CC BY
14
© П.М. Маненков, А.В. Панов, М.В. Бурмистров, И.С. Рагинов, 2014
УДК 618.146-006.61-085.28:612.014.464
МОРФОМЕТРИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ОКСИГЕНАЦИИ НА ПЛОСКОКЛЕТОЧНЫЙ РАК ШЕЙКИ МАТКИ
П.М. Маненков1, А.В. Панов2, М.В. Бурмистров2, И.С. Рагинов1
1 ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» МЗ РФ, г. Казань
2 ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер МЗ РТ», г. Казань
MORPHOMETRIC ESTIMATION OF OXYGENATION INFLUENCE ON SQUAMOUS CELL UTERINE CERVIX CARCINOMAS
P.M. Manenkov1, A.V. Panov2, M.V. Burmistrov2, I.S. Raginov1
1 Kazan State Medical University, Kazan
2 Tatarstan Cancer Center, Kazan
Маненков Павел Михайлович — соискатель кафедры гистологии
420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49, тел. +7-906-323-70-70, e-mail: manenkov@rambler.ru
Manenkov P.M. — applicant of the Histology Department
49 Butlerov St., Kazan, Russian Federation, 420012, tel. +7-906-323-70-70, e-mail: manenkov@rambler.ru
Реферат. Рак шейки матки является одним из самых распространенных онкологических заболеваний, при этом гипоксия опухоли находится на одном из самых высоких уровней. Показано, что именно гипоксия является основным фактором, влияющим на прогрессию опухолей и их устойчивость к химиолучевой терапии. Цель нашего исследования — оценить влияние оксигенации на размеры опухолевых клеток и их ядер, а также отношение стромы и паренхимы при плоскоклеточном раке шейки матки. В исследовании участвовало 53 пациентки с местно-распространенным плоскоклеточным РШМ IIb стадии. Всем пациенткам проводилась химиолучевая терапия. В дальнейшем все больные были разделены на две группы: 31 пациентке (опытная группа) проводили трансректальную инсуфляцию озон-кислородной смеси. Для этой цели использовали аппарат «Медозон-БМ» (Н. Новгород) с подачей озона на выходе 10 ц/ml на 1,5 л (суммарная доза 15 мг). Остальным 22 пациенткам (контрольная группа) инсуфляцию озон-кислородной смеси не проводили. Через три недели после химиолучевой терапии, всем пациенткам выполнили радикальную гистерэктомию. Операционный материал фиксировали в 10% нейтральном формалине. На парафиновых срезах окрашенных гематоксилин-эозином оценивали средний размер опухолевой клетки и ее ядра, а также отношение площади стромы опухоли к паренхиме. Под влиянием озон-кислородной смеси достоверно уменьшались размеры ядер и самих опухолевых клеток, а также отношение стромы к паренхиме опухоли.
Нами впервые проведена морфометрическая оценка эффективности повреждающего действия химиолучевой терапии на плоскоклеточный рак шейки матки при оксигенации ткани опухоли и показано, что оксигенация опухоли повышает эффективность химиолучевой терапии.
Ключевые слова: плоскоклеточный рак шейки матки, гипоксия, оксигенация, морфометрия
Abstract. Squamous cell uterine cervix carcinomas frequently develop hypoxic regions during growth and hypoxia may cause resistance to radiation therapy and increased metastatic propensity. This study demonstrates the results of the complex treatment of 53 patients with squamous cell uterine cervix cancer stage IIB. In the preoperative period all patients received a combination of the combined radiotherapy (distant+intracavitary) and intravenous administration of the cysplatin with Wertheim surgery. On the stage of the preoperative chemoradiotherapy 31 patients (among 53 patients) were treated with transrectal insufflation of the ozone-oxygen mixture. We study mean nuclear size, size of tumors cell and tumor-stroma ratio. Under influence of ozone-oxygen mixture the nuclear size, size of tumors cell and tumor-stroma ratio was significantly lower. Results from our study revealed the fact that ozone-oxygen mixture plus radiochemotherapy is a good option for systemic treatment in squamous cell uterine cervix carcinomas patients.
Key words: сervical cancer, radiochemotherapy, ozone-oxygen mixture.
