CC BY
92
© Е. С. Проценко, Н. А. Ремнёва
УДК 616. 36-053. 1-091. 8-02:[618. 3-06:616. 155. 194. 8]
Е. С. Проценко, Н. А. Ремнёва
МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ И МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПЕЧЕНИ ДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ ОТ ЗДОРОВЫХ МАТЕРЕЙ С ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ ПРОТЕКАВШЕЙ БЕРЕМЕННОСТЬЮ
Харьковский национальный университет им В. Н. Каразина (г. Харьков)
Работа выполнена в рамках НИР кафедры патологической анатомии Харьковского национального медицинского университета «Патоморфологические особенности формирования плода и новорожденного под влиянием патологии матери», номер гос. регистрации №0110и001805.
Вступление. Оценка состояния печени в период пренатального развития является одним из важнейших показателей, позволяющих оценить постнатальное состояние плода. Печень является крупным органом, у новорожденного соотношение массы органа и тела соответствует 1/16, орган занимает 2/3 - 1/2 брюшной полости, что свидетельствует о существенном функциональном значении органа на ранних стадиях постнаталь-ного онтогенеза и довольно широком спектре его структурно-функциональных возможностей [2]. В пренатальном развитии печень выполняет два важных гистогенетических процесса - кроветворную дифференцировку и формирование собственно печеночной ткани [3]. Печень становится преобладающим органом кроветворения на 15-й неделе гестации и сохраняет эти функции до конца беременности [6]. Сообщается о значительном усилении функций печени в момент затухания гемопоэза, что, по мнению некоторых авторов, может служить сигналом к «переключению» печени на созревание [8]. На ранних сроках гестации эпителий печени представлен бипотентными гепатобластами, которые впоследствии дифференцируются в ге-патоциты и холангиоциты [9]. Гепатобласты могут идентифицироваться одновременной экспрессией печеночных (цитокератин 18, альбумин) и желчных маркеров (цитокератин 19) [6], а также Е-кадгерина [10]. Предполагается, что функциональная специализация гепатоцитов отсутствует в пренатальный период развития организма и формируется постепенно в течение его постнатального развития [4]. Морфология и фенотип гепатоцитов изменяется в процессе развития и эти изменения коррелируют с кроветворной активностью печени [5, 7]. В отечественной и зарубежной литературе данные, касательно морфометрических параметров компонентов печени доношенных плодов и новорожденных от здоровых матерей в условиях физиологической
беременности, немногочисленны и не выходят за рамки макроскопических исследований.
Цель настоящего исследования - выявить морфометрические и морфофункциональные показатели компонентов печени доношенных новорожденных от здоровых матерей с физиологически протекавшей беременностью.
Объект и методы исследования. Исследования проводились на препаратах печени 10 постна-тально погибших новорожденных (сроком гестации 39-40 недель) от здоровых матерей с физиологически протекавшей беременностью.
Проведенные исследования полностью соответствуют законодательству Украины и отвечают принципам Хельсинкской декларации прав человека, Конвенции Союза Европы относительно прав человека и биомедицины (подтверждено заключением комиссии по биоэтике, протокол №3, 2006 г).
