CC BY
75
'пуЯЯЦИИ
1ых и моторных нейронов, |их седалищный нерв в норме о перерезке у взрослых крыс
Л.Б. Тимофеева, аспирант кафедры гистологии с цитологией и эмбриологией1;
Н.В. Благова, аспирант кафедры гистологии с цитологией и эмбриологией1;
А.Г. Величанская, к.б.н., старший преподаватель кафедры гистологии с цитологией и эмбриологией1;
И.В. Балалаева, к.б.н., зав. лабораторией клеточных технологий2;
ИЛ Ермолин, д.б.н., зав. кафедрой гистологии с цитологией и эмбриологией1
Жижегородская государственная медицинская академия, Н. Новгород;
Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Н. Новгород
Цель исследования — изучение популяции чувствительных и моторных нейронов, участвующих в формировании седалищного нерва (СН) в норме и на 300-е сутки после его перерезки у взрослой крысы.
Материалы и методы. Экспериментальное исследование выполнено на белых беспородных крысах-самцах (n=16) массой 200— 250 г. У животных контрольной и экспериментальной групп перерезался правый СН на уровне верхней трети бедра. Для изучения популяций нейронов, формирующих СН, применен метод ретроградного маркирования флюоресцентным красителем Mini-Ruby. В контрольной группе маркирование проводилось через проксимальную культю СН, а в экспериментальной — раздельно, через проксимальную и дистальную культи. Продольно ориентированные серийные срезы спинномозговых узлов толщиной 25 мкм и продольные и поперечные серийные срезы спинного мозга толщиной 50 мкм приготавливались на замораживающем микротоме. Подсчет маркированных нейронов с видимыми ядрами осуществлялся на каждом срезе.
Результаты. В норме установлено, что популяция мотонейронов, формирующих СН, располагается в сегментах L4—L6, а чувствительных — в сегментах L3—L6. Соотношение моторных и чувствительных нейронов составляет 1:2,49.
В эксперименте (через 300 сут) выделены группы переживающих, регенерирующих и резервных нейронов. Группа переживающих мотонейронов составила 37,41%, а чувствительных — 15,34% от популяций в норме. Из числа переживающих рубец преодолели 50,64% моторных и 11,07% чувствительных нейронов. Группу резервных составили 49,36% моторных и 88,93% чувствительных нейронов.
Заключение. Количественно определены популяции моторных и чувствительных нейронов, формирующих СН в норме, и выявлен более высокий потенциал к регенерации у моторных по сравнению с чувствительными нейронами.
Ключевые слова: чувствительные нейроны, моторные нейроны, седалищный нерв, Mini-Ruby.
English
Morphology of the sensitive and motor neuron populations, forming a sciatic nerve in norm and at its cutting in adult rats
L.B. Timofeeva, post-graduate of the histology with cytology and embryology chair1;
N.V. Blagova, post-graduate of the histology with cytology and embryology chair1;
A.G. Velichanskaya, c.b.s., senior teacher of the histology with cytology and embryology chair1
Для контактов: Тимофеева Лидия Борисовна, тел. раб. 8(831)438-02-05, тел. моб. +7 920-054-56-35; е-mail: bioli@mail.ru.
I.V. Balalaeva, c.b.s., head of the cellular technology laboratory2;
I.L. Ermolin, B.D., head of the histology with cytology and embryology chair1
1 Nizhny Novgorod state medical academy, N. Novgorod;
2 N.I. Lobachevsky Nizhny Novgorod state university, N. Novgorod
Aim of investigation is a study of the sensitive and motor neuron population, participating in a sciatic nerve (SN) in norm forming and on the 300 days after its cutting in adult rat.