Рак шейки матки является одним из самых распространенных онкологических заболеваний, при этом гипоксия опухоли находится на одном из самых высоких уровней [11, 15]. Показано, что именно гипоксия является основным фактором, влияющим на прогрессию опухолей и их устойчивость к химиолучевой терапии. Первые исследования влияния повышения оксигенации опухоли были предприняты в 70-х годах двадцатого столетия немецкими учеными [5, 6]. Использовалась методика внутривенного введения озонированной крови самих пациенток в комбинированном лечении рака шейки матки. Авторы отметили снижение осложнений лучевой терапии, более быстрый регресс опухоли и улучшение общего соматического состояния больных. В последующем работы в данном направлении по необъяснимым причинам ограничились лишь экспериментальными и клиническими исследованиями влияния гипоксии на про-грессирование опухоли при раке шейки матки [7, 14, 15]. В то же время в нескольких экспериментальных работах показана неэффективность внутривенного введения озона при карциноме Эрлиха, саркоме 180 и фибросаркоме NR-FS [12]. Наличие противоречивых данных требует дальнейших исследований условий оксигенации опухоли и применение адекватных критериев оценки эффективности.
Более 100 лет назад впервые было предложено использовать ядерно-цитоплазматическое отношение как постоянную величину, характеризующую каждый клеточный тип [1, 3]. Была описана прямая зависимость между размерами ядра, клетки, генома и плоидностью [13, 4, 9]. В последнее время публикуется большое количество работ, посвященных молекулярным механизмам изменения ядерно-ци-топлазматического отношения. Одна из теорий предполагает, что на размер ядра определяет ядерный цитосклет, который зависит от количества ДНК, степенью ее уплотнения и строение ядерных мембран [10, 2, 4].
Цель исследования — оценить влияние оксигенации на размеры опухолевых клеток и их ядер, а также отношение стромы и паренхимы при плоскоклеточном раке шейки матки.
Методика
В исследовании участвовало 53 пациентки с мест-но-распространенным плоскоклеточным РШМ IIb стадии. Возраст больных колебался от 24 до 63 лет (в среднем 42,2 года). Согласно международной кли-
Рис. 1. Методика подсчета размера опухолевых клеток и их ядер. Синие отрезки используются для оценки размеров клеток, зеленые — ядер. х600.
нической классификации РШМ FIGO (2002 года), в исследование были включены женщины со IIb стадией (T2bN0M0), при которой опухоль прорастала шейку матки с инвазией параметрия, но без распространения на близлежащие лимфатические узлы или отдаленные органы.
На первом предоперационном этапе лечения всем 53 пациенткам проводилась химиолучевая терапия (ХЛТ) по схеме принятой с 1997 года в НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова (г. Санкт-Петербург). В дальнейшем все больные были разделены на две группы: 31 пациентке (58,5%) (основная группа) из 53 проводили трансректальную инсуфляцию озон-кислородной смеси (ОКС) в качестве радиомодификатора перед каждым сеансом облучения. Для этой цели использовали аппарат Медозон-БМ (Н. Новгород) с подачей озона на выходе 10 ^/ml на 1,5 л (суммарная доза 15 мг).
Остальным 22 пациенткам (41,5%) (контрольная группа) мы провели предоперационную IIb стадии ХЛТ по вышеописанной схеме без применения ОКС. На втором этапе, через три недели после ХЛТ, всем 53 (100%) пациенткам выполнили радикальную гистерэктомию с двухсторонней подвздошной лимфа-денэктомией по методу Вертгейма — Мейгса. Операционный материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине сроком на 24-48 часов при комнатной температуре. В дальнейшем после сбора образцов ткани в пластмассовые кассеты многоразового использования Plastic Embedding Device (Bio-Optica, Италия) с соответствующей маркировкой, кассеты закладывали в аппарат автоматизированной вакуумной системы обработки тканей (Leica ASP 300,
Рис. 2. Микрофотография опухоли, используемая для подсчета отношения площади стромы к паренхиме. Синим подкрашена строма опухоли. х100.