Причиной смерти новорожденных во всех случаях исследования явилась тяжелая родовая черепно-мозговая травма. Продолжительность жизни новорожденных в среднем составила 12,8±8,4 часов. При макроскопическом исследовании биоптатов печени определялись её масса и размеры. Для морфологического исследования из ткани печени вырезались кусочки из трех зон. Кусочки фиксировались в 10% растворе нейтрального формалина. Затем материал подвергался стандартной проводке через спирты увеличивающейся концентрации, жидкость Никифорова (96% спирт и диэтиловый эфир в соотношении 1:1), хлороформ, после чего заливался парафином. Из приготовленных таким образом блоков делались серийные срезы толщиной 4-5 мкм микротоме Мюгот НМ-340. Морфологически печень изучалась с использованием гистологических (гематоксилином и эозином, пикрофуксином по методу ван Гизон, по методу Маллори), гистохимических (метод Браше и Фельгена - Россенбека) окрасок, цитофотометрическим, иммуногистохи-мическими и морфометрическим методами. Каждый исследуемый случай подвергался обзорной микроскопии, при которой оценивался общий характер строения печени, особенности стромаль-ного и паренхиматозного компонентов, наличие или отсутствие очагов кроветворения, наличие или отсутствие вторичных изменений (кровоизлияния,
некроз, воспаление), состояние микроциркулятор-ного русла. Для оценки уровня морфофункциональной активности гепатоцитов на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, использовали следующие морфометрические исследования: определение диаметра ядер (Яс1) окуляр-микрометром и объема ядер (Яу) клеток по формуле:
flv=4/3 nr3, где r - радиус ядра, который равен S ЯС;
2) определение диаметра ядер(КС) окуляр-микрометром и объема (Kv) клеток по формуле:
Kv=4/3 nr3, где r - радиус ядра, который равен S КС;
3) определение объема цитоплазмы (Цу) клеток по формуле:
Цу=Ку - Яv;
4) определение ядерно-цитоплазматического индекса (ЯЦИ) по формуле:
ЯЦИ=Яу/ Цу.
Окраской по Браше оценивали содержание РНП в цитоплазме гепатоцитов. Контролем служил раствор кристаллической рибонуклеазы при температуре 37°С. Методом Фельгена - Россенбека определяли содержание ДНП в ядрах гепатоцитов (контролем служила реакция гидролиза с 10% HCI). Цитофотометрическим методом определяли оптическую плотность содержания ДНП и РНП ядер и цитоплазмы гепатоцитов в зеленой части спектра на срезах, обработанных данными гистохимическими методами. В каждом наблюдении изучалось по 3-5 случайно выбранных поля зрения. Для выяснения взаимоотношений между стромой и паренхимой в печени различных исследуемых групп определялся средний объем паренхимы, ее компонентов и стромы. Из всех существующих морфо- и стереометрических методов оценки удельных и абсолютных объемов различных структурных составляющих органа наиболее объективен, информативен и эффективен метод «полей» [1]. Анализ на плоскостных препаратах проводили следующим образом. На поверхность изображения накладывали сетку с решеткой, имеющей равноудаленные точки (в нашем исследовании использовалась сетка Автандилова из 100 точек) и производили дифференциальный подсчет точек, приходящийся отдельно на каждую структурную составляющую органа. Нужного числа подсчетов точек для получения достоверных данных в 95% доверительном интервале достигали повторными наложениями решетки на различные поля зрения. В данной работе в каждом исследуемом препарате было произведено по три наложения. При этом для оценки кровоснабжения отдельно определялся удельный вес площади, занимаемой сосудами. Комплекс гистологических, морфометрических, стереометрических и цитофотометрических исследований проводился на микроскопе Carl Zeiss Axio Vision Primo Star. Непрямым методом Кунса иммуногисто-химическое исследование проводили на парафиновых срезах, толщиной 5-6 мкм. Для определения степени зрелости и принадлежности лимфоцитов
