CC BY
275
Am 7universum.com
UNIVERSUM:
МЕДИЦИНА И ФАРМАКОЛОГИЯ
МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ГЕПАТОЦИТОВ БЕЛЫХ КРЫС И ЧЕЛОВЕКА ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ЦИРРОЗЕ ПЕЧЕНИ
Лебедева Елена Ивановна
аспирант кафедры гистологии, УО «Витебский государственный медицинский университет»,
Республика Беларусь, г. Витебск E-mail: lebedeva.ya-elenale20J3@vandex.ru
MORPHOMETRIC INDICATORS OF HEPATOCYTES OF WHITE RATS AND A HUMAN IN TOXIC HEPATIC CIRRHOSIS
Elena Lebedeva
post-graduate student of Histology Chair, Educational Institution “Vitebsk State Order of Peoples ’ Friendship Medical University ",
Republic of Belarus, Vitebsk
АННОТАЦИЯ
Результаты исследования показали, что регенерация гепатоцитов печени подопытных животных происходит преимущественно за счет гипертрофии гепатоцитов, а у пациентов — за счет увеличения количества двуядерных гепатоцитов. У пациентов на стадии гепатоза и гепатита количество гликогена увеличивается по сравнению с относительной нормой, а у животных этот показатель уровня контроля не достигает на протяжении всего эксперимента.
ABSTRACT
Research results have shown that the regeneration of hepatocytes of experimental animals occurs mainly due to hypertrophy of hepatocytes, and by increasing the number of dual-core hepatocytes in patients. The amount of glycogen increases in comparison with the relative standard in patients at the stage
Лебедева Е.И. Морфометрические показатели гепатоцитов белых крыс и человека
при токсическом циррозе печени // Universum: Медицина и фармакология : электрон. научн.
журн. 2015. № 7-8 (19) . URL: http://7universum.com/ru/med/archive/item/2547
of hepatosis and hepatitis and in animals this indicator does not reach the level of control throughout the experiment.
Ключевые слова: печень, цирроз, морфометрические показатели.
Keywords: hepar, cirrhosis, morphometric indicators.
Введение. Циррозы печени различной этиологии — широко распространенные и крайне опасные для жизни человека хронические заболевания, число которых во многих странах постоянно растет. Цирроз печени характеризуется разрастанием соединительной ткани, перестройкой сосудистого русла паренхимы, гибелью значительной части гепатоцитов и целым рядом других изменений, ведущих к потере дольковой структуры органа [1, с. 45]. Несмотря на определенные успехи в понимании патогенеза и терапии этого заболевания, необходимо отметить, что они не в полном объеме изучены, а порой представлены противоречивые сведения о степени повреждения и значении нарушений энергетического обмена при токсическом поражении печени [2, с. 228—229]. Малочисленны сведения о динамике морфометрических показателей гепатоцитов при данной патологии. Немногочисленны и неполны литературные данные сравнительного плана об особенностях морфологии печени при токсическом циррозе у человека и у белых крыс, используемых в качестве экспериментальных животных.
Целью исследования являлось изучение морфометрических показателей гепатоцитов белых крыс и человека при токсическом циррозе печени.
Материалы и методы. Работа выполнена на секционном материале и материале прижизненных пункционных биопсий печени пациентов с клинико-лабораторными и морфологическими признаками хронической гепатопатии, полученном в УЗ «Витебская областная клиническая больница» и УЗ «Витебское областное клиническое патологоанатомическое бюро». Критериями отбора пациентов в группу злоупотребляющих алкоголем являлись указание в анамнезе на регулярное употребление ими спиртных напитков
и данных клинических и биохимических исследований. В качестве контроля использовали материл печени относительно здоровых людей (биоптаты печени лиц, направленных военкоматами для исключения патологии, и лиц, умерших от причин, непосредственно не связанных с патологией печени), в котором отсутствовали морфологические, клинические и биохимические признаки поражения печени. На выполнение данных исследований получено разрешение комитета по этике клинических испытаний УО «Витебский государственный медицинский университет» (протокол № 4 от 09.01.2013). Пациенты были разделены на 4 группы: 1-я — относительная норма (n=10, 6 мужчин
и 5 женщин); 2-я — пациенты с алкогольным стеатозом (n=12, 7 мужчин
и 5 женщин); 3-я — пациенты с алкогольным гепатитом (n=12, 6 мужчин
и 6 женщин); 4-я — пациенты с алкогольным циррозом (n=15, 5 мужчин
и 10 женщин). Всего исследован материал от 24 мужчин и 26 женщин
в возрасте от 22 до 65 лет.