Materials and methods. Experimental investigation is accomplished on white breedless male-rats (n=16) with a mass of 200—250g. The right SN was cut at the upper third of a femur level in the control and experimental group animals. A method of retrograde marking with a Mini-Ruby fluorescent stain is used for a study of the neuron populations, forming a SN. A marking was made through a proximal SN stump in a control group, and separately, through a proximal and distal stump in experimental group. The longitudinally oriented serial sections of the cerebrospinal nodes with a 25 mkm thickness and longitudinal and transverse serial sections of the spinal cord with a 50 mkm thickness were prepared at a freezing microtome. A calculation of the marked neurons with the visible nuclei was made in each section.
Results. It is established in norm that a population of motoneurons, forming a SN, is located in segments L4—L6, and a population of the sensitive ones is located in segments L3—L6. A ratio of motor and sensitive neurons is 1:2.49.
The groups of surviving, regenerating and reserve neurons are distinguished in experiment (in 300 days). A group of surviving motoneurons was 37.41%, and a group of the sensitive ones was 15.34% of the populations in norm. More than 50.64% of the motor and 11.07% of the sensitive neurons were in those with a cicatrix. A group of reserve neurons included 49.36% of the motor and 88.93% of the sensitive neurons.
Conclusion. The motor and sensitive neuron populations, forming a SN in norm, are quantitatively defined, and a higher potential to regeneration in the motor neurons compared to sensitive ones is revealed.
Key words: sensitive neurons, motor neurons, sciatic nerve, Mini-Ruby.
Повреждения нервного ствола вызывают расстройства движений, чувствительности и вегетативно-трофические нарушения. Успех восстановления периферического нерва в значительной мере определяется выживаемостью после травмы нейронов, задействованных в его формировании. При оценке эффективности регенерации СН анализируются моторные нейроны спинного мозга (СМ) и чувствительные нейроны спинномозговых узлов (СМУ) одного или двух сегментарных уровней [1—3]. Между тем в литературе имеются сведения об участии в формировании СН трех или четырех сегментов поясничного отдела СМ и СМУ [4—9]. Предлагаемый метод ретроградного маркирования нейронов позволяет объективно оценить популяции моторных и чувствительных нейронов, формирующих СН крысы в норме и в эксперименте. Это имеет принципиальное значение для коррекции тактики лечения поврежденного периферического нерва.
Цель исследования — изучить популяции чувствительных и моторных нейронов, формирующих седалищный нерв в норме и на 300-е сутки после его перерезки.
Материалы и методы. Исследования проводились на самцах белых беспородных крыс (n=16) массой 200—250 г. Контрольную группу составили 7 интакт-ных животных, экспериментальную — 9 животных. Эксперименты выполнены под нембуталовым наркозом (40 мг/кг), который вводился внутрибрюшинно. Для выявления нейронов, формирующих СН в норме и после его перерезки, был использован флюоресцентный краситель Mini-Ruby (dextran, tetramethylrhodamine and biotin 10,000 MW, lysine fixable; molecular probes).
У всех животных на уровне верхней трети бедра перерезался правый СН, после чего рана послойно ушивалась. В контрольной группе СН апплицировался
10,0% флюоресцентным красителем. У животных экспериментальной группы через 300 сут было проведено ретроградное маркирование через проксимальную (n=5) и дистальную (n=4) культи регенерировавшего нерва. Через 7 дней животные перфузировались раствором параформальдегида на фосфатном буфере.
Материалом для исследования послужили сегменты СМ L3—L6 и СМУ этих же сегментарных уровней. Материал помещался дополнительно в указанный фиксатор на 24 ч (при комнатной температуре), после чего переносился в 10,0% раствор сахарозы на фосфатном буфере на 24 ч и затем в 30,0% раствор сахарозы на фосфатном буфере на 72 ч в холодильник. После этого образцы ткани заключались в 1,0% раствор желатины на 0,1М фосфатном буфере с pH=7,2—7,4. Из подготовленных тканей в криостате (-25°С) приготавливались продольно и поперечно ориентированные срезы СМ толщиной 50 мкм и продольно ориентированные срезы СМУ толщиной 25 мкм. Срезы помещались на предметные стекла, покрытые желатиной, сушились, после чего заключались в равную смесь глицерина с фосфатным буфером.