Рис. 3. Микрофотография рака шейки матки больной, прошедшей курс лучевой химиотерапии (контрольная группа). Большинство клеток вакуолизированы. Окраска гематоксилин-эозином. х600
Германия) с целью обезвоживания материала в спиртах восходящей концентрации по заданной программе. После спиртов проводку материала продолжали в ксилолах при температуре 37°С и пропитывали парафином. Заливку материала выполняли при помощи заливочного центра (Leica EG 1160, Германия). Срезы с парафиновых блоков выполняли серийно на ротационном микротоме (Leica RM 2125 RT, Германия) толщиной 3-5 мкм. Гистологические стекла изучали с помощью универсального микроскопа Olympus BX51WI. Использовали объектив Olympus LMPlanFl 20х/0.40. В каждом микропрепарате анализировали десять произвольных полей зрения, в которых видны опухолевые клетки. Для анализа изображений использовали программу Adobe Photoshop.
На парафиновых срезах окрашенных гематоксилин-эозином оценивали средний размер опухолевой клетки и ее ядра (рис. 1). Для получения средних значений измеряли наибольший и наименьший размер каждой клетки. Сумму полученных значений делили на два. Аналогично для каждой анализируемой клетки подсчитывали размер ядра. Подсчет отношения площади стромы опухоли к паренхиме осуществля-
ли с использованием объективов малого увеличения (х10) (рис. 2).
Результаты
После проведенной лучевой химиотерапии в опухоли определяются многочисленные клетки с вакуолизацией (рис. 3). Ядра часто удлинненые, гиперхром-ные, но чаще встречаются клетки с гомогенно бледно окрашеным ядром с хорошо видимыми гранулами хроматина преимущественно конденсированным вдоль ядерной оболочки. Редко встречаются клетки, в которых несколько ядер или ядерные мембраны со складками. Определяются скопления клеток, у которых значительно увеличины размеры клеток и ядер. Большое количество клеток, демонстрирующих реакцию на химиолучевое лечение, указывает на высокую эффективность используемого метода лечения.
При сравнении морфологической картины в опытной группе с контрольной, нами зафиксировано значительно меньшее количество клеток с признаками дегенерации под влиянием оксигенации, чем в контроле. Меньшее количество клеток с вакуолиза-
Таблица 1. Размеры клеток и ядер опухолевых клеток в контрольной и опытной группах
Группа Средний размер клетки (мкм) Диаметр ядра (мкм)
Контрольная (ХЛТ без оксигенации) 58,3 ± 5,8 38,0±2,9
Опытная (ХЛТ с оксигенации) 47,5±6,2* 21,2±2,3*
* — достоверное различие при сравнении с контролем (Р<0,05)
Рис. 4. Микрофотография рака шейки матки больной, прошедшей курс лучевой химиотерапии на фоне оксигенации (опытная группа). Окраска гематоксилин-эозином. x400
цией цитоплазмы, с лизисом ядра, кариопикнозом и кариорексисом. Под влиянием оксигеннации в опытной группе по сравнению с контрольной достоверно уменьшаются размеры клеток и их ядер (табл. 1).
Важно отметить, что у 3 больных в контрольной группе и у 4 в опытной результаты значительно отличались от средних значений в группе. Эти срезы были исключены из статистической обработки и дальнейшего изучения. Вероятно, в дальнейшем потребуется детальное исследование этого материала с целью определения факторов прогноза успешности каждого вида лечения плоскоклеточного рака шейки матки.
Под влиянием химиолучевой терапии происходит гибель опухолевых клеток, которые замещаются соединительной тканью, и в целом опухоль приобретает скиррозный характер. Вокруг групп опухолевых клеток определяет лимфоцитарная инфильтрация.
В опытной группе на фоне оксигенации по сравнению с контролем происходит увеличение стромы и соответственно уменьшение паренхимы (табл. 2). При этом соединительная ткань выглядит более зре-
Таблица 2. Влияние оксигенации на изменение площадей стромы и паренхимы рака шейки матки (в %)
Группа Строма Паренхима
Контроль 62,7±6,3 37,3±2,6
Опыт 81,2±9,1* 18,8±2,3*
* — достоверное различие при сравнении с контролем (Р<0,05)
лой и с меньшей лимфоцитарной инфильтрацией (рис. 4).