Кроме того, был изучен материал печени от белых крыс в условиях нормы и в динамике развития токсического цирроза. На проведение экспериментального исследования было получено разрешение комитета по этике при УО «Витебский государственный медицинский университет». Содержание животных, выполнение различных процедур и вывод из опыта осуществлялись в соответствии с требованиями: Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18.03.1986, ETS № 123); «Правил лабораторной практики РБ» (приложение к приказу Министерства здравоохранения Республики Беларусь № 31 от 31.10.2006); требований СанПиН 2.12.12-18.2006 «Устройство, оборудование и содержание экспериментально-биологических клиник (вивариев), утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь № 131 от 31.10.2006».
Эксперимент проводился в осенне-зимний период 2013—2014 гг. В опытах использовали белых крыс одного возраста, прошедших карантинный режим вивария и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. Животные
были разделены на группы: 6 опытных (n=12 в каждой группе, по 6 самцов и 6 самок) и контрольную (n=24, 12 самцов и 12 самок). Модель токсического цирроза печени создавали путем длительного интрагастрального введения с помощью зонда 40 %-го масляного раствора четыреххлористого углерода (CCL4) в дозе 0,2 мл/100 г массы животного 2 раза в неделю в утренние часы за 4 ч до кормления. Параллельно с этим вместо воды в качестве питья крысы получали 5 %-й раствор этанола из поилок в режиме свободного доступа в течение 19 недель. Контрольные (плацебо) животные получали эквиобъемное количество растворителя CCL4 (оливковое масло) и в качестве питья использовали кипяченую воду из поилок в режиме свободного доступа. Для изучения динамики метаболических изменений опытных животных выводили из эксперимента в разные сроки (через 3, 6, 9, 12, 16, 19 недель) от начала опыта, который длился 19 недель, путем декапитации с применением гильотины после их 14-часового голодания, в утренние часы, согласно утвержденным инструкциям и законодательным актам.
Для морфологических исследований использовали следующие методы:
1. Общегистологические. Окраска гематоксилином и эозином [3, с. 191—
192].
2. Гистохимические. Гликоген выявляли по методу Шабадаша (контроль с амилазой слюны в термостате при температуре 37 0С в течение 30 мин) [9, с. 219—224].
3. Специальный метод окрашивания соединительной ткани метод Маллори [3, с. 199—200].
Для морфометрического анализа данных использовали компьютерные программы анализа изображений Image Scope Color и cellSens Standard (Россия). С этой целью производили микрофотосъемку случайных полей зрения гистологических препаратов цифровой камерой OLYMPUS XC30 на базе микроскопа OLYMPUS BX51 (Япония) при увеличении *100, *200, *400, *600, *1000 (не менее 10 полей зрения в каждом гистологическом срезе).
Определяли среднюю площадь гепатоцитов и их ядер в мкм2. Для измерения площади использовали пункт меню «Ручное выделение объектов». Для обведения контуров гепатоцитов и ядер применяли инструмент «Замкнутый многоугольник», который позволяет наносить на изображения линии, не имеющие резких изломов и, следовательно, свести погрешность измерений к минимуму. Путем определения разности между средней площадью гепатоцитов и средней площадью ядер получали площадь цитоплазмы клеток, после чего вычисляли ядерно-цитоплазматическое соотношение. Цитоморфометрию проводили при увеличении *600. При увеличении *200 проводили подсчет двуядерных гепатоцитов.
В настоящем исследовании для морфометрической оценки содержания гликогена использовали показатели компьютеризированных морфометрических измерений. Программа автоматически высчитывает площадь, занимаемую гликогеном, в процентах к общей площади среза.
Степень фиброзных изменений печени оценивали с использованием индекса гистологической активности (ИГА) по R.G. Knodell и соавт. (1981) [6, с. 165—166].
Статистическую обработку данных проводили с помощью лицензионной компьютерной программы Statistica 10.0 Advanced (русская версия). Статистический анализ осуществлялся в несколько этапов:
1. Получение описательных статистик и описание количественных экспериментальных данных в виде средних и их соответствующих доверительных интервалов (М (95 % ДИ: j-q)), медианы и значения 15-го—85-го процентиля (Ме (15 %; 85 %)) [8, с. 72—92].