Подсчет маркированных нейронов производился на флюоресцентном микроскопе Micros MC 200 F (Австрия) по ядрам, поскольку в литературе имеются сообщения о возможности использования этого метода наравне с методом объемной реконструкции пери-карионов, который позволяет более точно определить количество нейронов, но является трудоемким [10]. Фоторегистрация производилась на флюоресцентном микроскопе Carl Zeiss Axiovert 200 камерой Carl Zeiss AxioCam MRc.
Статистический анализ проведен с помощью компьютерной программы Statistica 6.0. Достоверность различий оценивалась с использованием непарамет-
рического критерия Манна—Уитни. Достоверными считались результаты при р<0,05.
Результаты и обсуждение. Метод ретроградного транспорта флюоресцентного красителя позволил выявить популяции чувствительных и моторных нейронов, участвующих в формировании СН в норме и после перерезки.
В норме маркированные мотонейроны были выявлены в сегментах СМ Ц4—Ц6. Наибольшая плотность клеток прослеживалась в латеральных ядрах перед-
него рога, в центральном ядре их количество было незначительным. В сегменте Ц4 большая плотность маркированных нейронов была характерна для переднего латерального ядра (рис. 1, а), а в сегментах Ц5 и Ц6 — для заднего латерального ядра (рис. 1, в, д). Количество и плотность мотонейронов увеличивались в местах выхода из спинного мозга вентральных корешков Ц4, Ц5 и Ц6. На продольных срезах СМ сегментов Ц4—Ц6 маркированные нейроны образуют непрерывный тяж клеток длиной около 8,5 мм (табл. 1).
Рис. 1. Моторные нейроны СМ в норме (а — L4; в — L5; д — L6) и через 300 сут после перерезки седалищного нерва (б — L4; г — L5; е — L6). Ретроградное маркирование моторных нейронов, формирующих СН. Введение Mini-Ruby через проксимальную культю. Ув. 40
////////////////////////////////////////^^^^
20 СТМ j 2010 - З Л.Б. Тимофеева, Н.В. Благова, А.Г. Величанская, И.В. Балалаева, И.Л. Ермолин
Таблица 1
Распределение моторных и чувствительных нейронов, формирующих седалищный нерв в норме, %
Расположение нейронов Сегментарный уровень
L3 L4 L5 L6
СМ 0 31,56 43,81 24,63
СМУ 0,06 34,94 55,96 9,04
Маркированные чувствительные нейроны присутствовали в сегментах СМУ Ц4 и Ц5 у всех исследованных животных (рис. 2, а, в). В сегменте Ц6 они были выявлены в меньшем количестве и не у всех животных (рис. 2, д). В сегменте Ц3 у некоторых животных встречались единичные нейроны исследуемой популяции (см. табл. 1). Локализации нейронов в строме ганглия, отмеченной другими исследователями [11], не обнаружено.
Полученные результаты соответствуют существу-
І * -V#
# . і І ;
' IV ' ш ■ .4 • ''
V *ie
f ф •
9 4 „ *т*
I? ф
* е » ■ . . Щ. - * *
‘ .
9
* if
Н т!
Рис. 2. Моторные нейроны СМУ в норме (а — L4; в — L5; д — L6) и через 300 сут после перерезки седалищного нерва (б — L4; г — L5; е — L6). Ретроградное маркирование чувствительных нейронов, формирующих СН. Введение Mini-Ruby через проксимальную культю. Ув. 40
ющим представлениям об источниках формирования СН, согласно которым оно осуществляется моторными и чувствительными нейронами сегментарных уровней Lз—Ц6 [4—9]. Соотношение вклада СМУ в СН отличается от установленного ранее [7]. Расхождение результатов можно объяснить различием пород использованных животных [9].