к той или иной субпопуляции проводили исследование с МКА к CD22, CD3, CD4 и CD8, поверхностные рецепторы к которым они экспрессируют. Апоптоз клеток печени изучали с помощью МКА к CD95. Продукцию иммуноглобулинов, ИЛ-1 Я и компонентов комплемента определяли с помощью МКА к клет-кам-продуцентам ИЛ-1Я, IgM, igG и С3-фракции комплемента. Клетки, которые продуцируют эндо-телин-1, фибронектин, а также структуры, которые содержат коллагены разных типов, также выявляли соответствующими МКА. Фирмой-изготовителем МКА во всех случаях исследований была Novocastra Laboratories Ltd, UK. В качестве люминисцентной метки использовали F (ab)-2 - фрагменты кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши, меченных ФИТЦ (флуоресцеина изотиоцианат). Препараты изучали в люминесцентном микроскопе МЛ-2 с использованием светофильтров: ФС-1-2, СЗС-24, БС-8-2, УФС-6-3. Интенсивность свечения определяли на микрофлюориметре с ФЭУ-35 и обозначали в условных единицах, которые равняется току, проходящего через измерительный прибор в микроамперах (А х 10-6). Непрямым иммуно-пероксидазным методом иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах, толщиной 5-6 мкм. В качестве метки использовался фермент (пероксидаза хрона), который взаимодействует с субстратом, а в качестве красителя фермента - хромоген, который взаимодействует с пероксидазой. В качестве первичных использовались моноклональные антитела к Ki-67 (Dako). Для идентификации тканевых структур срезы дополнительно окрашивали гематоксилином Майера. Для оценки ИПХ реакции с Ki-67, интенсивность окраски оценивалась следующим образом: (-) - негативная реакция (ни одной окрашенной клетки), (+) - слабая реакция (окрашены единичные разбросанные клетки), (++) - умеренная реакция (большое количество интенсивно окрашенных клеток) и (+++) - чрезмерная реакция (интенсивно окрашены практически все клетки).
Весь полученный в результате проведенного морфометрического, стереометрического и цито-фотометрического исследований цифровой массив данных обрабатывался методами математической статистики с использованием вариационного, альтернативного и корреляционного анализов. При использовании методов альтернативной и вариационной статистики вычисляли среднюю арифметическую, степень дисперсии, среднеквадратическое отклонение, среднюю ошибку разницы, вероятность различия. Вероятность различия между двумя средними при малых выборках определяли по таблице Стьюдента с соблюдением условия (n,+n2-2). При определении степени вероятности допускали точность р<0,05, что, как известно, соответствует Р>95,0%.
Результаты исследований и их обсуждение. При макроскопическом исследовании печень имеет тонкую полупрозрачную блестящую капсулу, ткань печени эластичная на ощупь. На разрезе
Рис. 1. Печень доношенного новорожденного.
Нормальная гистоархитектоника паренхимы, равномерная эозинофильная окраска цитоплазмы гепатоцитов, умеренная базофилия их ядер (длинная стрелка). Немногочисленные клетки Купфера в синусоидах (короткая стрелка). Окраска гематоксилином и эозином. Ч 400.
печень красно-коричневого цвета, однородная, печеночные вены развиты правильно, неравномерно полнокровны. Масса печени в среднем составила 140,5±5,12 г, а размеры печени были следующими: правая доля - 5,6±0,1 см, левая доля - 3,3±0,2 см.
Микроскопически в печени гистоархитектоника сохранена, балочно-радиарное строение прослеживается четко. В центральных венах отмечается умеренное полнокровие, синусоиды неравномерно р асширены.
Гепатоциты с эозинофильной зернистой цито-плазмойи округлымба з офильнымядром(рис.1). Диаметрядор гьпытллия ои мистсяил я м, 12±С,06 мкм, объем ядер - 103,15±4,81 мкм3, диаметр клетки (глнитоцита)- 21,1им,03 мкм, гбмсмклетмо (ае-пьторатс)- 1бс,11±Л,4Д мкм3, объем цитоплазмы гепатоцита - 63,66±2,32 мкм3, ЯЦИ - 0,61±0,02. ДНП в ядрах гепатоцитов распределялось диффузно (рис. 2). Показатели оптической плотности
Рис. 2. Печень доношенного новорожденного. Диффузное содержание ДНП в ядрах гепатоцитов(стрелка).Окраска по Фельгену-Россенбеку. Ч 200.
Рис. 3. Печеньдоношенногоноворожденного.
Умеренная экспрессия К1-67гепатоцитами (длинная стрелка) и слабая клетками стромы (короткаястрелка). Непрямой иммунопероксидазный метод с антителами к К1-67. Ч 100.