2. Так как размер групп не превышал 50 особей, анализ соответствия частотного распределения признака нормальному закону частотного распределения (распределению Гаусса) осуществлялся по критерию Шапиро-Уилка, данные которого также соответствовали результатам критерия Лиллиефорса [8, с. 60—69].
3. Изучение зависимости ряда исследуемых признаков от факторов (недели
эксперимента и пола у животных, стадии алкогольной болезни печени и пола у пациентов) проводили с помощью параметрического двухфакторного дисперсионного анализа [7, с. 55—63]. По значимости факторов
дисперсионного анализа (SSфакт — факторная сумма квадратов отклонений, ЗБобщ — общая сумма квадратов отклонений) определяли их степень влияния на результативный показатель путем расчета выборочного коэффициента детерминации (р2), показывающего, какая доля общей вариации признака объясняется влиянием исследуемого фактора [4, с. 98—106].
4. О значимости различий изучаемых признаков в отдельных группах при нормальном частотном распределении данных о достоверности различий судили по t-критерию Стьюдента; в случае отличия от нормального частотного распределения выборок использовали U-критерий Манна-Уитни — наиболее чувствительную непараметрическую альтернативу t-критерию для независимых выборок [8, с. 101-109].
Результаты и обсуждение. Результаты настоящего исследования показали, что у пациентов 3-й группы (пациенты с алкогольным гепатитом) было выявлено достоверное снижение площади гепатоцитов (в 1,11 раза р=0,000) и ядер (в 1,06 раза р=0,016) как у мужчин, так и у женщин, по сравнению с группой контроля. При циррозе (4-я группа) наблюдалось достоверное их увеличение по сравнению с 3-й группой, которое достигало уровня показателя контрольной группы. На гистологических препаратах биоптатов при циррозе встречались набухшие гепатоциты, а на препаратах из секционного материала такие клетки встречались редко.
У белых крыс морфометрически установлено достоверное увеличение средней площади гепатоцитов и ядер на всех этапах эксперимента по сравнению с группой контроля (как у самцов, так и у самок). Максимального уровня эти показатели достигали через 12 недель эксперимента, когда у животных был смоделирован цирроз печени. Средняя площадь гепатоцитов и ядер на данном этапе была увеличена у самцов в 1,44 (р=0,000) и 1,36
(р=0,000) раза, а у самок в 1,86 (р=0,000) и 1,53 (р=0,000) раза соответственно по сравнению с контрольной группой. На гистологических препаратах печени животных в гепатоцитах четко выделялись разного размера ядра: уменьшенного, среднего, крупного и гигантского (рис. 1).
Рисунок 1. Срез печени животных через 9 недель эксперимента. Окраска гематоксилином и эозином. х600
Выборочный коэффициент детерминации для средней площади гепатоцитов у пациентов был равен 5,36 % (р=0,000), а для средней площади ядер — 3,88 % (р=0,006). При этом эти показатели у белых крыс были равны 44,75 % (р=0,000) и 43,22 % (р=0,000) соответственно.
Изучение ядерно-цитоплазматического соотношения у пациентов выявило отличия между 1-й и 4-й (р=0,026) группами пациентов как у мужчин, так и у женщин. Данные показатели были равны для мужчин 0,13 (0,12;0,16) и 0,14 (0,11 ;0,17), а для женщин — 0,13 (0,11;0,16) и 0,14 (0,12;0,18) соответственно. Соотношение между площадью ядра и цитоплазмы у пациентов 4 -й группы (пациенты с алкогольным циррозом) сдвигалось в сторону достоверного уменьшения части цитоплазмы. Выборочный коэффициент детерминации составил 3,76 % (р=0,007).
На фоне гипертрофии клеток и ядер у белых крыс выявлено статистически достоверное практически одинаковое (в 1,20 р=0,000) снижение ядерноцитоплазматического соотношения на всех этапах эксперимента по сравнению
с группой контроля (как у самцов, так и у самок). Выборочный коэффициент детерминации был равен 16,78 % (р=0,000).
Анализ гистологических препаратов показал, что количество двуядерных гепатоцитов было ниже у 3-й группы пациентов (в 1,20 раза р=0,000), и выше у 2-й (в 1,14 раза р=0,000) и 4-й (в 1,60 раза р=0,000, рис. 2) групп по сравнению с контрольной как у мужчин, так и у женщин. Выборочный коэффициент детерминации составил 56,73 % (р=0,000).
