CC BY
51
Лечение и профилактика
УДК 619:616.995.122.21:1-085
МОРФОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЯИЦ Fasciola hepatica ДО И ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ТРИКЛАБЕНДАЗОЛА И ТЕГАЛИДА
О.И. БИБИК кандидат биологических наук
Т.А. ШТЕРНИС кандидат медицинских наук
Кемеровская государственная медицинская академия, 650029, Кемеровская область, г. Кемерово, ул. Ворошилова, д. 22а, e-mail: kemsma@kemsma.ru
Изучено действие триклабендазола в дозе 10 мг/кг и тегалида в дозе 30 мг/кг на размеры яиц Fasciola Нг-райеа и их содержимое. Установлено, что препараты вызывают изменения размеров яиц трематод и мор-фофункциональную дезорганизацию их содержимого в организме паразита, что приводит к нарушению их жизнеспособности и прекращению паразитом яйце-продукции.
Ключевые слова: яйца, РаэсЫа ЬераНса, морфомет-рия, триклабендазол, тегалид.
Фасциолез, вызываемый Fasciola hepatica и F. gigantica, у сельскохозяйственных животных является одним из экономически значимых гельминто-зов [2, 10]. В РФ ежегодно теряется по причине фасциолеза 1500-2500 т мясной продукции и 2-4 млн т молока.
В последнее время часто встречаются случаи заражения фасциолезом человека, что представляет большую опасность для его здоровья и является актуальной проблемой здравоохранения всех стран [7-9, 11, 16-18]. Согласно официальным статистическим данным Минздрава России, за последние 10 лет заболеваемость людей фасциолезом возросла более чем в 10 раз. Однако это не отражает истинной эпидемиологической ситуации по фасциолезу в стране [15].
Наиболее действенным методом борьбы с паразитарными болезнями животных и человека в настоящее время является химиотерапия с использованием высокоэффективных антигельминтиков широкого спектра действия, максимально безопасных для организма и относительно безвредных для окружающей среды [3]. Лечение фасциолеза человека эффективно триклабенда-золом [14] и тегалидом [12].
Триклабендазол, 5-хлор-6-(2,3-дихлорфенокси)-2-метилтиобензимидазол (рис. 1), был открыт и введен в ветеринарную практику (под названием фази-иекс) фирмой Сиба-Гейги (Швейцария) в 1983 г.
Рис. 1. Химическая формула триклабендазола
Тегалид, К-[(3-[хлорбензоил)-4-хлорфенил]-2-гидрокси-3,5-дибромбен-замид (рис. 2), разработан в ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского [13].
п
В\/>Н /''-^ОЬС!
р-гг®-"
Вг ОН
Рис. 2. Химическая формула тегалида
Целью нашей работы был анализ влияния антигельминтиков триклабен-дазола и тегалида на яйцепродукцию Е. кераНеа у спонтанно инвазированных овец с использованием метода морфометрического анализа яиц паразита.
Материалы и методы
Объектом исследования служили трематоды Е. кераНеа, взятые из печени спонтанно инвазированных овец после воздействия на организм хозяина триклабендазола в дозе 10 мг/кг и тегалида в дозе 30 мг/кг. Животные контрольной группы антигельминтик не получали. Паразитов фиксировали в растворе метилового спирта и ледяной уксусной кислоты в разведении 3 : 1, а затем в 70%-ном спирте.
Материал обрабатывали по общепринятой гистологической методике и заливали в парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм готовили из половозрелых Е. кера^еа, окрашивали гематоксилином и эозином. Измерения яиц трематод проводили на гистологических препаратах в световом микроскопе «Микмед-6», используя окуляр-микрометр ТТТИО-8
Для оценки эффективности воздействия антигельминтиков использовали морфометрический анализ яиц трематод [5]. Метод морфометрии со статистическим анализом включал следующие этапы:
1. На гистологических препаратах фасциол, окрашенных гематоксилином и эозином, измеряли в миллиметрах с помощью окуляр-микрометра в световом микроскопе в норме и после воздействия препарата общие размеры 50 яиц трематод и размеры их содержимого по большому (Б) и малому (ф диаметрам (рис. 3, 4).