ДНП ядер и РНП цитоплазмы гепатоцитов составили - 0,3122±0,0033 и 0,1354±0,0022 усл. ед. опт. пл. соответственно. В синусоидах обнаруживаются звездчатые ретикулоэндотелиоциты (ЗРЭ), представленные крупными клетками округлой формы.
Одним из наиболее достоверных иммуномор-фологических маркеров пролиферативной активности клеток является уровень экспрессии ядерного белка К1-67. Интенсивность окрашивания к К1-67 вгепатоцитах оценивалась как умеренная (++), а в клетках стромы - как слабая (+) (рис. 3).
Строма развита умеренно, преимущественно в области портальных трактов и представлена коллагеновыми волокнами (рис. 4). Стромально-парен-химатозные показатели печени были следующими: объем паренхимы - 96,6±0,12 см3, объем стромы с сосудами - 39,0±0,06 см3, стромально-паренхима-тозный коэффициент - 0,40±0,04.
Рис. 4. Печень доношенного новорожденного. Нормальнаягистоархитектоникапаренхимы, умеренное развитие стромы за счет коллагеновых волоконв области портальныхтрактов (стрелка). Окраска по Маллори. Ч 100.
Морфометрические показатели печени и ее компонентов были следующими: объем печени
- 142,5±0,3 см3, абсолютный объем гепатоцитов
- 96,6±0,12 см3, абсолютный объем центральных вен - 18,2±0,06 см3, абсолютный объем синусоидов
- 18,3±0,02 см3, абсолютный объем желчных протоков - 8,4±0,3 см3, абсолютный объем портальных трактов - 2,5±0,03 см3.
По современным представлениям в норме в составе стромального компонента печени имеются иммунные клетки, представляющие собой как клеточное, так и гуморальное звено иммунитета, а также макрофагальную систему. При иммуногисто-химическом исследовании типированы основные клоны иммунных клеток, встречающихся в печени новорожденных, рожденных в результате нормально протекавшей беременности. Чаще всего иммунные клетки располагались в междольковом стромаль-ном компоненте печени, в периваскулярных пространствах, а также в просветах сосудов. При этом степень выраженности иммунной инфильтрации оценивалась как слабая. Среди иммунных клеток обнаружены как Т- так и В-лимфоциты, а также макрофаги. Среди Т-лимфоцитов выявлялись единичные С03, представляющие собой популяцию зрелых Т-лимфоцитов, немногочисленные С04-хелперы и С08-супрессоры. При этом хелперно-супрессор-ное отношение составило 0,418±0,03. Популяция В-лимфоцитов экспрессировала рецепторы к СИ22. Относительные объемы основных клонов иммунных клеток представлены в таблице 1.
Таблица 1
Относительные объемы клонов иммунных клеток в печени плодов и новорожденных
группы контроля (%)
Показатель Контроль(%)
С°3 64,0±3,98
а о 12,2±0,65
С°8 29,2±1,0
Хелперно-супрессорное отношение 0,418±0,03
^22 15,0±0,65
С°68 21,0±0,43
Соотношение С03\С068\СЭ22 4,2:1,4:1,0
Клетки-продуценты ИЛ-1Я 0,9±0,005
Клетки-продуценты !дМ 1,1±0,007
Клетки-продуценты !дй 0,4±0,002
Клетки-продуценты С3-фракции комплемента не выявлялись
С°95 4,0±0,95
В популяции В-лимфоцитов отмечались немногочисленные клетки-продуценты 1дМ, 1дО, при этом, клетки-продуценты С3-фракции компл емен -та не выявлялись. Преобладала популяция кпеток-продуцентов 1дМ. Кроме вышеуказанных клеток отмечались клетки-продуценты интерлейкиноо,
также определялись клетки-продуценты провос-палительного цитокина ИЛ-1 р. Использовав МКА к С095, определен относительный объем апоптозно измененных клеток, экспрессирующих рецепторы к С095. В данном исследовании этот показатель составил 4,0±0,95%.