Наличие более выраженной лимфоцитарной инфильтрации в препаратах контрольной группы (химиолучевая терапия без оксигенации) является хорошим прогностичеким признаком, т.к. косвенно свидетельствует о стимуляции иммунитета. Однако повреждение паренхимы является одним из основных критериев оценки чувствительности опухоли к терапевтическому воздействию. Поэтому на основании морфометрических результатов и морфологической картины мы предполагаем, что под влиянием оксигенации не только погибло большее количество раковых клеток, но это произошло и на более ранних сроках, что проявляется в более зрелой соединительной ткани и меньшей инфильтрации лимфоцитами.
В работе впервые проведена морфометрическая оценка эффективности повреждающего действия химиолучевой терапии на плоскоклеточный рак шейки матки при оксигенации ткани опухоли и показано, что оксигенация опухоли повышает эффективность химиолучевой терапии.
Литература
1. Boveri T. Uber die Abhngigkeit der Kerngrsse und Zellenzahl bei Seeigellarven von der Chromosomenzahl der Ausganszellen / T. Boveri, V. Zellenstudien // Jena: Z. Naturw. — 1905. — Vol. 39. — P. 445—524.
2. Cavalier-Smith T. Skeletal DNA and the evolution of genome size / T. Cavalier-Smith // Annu. Rev. Biophys. Bioeng. — 1982. — Vol. 11. — P. 273—302.
3. Gerassimow J. Die Abhngigkeit der Zelle von der Menge ihrer Kernmasse / J. Gerassimow // Zeitschr. Allg. Physiol. — 1902. — Vol. 1. — P. 220—258.
4. Gregory T. Genome size evolution in animals / T. Gregory // The Evolution of the Genome. — London, 2005. — P. 4—87.
5. Hernuss P. Ozone-oxygen injection in gynecological radiotherapy / P. Hernuss, E. Muller-Tyl, J. Dimopoulos // Strahlentherapie. — 1974. — Vol. 148. — P. 242—245.
6. Hernuss P. Ozone and gynecologic radiotherapy / P. Hernuss, E. Muller-Tyl, L. Wicke // Strahlentherapie. — 1975. — Vol. 150. — P. 493—499.
7. Hockel M. Association between tumor hypoxia and malignant progression in advanced cancer of the uterine cervix / M. Hockel, K. Schlenger, B. Aral,
M. Mitze, U. Schaffer, P. Vaupel // Cancer Res. — 1996. — Vol. 56. — P. 4509—4515.
8. Höckel M. Biological consequences of tumor hypoxia / M. Hockel, P. Vaupel // Semin Oncol. — 2001. — Vol. 28. — P. 36—41.
9. Jovtchev G. Nuclear DNA content and nuclear and cell volume are positively correlated in angiosperms / G. Jovtchev, V. Schubert, A. Meister, M. Barow, I. Schubert // Cytogenet. Genome Res. — 2006. — Vol. 114. — P. 77—82.
10. Orgel L. Selfi sh DNA: the ultimate parasite / L. Orgel, F. Crick // Nature. — 1980. — Vol. 284. — P. 604—607.
11. Parkin D. Global Cancer Statistics / D. Parkin, F. Bray et al. // Cancer J. Clin. — 2005. — Vol. 55. — P. 74—108.
12. Peralta C. Protective effect of ozone treatment on the injury associated with hepatic ischemia-reperfusion:
antioxidant-prooxidant balance / C. Peralta, O. Leon, C. Xaus et al. // J. Free Radic Res. — 1999. — Vol. 31. — P. 191 — 196.
13. Schmidt E. Cell size regulation, a mechanism that controls cellular RNA accumulation: consequences on regulation of the ubiquitous transcription factors Oct1 and NF-Y and the liver-enriched transcription factor DBP / E. Schmidt, U. Schibler // J. Cell Biol. — 1995. — Vol. 128. — P. 467—483.
14. Sundfor K. Tumour hypoxia and vascular density as predictors of metastasis in squamous cell carcinoma of the uterine cervix / K. Sundfor, H. Lyng, E. Rofstad et al. // J. Cancer. — 1998. — Vol. 78. — P. 822—827.
15. Hoeckel M. Prognostic significance of tissue hypoxia in cervical cancer / M. Hoeckel, P. Vaupel // C.M.E. J. Gynecol. Oncol. — 2001. — Vol. 6. — P. 216—225.