Рис. 3. Яйцо Fasciola кераиеа (увел. ок. 10 х об. 10, окраска гематоксилином и эозином): Б - большой диаметр яйца; d - малый диаметр яйца
Рис. 4. Измерение окуляр-микрометром большого (А) и малого (Б) диаметров яиц Е. Ивра^са и их содержимого (увел. ок. 7 х об. 10, окраска гематоксилином и эозином)
2. Объемы яиц (Уя) и их содержимого (Ус) рассчитывали по формуле объема эллипсоида
п
У = --- ■ D ■ d2,
6
где D - большой диаметр, d - малый диаметр.
Статистический анализ данных выполнен с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.1 и Microsoft office Excel 2007.
Описание количественных признаков проводили с использованием средних величин (М) и их ошибок (m).
Для сопоставления двух зависимых выборок по количественным признакам (параметрам морфометрии), которые не являются нормально распределенными, использовали непараметрический критерий Вилкоксона (Т) для парных сравнений. Критическое значение уровня статистической значимости при проверке Но принимали равным 0,05. В случае превышения достигнутого уровня значимости статистического критерия гипотеза (Но) об отсутствии различий групп по изучаемому признаку принималась; при достижении уровня значимости статистического критерия менее 0,05 принималась альтернативная гипотеза (Н1) о существовании различий групп по изучаемому признаку. Достигнутые в исследовании значения уровня статистической значимости для критерия Т = 0,0000000-302,0 составили 0,000000-0,002164.
Результаты и обсуждение
Исследование гистологических препаратов из фасциол показали, что яйца, находящиеся в матке трематод, имеют разные стадии развития. В проксимальных отделах матки происходит дробление оплодотворенной яйцеклетки и начальное образование скорлуповой оболочки яиц. В средних отделах матки трематод яйца содержат развивающийся зародыш и имеют не до конца оформленную яйцевую оболочку. В дистальных отделах матки яйца фасциол уже со скорлуповой оболочкой желтого цвета, но содержат еще несформиро-ванный зародыш, готовый к развитию в окружающей среде.
На каждой стадии развития яйца имеют разные размеры, форму, содержимое и соотношение между их общими размерами и внутренним содержимым. Композиция содержимого в процессе формирования яиц меняется и для каждого вида существует строгая специфичность каждой стадии развития.
Любое отклонение в морфофункциональных показателях формирования яиц представляет патологию, блокирующую развитие яиц трематод, что особенно наглядно обнаруживается после воздействия антигельминтика при применении морфометрических методов исследования [5].
На основании собственных исследований патоморфологии яиц трематод, взятых после воздействия антигельминтиков, установлены параметры мор-фофункциональных изменений с отклонениями от нормы, которые выражались в частичном или полном разрушении яиц и нарушении яйцепродукции паразита. Внешне наблюдаемая сохранность яиц при их углубленном микроскопическом изучении не подтверждается, так как выявляется четкое нарушение их общих размеров и объема содержимого яиц.
Данные статистического анализа показывают объективные изменения яиц фасциол после воздействия триклабендазола и тегалида. После воздействия тегалида большой диаметр яиц (Дя) трематод по отношению к норме (8,58±0,035)-10-3 мм изменился (8,71±0,012)-10"3 мм; (Т = 78,0; Р = 0,000002). Изменения большого диаметра яиц фасциол после воздействия триклабендазола оказались статистически незначимыми (8,62±0,024)-10-3 мм (Т = 451; Р = 0,123). Изменился малый диаметр яиц (йя) при сравнении с контролем (4,32±0,092)-10-3 мм, после применения как триклабендазола (4,51±0,012)-10-3 мм (Т = 24; Р = 0,000318), так и тегалида (3,64±0,016)-10-3 мм (Т = 0,00; Р = 0,0000; табл. 1).
При применении антигельминтных препаратов статистически значимо изменялись большой и малый диаметры содержимого яиц фасциол как после воздействия триклабендазола, так и тегалида. В норме большой диаметр содержимого яиц трематод имеет размеры (7,44±0,039)-10-3 мм, а размеры малого диаметра содержимого яиц составляют (3,77±0,102)-10-3 мм, когда после триклабендазола размеры диаметров достигали (7,67±0,020)-10-3 мм (Т = 178,50; Р = 0,000045) и (4,19±0,008)-10"3 мм (Т = 48,0; Р = 0,0000) соответственно. Тегалид вызывал изменение большого и малого диаметров содержимого яиц фасциол: (7,58±0,011)-10"3мм (Т = 302; Р = 0,0020) и (2,93±0,024)-10"3 мм (Т = 0,0; Р = 0,0000) соответственно.