В стромально-сосудистом компоненте печени выявлены различные типы коллагенов, а также фибронектин. При этом в интерстициальной соединительной ткани, расположенной между дольками, а так же в периваскулярных и перидукталь-ных пространствах выявлялись интерстициальные коллагены III и I типов, с преобладанием молодого коллагена III типа. Оптическая плотность иммунофлюоресценции этих коллагенов представлена в таблице 2.
Таблица 2
Показатели оптической плотности иммуногистохимических реакций в печени плодов группы контроля (усл. ед. опт. пл)
Показатель Контроль (усл. ед. опт. пл)
Опоичес кая плотность коллосецо в і тип 1,056+0,03
Ш тип 1,987±0,02
iVтип 0,876+0,01
Опинпескпы плотность свечения опдотелина-1 1,123+0,03
по я плотность свечения фибронектина 2,002+0,02
С помощью МКА к эндотелину-1 выявлены эндо-теетоциты, способныепкспресеоровать|нецепторы сэодотолину-1. Юеосодае рочени выявляыачьне-равномерное свечение эндотелиальной выстилки (рис. 5).
Рис.5. Печеньдоношенногоноворожденного. Эндотелиоциты,экспрессирующиерецепторык эндотелину-1 (стрелка). Непрямой метод Кунса с МКА кэндотелину-1. Ч 600.
Выводы.
1. Микроскопически в печени гистоархитектоника сохранена, балочно-радиарное строение прослеживается четко. В центральных венах отмечается умеренное полнокровие, синусоиды неравномерно расширены.
2. Показатели оптической плотности ДНП ядер и РНП цитоплазмы гепатоцитов находятся в пределах нормы.
3. Уровень экспрессии ядерного белка КІ-67 оценивался как умеренный, а в клетках стромы - как слабый.
4. Морфометрические показатели печени и ее компонентов соответствовали норме.
5. Основные клоны иммунных клеток в печени новорожденных, рожденных в результате нормально протекавшей беременности, чаще всего располагались в междольковом стромальном компоненте печени, в периваскулярных пространствах, а также в просветах сосудов.
6. В интерстициальной соединительной ткани, а так же в периваскулярных и перидуктальных пространствах обнаружены различные типы коллагенов, а также фибронектин, что свидетельствует об их нормальном расположении.
7. Таким образом, обнаруженные морфологические и морфометрические показатели печени доношенных новорожденных от здоровых матерей с физиологически протекавшей беременностью, соответствуют морфологической картине интрана-тальной асфиксии.
8. Перспективы дальнейших исследований. Полученные нами морфологические и морфометрические данные могут быть использованы в качестве сравнения при изучении патоморфологических особенностей печени плодов и новорожденных от матерей с осложненной беременностью. Перспективным является изучение состояния гепатобили-арной системы плодов и новорожденных от матерей, беременность которых была осложнена ЖДА, преэклампсией и сахарным диабетом.
Литература
1. Автандилов Г. Г. Основы количественной патологической анатомии: учеб. пособие / Г. Г. Автандилов. - М. : Медицина, 2002. -24"С.
2. Нечитайло М. Е. Минимально инвазивная хирургия патологии желчных протоков / М. Е. Нечитайло, В. В. Грубник. -М. - 2005. - 424с.
3. Паюшина О. В. Клеточный состав и регуляторные функции стромы зародышевой печени / О. В. Паюшина, Е. И. До-марацкая, В. И. Старостин // Цитология. - 2012. - Т. 54. - №5. - С. 369-380.
4. Усынин И. Ф. Адаптивная роль функциональной гетерогенности гепатоцитов // Бюллетень СО РАМН. - 2007. - №5 (127). - С. 17-23.
