201359162-69.
3. Matkina O.V. Pathohistological changes in the thymus and spleen of noninbred white rats under acute stress. Permskiimeditsinskiizhurnal. 2014; 31 (1):121-128. (In Russ).
4. Vovkogon A.D. Changes in lymphoid tissue and spleen mass in conditions of water consumption with different content of microorganisms. Morfologiya. 1997; 112(6): 50-53. (In Russ).
5. Tsyrenova D.Z., Gulyaev S.M., Khobrakova V.B. Effect of Phlomoides tuberose [L] Moench extract on spleen structure of mice with immunosuppression. Obzorypoklinichesk oifarmakologii I lekarstvennoiterapii. 2017; 15 (1):53-57. (In Russ) DOI: 10.17816/RCF15153-57.
6. Yarilin A.A. Aging of the immune system and thymus. Klinicheskayagerontologiya. 2003;(3):8-17. (In Russ).
7. Barkova E.N., Shatilovich L.N., Kashuba E.A. Seasonal features of circadian rhythms of leukocyte content in peripheral blood in Wistar rats. Byulleten' eksperimental'noibiologii. 1992;63(3):306-308. (In Russ).
8. Birte S. Human spleen microanatomy: why mice do not suffice. Immunology. 2015;145(3):334-346. DOI: 10.1111/imm.12469.
9. Dammers PM, Visser A, Popa ER, Nieuwenhuis P, Kroese FG. Most marginal zone B cells in rat express germline encoded Ig VH genes and are ligand selected. J.Immunol. 2000;165:6156-69. DOI: 10.4049/jimmunol. 165.11.6156.
10. Katakai T. Marginal reticular cells: a stromal subset directly descended from the lymphoid tissue organizer. Frontiers in Immunology. 2012;3. DOI: 10.3389/fimmu.2012.00200.
11. ReznikE.Yu., RodnichenkoA.E., Vasil'evR.G., LabunetsI.F. The influence of thymectomy on the immune response in mice of the lines CBA/CA. 66-ya Vserossiiskayanauchno-prakticheskayakonferentsiyamolodykhucheny khistudentov «aktual'nye voprosy sovremennoi meditsinskoi nauki i zdravookhraneniya» UGMA. Aprel' 2011. Dostupnopo:http:// nomus.ucoz.net/index/0-2. (In Russ).