Выявлены объективные изменения объемов как яиц фасциол, так и их содержимого. После воздействия триклабендазола обнаружены изменения в сторону увеличения общих объемов яиц (Уя) трематод (9,15±0,06)-10-8 мм3 (Т = 289; Р = 0,002) и объемов их содержимого (Ус) (6 98±0,04)-10-8 мм3 (Т = 2; Р = 0,0000) по отношению к норме: (8,11±0,171)-10"8 и (5,3±0,124)-10"8 мм3 соответственно. Изменение объемов яиц после антигельминтика свидетельствует о проницаемости скорлуповой оболочки и набухании содержимого яиц фасциол. Соотношение между общим объемом яиц трематод и объемом их содержимого уменьшается 1 : 0,77 (Т = 1; Р = 0,0000), при сравнении с нормой 1 : 0,65, что указывает на патологические процессы в матке, вызванные триклабендазолом, а, именно, дегенерацию яиц паразита, развития которых не происходит.
Статистический анализ показал что, после воздействия тегалида изменения происходят в сторону уменьшения общих объемов яиц (6,02±0,06)-10-8 мм3 (Т = 4; Р = 0,0000) и объемов их содержимого (3,40±0,06) -10"8 мм3 (Т = 1; Р = 0,0000) по отношению к норме: (8,11±0,171)-10"8 и (5,3±0,124)-10"8 мм3 соответственно. Статистически значимые изменения объемов яиц фасциол и их содержимого в сторону их уменьшения свидетельствует о проницаемости скорлуповой оболочки яиц, возрастании в них некротических процессов и торможении их развития. Соотношение между объемами яиц и их содержимым увеличивается 1 : 0,56 (Т = 38,5; Р = 0,0000) по отношению к норме 1 : 0,65. Изменение соотношения между объемом содержимого яиц фасциол и их общим объемом в сторону его увеличения свидетельствует о патологических процессах в матке, вызванных тегалидом. Уменьшение объемов показывает, что формирование яиц и эмбриональное развитие в них полностью отсутствует.
1. Статистический анализ морфометрических параметров яиц Fasciola кераИса, находящихся на стадии _развития в дистальных отделах матки фасциол, в норме и после действия антигельминтиков_
Параметры морфометрии До антигельминтика После действия антигельминтиков
триклабендазола Т-критерий, уровень Р тегалида Т-критерий, уровень Р
Большой диаметр яйца, мм (8,58±0,035)-10-3 (8,62±0,024)-10-3 227,0 0,000615 (8,71±0,012)-10-3 78,0 0,000002
Малый диаметр яйца, мм (4,32±0,092)-10-3 (4,51±0,012)-10-3 24,0 0,000318 (3,64±0,016)-10-3 0,0000 0,000000
Большой диаметр содержимого яйца, мм (7,44±0,039)-10-3 (7,67±0,020)-10-3 178,5 0,000045 (7,58±0,0П)-10-3 302,0 0,002011
Малый диаметр содержимого яйца, мм (3,77±0Д02)-10-3 (4,19±0,008)-10-3 48,0 0,000000 (2,93±0,024)-10-3 0,0000 0,000000
Общий объем яйца, мм3 (8,П±0Д71)-10-8 (9,15±0,06)-10-8 289,0 0,002164 (6,02±0,06)-10-8 4,0 0,000000
Объем содержимого яйца, мм3 (5,30±0,125)-10-8 (6,98±0,04)-10-8 2,0 0,000000 (3,40±0,06)-10-8 1,0 0,000000
Соотношение общего объема « 3 яйца к его содержимому, мм (0,65±0,002)-10-8 (0,77±0,004)-10-8 1,0 0,000000 (0,56±0,008)-10-8 38,50 0,000000
Таким образом, морфометрический анализ яиц трематод в процессе их развития в матке паразита дает возможность получить дополнительные данные о воздействии антигельминтиков и позволяет максимально оценить патологию, вызванную препаратом. Триклабендазол и тегалид вызывают мик-роморфофункциональные изменения яиц трематод и их содержимого в организме паразита. Сравнительный анализ морфометрических исследований яиц фасциол, находящихся в конечных отделах матки, в норме и после химиотер-пии триклабендазолом в дозе 10 мг/кг и тегалидом в дозе 30 мг/кг подтвердил данные патоморфологии о трематодоцидных возможностях препаратов, которые следует расценивать как эффективные антигельминтики против яице-продукции фасциол.