5. Ayres-Silva J. D. P. Sequential morphological characteristics of murine fetal liver hematopoietic microenvironment in Swiss Webster mice / J. D. P. Ayres-Silva, P. P. D. A. Manso, M. R. D. C. Madeira et al // Cell and Tissue Research. - 2011. -Vol. 344. - №. 3. - P. 455-469.
6. Chagraoui J. Fetal liver stroma consists of cells in epithelial-to-mesenchymal transition / J. Chagraoui, A. Lepage-Noll, A. Anjo et al. // Blood. - 2003. - Vol. 101. - №8. - Р 2973-2982.
7. Fukumoto T. Possible developmental interactions of hematopoietic cells and hepatocytes in fetal rat liver / T. Fukumoto // Biomedical Research. - 1992. - Vol. 13. - № 6. - P. 385-413.
8. Guo Y Relationship between hematopoiesis and hepatogenesis in the midtrimester fetal liver characterized by dynamic transcriptomic and proteomic profiles / Y Guo, J. Zhang, Y. Zeng et al // PLoS One. - 2009. - Vol. 4. - №10. - P. 7641.
9. Sasaki K. Histometrical and three-dimensional analyses of liver hematopoiesis in the mouse embryo / K. Sasaki, Y Sonoda // Archives of Histology and Cytology. - 2000. - Vol. - 63 . - № 2. - Р 137-146.
10. Takabe Y Immunomagnetic exclusion of E-cadherin-positive hepatoblasts in fetal mouse liver cell cultures impairs morphogenesis and gene expression of sinusoidal endothelial cells / Y Takabe, S. Yagi, T. Koike et al. // J Anat. - 2012. - Vol. - 221. - №3. - P. 229-39.
УДК 616. 36-053. 1-091. 8-02:[618. 3-06:616. 155. 194. 8]
МОРФОМЕТРИЧНі ТА МОРФОФУНКЦЮНАЛЬНі ПОКАЗНИКИ ПЕЧІНКИ ДОНОШЕНИХ НОВОНАРОДЖЕНИХ ВІД ЗДОРОВИХ МАТЕРІВ З ФІЗІОЛОГІЧНОЮ ВАГІТНІСТЮ Проценко О. С., Ремньова Н. О.
Резюме. У даній роботі представлені морфологічні та морфометричні дані печінки доношених новонароджених від матерів з фізіологічною вагітністю, які можуть бути використані в якості порівняння при вивченні патоморфологічних особливостей печінки плодів і новонароджених від матерів з ускладненою вагітністю. Ключові слова: печінка, новонароджений, гепатоцити, строма печінки.
УДК 616. 36-053. 1-091. 8-02:[618. 3-06:616. 155. 194. 8]
МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ И МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПЕЧЕНИ ДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ ОТ ЗДОРОВЫХ МАТЕРЕЙ С ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ ПРОТЕКАВШЕЙ БЕРЕМЕННОСТЬЮ
Проценко Е. С., Ремнёва Н. А.
Резюме. В данной работе представлены морфологические и морфометрические данные печени доношенных новорожденных от матерей с физиологически протекавшей беременностью, которые могут быть использованы в качестве сравнения при изучении патоморфологических особенностей печени плодов и новорожденных от матерей с осложненной беременностью.
Ключевые слова: печень, новорожденный, гепатоциты, строма печени.
UDC 616. 36-053. 1-091. 8-02:[618. 3-06:616. 155. 194. 8]
Morphometric and Morphofunctional Parameters of the Liver of Fully- Term Newborns from Healthy Mothers with Physiological Pregnancy
Protsenko E. S., Remnyova N. A.
Summary. The morphological and morphometric data of the liver of fully-term newborn from mothers with physiological pregnancy, which can be used as a comparison in the study of pathological features of fetuses' and newborns' liver from mothers with complicated pregnancy, are presented in this work.
Key words: liver, newborn, hepatocytes, liver stroma.
Стаття надшшла 5. 03. 2013 р.
Рецензент - проф. Гасюк А. П.