Рисунок 2. Срез печени пациентов при алкогольном циррозе (биопсийный материал). Окраска гематоксилином и эозином. х600
У белых крыс количество двуядерных гепатоцитов через 3 и 6 недель эксперимента было ниже в 2,00 раза (р=0,000), а на последующих этапах в 3,00 раза (р=0,000) по сравнению с группой контроля (как у самцов, так и у самок). Выборочный коэффициент детерминации составил 58,08 % (р=0,000).
По мнению А.Д. Захараш [5, с. 65] цитоморфометрическое исследование дополняет качественную характеристику гепатоцитов, представляет более объективную и полноценную информацию о процессах, которые имеют место в гепатоцитах при алкогольном поражении печени и могут быть использованы в диагностике и прогнозировании протекания и исхода возникших патологических состояний.
Изучение гистохимического содержания гликогена при данной патологии показало, что у пациентов 2-й (в 1,33 раза р=0,000, рис. 3а) и 3-й (в 1,41 раза р=0,000) групп этот показатель был выше, а у пациентов 4-й (в 1,19 раза р=0,000, рис. 3б) группы ниже по сравнению с группой контроля как у мужчин, так и у женщин.
Рисунок 3. Срезы печени пациентов (биопсийный материал). Обозначения: а — при алкогольном гепатозе, б — при алкогольном циррозе. Гликоген окрашен в фиолетовый цвет. Окраска по методу
Шабадаша. х400
У белых крыс через 3 нед. эксперимента наблюдалось резкое снижение содержания гликогена (у самцов в 15,00 раз р=0,000, а у самок в 14,22 р=0,000) по сравнению с группой контроля (рис. 4).
Рисунок 4. Срезы печени белых крыс (самцы). Окраска по методу Шабадаша. Гликоген окрашен в фиолетовый цвет. Обозначения: а — через 3 недели эксперимента х400, б — контрольных хб00
Через 6 нед. (у самцов в 1,50 раза р=0,000, а у самок в 4,44 р=0,000), 9 нед. (у самцов в 7,37 раза р=0,000, а у самок в 6,77 р=0,000) выявлено его достоверное увеличение по сравнению с показателями 3 нед., но уровня контроля эти показатели не достигали. Выборочный коэффициент детерминации для пациентов составил 69,87 % (р=0,000), а для белых крыс — 84,92 % (р=0,000).
Выводы. Таким образом, регенерация гепатоцитов печени подопытных животных происходит преимущественно за счет гипертрофии гепатоцитов (надо полагать, происходит гиперплазия и гипертрофия органелл), а у пациентов — за счет увеличения количества двуядерных гепатоцитов и, в конечном счете, опять-таки гипертрофии. Выборочный коэффициент детерминации показывает, что степень влияния фактора токсического поражения печени на площадь гепатоцитов, на площадь ядер и ядерноцитоплазматическое соотношение у пациентов незначительная.
Степень влияния фактора на количество двуядерных гепатоцитов у пациентов и животных практически одинаковая, но имеет разное направление. У пациентов она направлена на увеличение количества этих клеток, а у животных — на снижение.
У пациентов на стадии гепатоза и гепатита количество гликогена увеличивается по сравнению с относительной нормой, а у животных этот показатель уровня контроля не достигает на протяжении всего эксперимента. Степень влияния фактора на количество гликогена более выражена у животных.
Список литературы:
1. Арутюнян И.В. Моделирование цирроза печени на лабораторных животных // Клиническая и экспериментальная морфология. — 2012. — № 2. — С. 45—50.
2. Безбородкина Н.Н. Морфометрия митохондриального аппарата гепатоцитов нормальной и цирротически измененной печени крыс // Цитология. — 2008. — Т. 50, — № 3. — С. 228—235.
3. Елисеев В.Г. Основы гистологии и гистологической техники. — М.: Медицина, 1967. — 267 с.
4. Есько О.И. Основы статистической обработки информации. — Минск: Беларусь, 2011. — 175 с.
5. Захараш А.Д. Компьютерная морфометрия в диагностике хронического гепатита // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол, колопроктол. — 2005. — Т. XV, — № 1. — С. 65.
6. Комарова Д.В., Цинзерлинг В.А. Морфологическая диагностика инфекционных поражений печени: практическое руководство. — СПб.: Сотис, 1999. — 244 с.
7. Океанов А.Е. Применение статистических методов в биомедицинских исследованиях. — М.: Междунар. экол. ун-т, 2011. — 82 с.
8. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. — М.: МедиаСфера, 2003. — 312 с.
9. Роскин Г.И. Микроскопическая техника. — М.: Совет. наука, 1951. — 447 с.