Литература
1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. - М., 1990. - 384 с.
2. Алексеева Н. Фасциолезы сельскохозяйственных животных // Ветеринария. - 2008. - № 6. - С. 15-18.
3. Архипов И.А. Химиотерапия гельминтозов животных: успехи, проблемы, перспективы // Матер. конф. «Основные достижения и перспективы развития паразитологии». - М., 2004. - С. 30-31.
4. Бибик О.И., Начева Л.В. Патоморфологическая оценка эффективности действия триклабендазола на органы и ткани фасциолы печеночной // Медицина в Кузбассе. - Кемерово, 2007. - № 3. - С. 19-22.
5. Бибик О.И., Начева Л.В Методические рекомендации по выявлению трематодоцидной эффективности антигельминтных средств методом морфо-метрического анализа яиц трематод после действия препарата // Рос. парази-тол. журнал. - 2009. - № 1. - С. 102-106.
6. Бибик О.И., Начева Л.В. Паразитарные болезни, распространенные на территории Кузбасса (меры борьбы и профилактики). - Кемерово, 2010. - 63 с.
7. Вильявисенсио А. К вопросу механизма передачи фасциолеза у человека // Матер. докл. науч. конф. Всерос. о-ва гельминтол. РАН «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - М., 2005. - Вып. 6. - С. 76-79.
8. Горегляд Н.С., Ключарева А.А., Астанов А.А. и др. Случай фасциолеза у ребенка // Тр. науч. конф. «Современные проблемы общей, медицинской и ветеринарной паразитологии». - Витебск, 2004. - С. 171-173.
9. Горохов В.В., Сергиев В.П., Успенский А.В. и др. Фасциолез у человека в Южной Америке // Мед. паразитол. и паразит. бол. - 2005. - № 3. - С. 55-58.
10. Ендоренко П. Эпизоотология фасциолеза // Ветеринария. - 2008. - № 6. - С. 18-22.
11. Зиракишвили Л.М., Поцхверия Ш.О. Некоторые вопросы эпидемиологии и эпизоотологии фасциолеза в Грузии // Рос. паразитол. журнал. - 2009. -№ 1. - С. 38-42.
12. Лебедева М.Н., Михайлицын Ф.С., Цизин Ю.С. и др. Успехи в поиске и создании отечественных противогельминтных средств // Мед. паразитол. и паразит. бол. - 1990. - № 4. - С. 30-33.
13. Михайлицын Ф.С., Петров Ю.Ф., Абалихин Б.Г. и др. Технология производства противопаразитарных препаратов. Разработка технологии получения антигельминтика тегалида в мелкодисперсной форме и оценка его противофасциолезной и противодикроцелиозной активности // Мед. парази-тол. и паразит. бол. - 1994. - № 1. - С. 54-56.
14. Молчанов И.А., Сорокина Н.П., Фабиан А. и др. Фасциолез как серьезный зооантропоноз // Вет. патол. - 2004. - № 4 (11). - С. 97-102.
15. Рыжакина Т.П. Эпизоотологический анализ фасциолезной инвазии в условиях Европейского севера России: Автореф. дис. ... канд. вет. наук. -Санкт-Петербург, 2007. - 17 с.
16. Сорокина Н.П., Москвин А.С., Горохов В.В. Фасциолез человека, вызываемый Fasciola hepatica // Мед. паразитол. и паразит. бол. - 2003. - № 1. -С.37-39.
17. Jensenius M., Flaegstad T., Stenstad T. et al. Fascioliasis imported to Norway // Scand. J. Infec. Dis. - 2005. - V. 37, № 6-7. - Р. 534-537.
18. Mailles A., Capek I., Ajana F. et al. Commercial watercress as an emerging source of fascioliasis in Northern France in 2002: Results from an outbreak investigation // Epidemiol. and Infec. - 2006. - V. 134, № 5. - P. 942-945.
Morphometric analysis of Fasciola hepatica eggs before and after triclabendazole and tegalid influence
O.I. Bibik, T.A. Shternis
Influence of triclabendazole in a doze of 10 mg/kg and tegalid in a doze of 30 mg/kg on the sizes of Fasciola hepatica eggs and their contents is investigated. It is established that drugs cause changes the sizes of trematodes eggs and morphofunc-tional disorganization of their contents in parasite that results in infringement of their viability and termination by production of eggs.
Keywords: eggs, Fasciola hepatica, morphometry, triclabendazole, tegalid.