Общее количество чувствительных нейронов, участвующих в формировании СН на уровне верхней трети бедра, в норме составило 2041,60±445,20, а количество моторных нейронов — 816,86±39,37. Установленные количественные данные значительно отличаются от приводимых в литературе [5—7], по-видимому, вследствие различий в использованных методах подсчета нейронов.
Через 300 сут после перерезки СН при маркировании проксимальной культи гибель нейронов была обнаружена в СМ и СМУ всех изученных сегментарных уровней. Маркирование проксимальной и дистальной культей позволило выделить популяции переживающих, регенерирующих и резервных нейронов [12].
Процентные показатели гибели моторных нейронов в сегментах СМ при анализе данных в случае введения красителя в проксимальную культю не имели больших различий. Гибель нейронов в сегменте L4 составила 63,03%, в Ц5 — 61,49%, в Ц6 — 68,80% (рис. 1, б, г, е). В сегменте СМУ Ц6 гибель нейронов была более значимой и достигла 99,30% (рис. 2, е). Процентные показатели гибели нейронов в сегментах СМУ Ц5 и Ц4 уменьшались в ростральном направлении, но были значительны (рис. 2, б, г). Так, гибель нейронов в сегменте
Ц5 по сравнению с контрольными животными составила 87,24%, а в Ц4 — 76,69%.
Таким образом, количество переживающих моторных нейронов составило 37,41%, а переживающих чувствительных нейронов — 15,34% от нормы. Эти данные подтверждают сведения о большей резистентности моторных нейронов при повреждении периферических отростков [2, 13—16].
Введение маркера в дистальную культю позволило выявить популяцию нейронов, периферические отростки которых преодолели рубец. Через 300 сут после пересечения СН количество моторных нейронов составило в сегменте Ц4 — 51,30%; в Ц5 — 43,00%; в Ц6 — 65,28% от популяции переживающих клеток (табл. 2). Общее количество регенерирующих моторных клеток от всей популяции переживающих нейронов составило 50,64%.
Количество регенерирующих чувствительных нейронов составило 11,17% от количества переживающих. Соответственно, в сегменте Ц4 их было 8,72%, в Ц5 — 14,23%, а в Ц6 не обнаружено вообще (табл. 3).
Полученные данные указывают на длительное переживание и большие потенциальные регенеративные возможности мотонейронов по сравнению с чувствительными, поскольку 50,64% из них оказались способными к преодолению соединительнотканного рубца. Среди переживающих чувствительных нейронов СМУ преодолеть рубец смогли 11,07%.
Заключение. Популяция мотонейронов, формирующих седалищный нерв, располагается в сегментах Ц4—Ц6 и составляет в норме 816,86±39,37, а популяция
Таблица 2
Количество мотонейронов седалищного нерва в сегментах СМ в норме и через 300 сут после перерезки при аппликации Mini-Ruby проксимальной и дистальной культей
Сегменты СМ Норма (n=7) 300 сут, проксимальная культя (n=5) 300 сут, дистальная культя (n=4)
L4 271,57±82,55 100,40±9,61* 51,50±5,75**
L5 357,86±9,92 137,80±5,67* 59,25±4,99**
ц 216,00±22,56 67,40±8,20* 44,00±4,76**
Всего 816,86±39,37 305,60±16,83* 154,75±10,69**
* — статистически значимо отличается от нормы (р<0,05);
** — от данных в проксимальной культе (р<0,05).
Та б л и ц а 3
Количество чувствительных нейронов седалищного нерва в СМУ в норме и через 300 сут после перерезки при аппликации Mini-Ruby проксимальной и дистальной культей
Сегменты СМУ Норма (n=5) 300 сут, проксимальная культя (n=5) 300 сут, дистальная культя (n=4)
L3 1,20±2,17 0 0
L4 713,40±399,52 166,20±152,30* 14,50±24,56**
L5 1142,40±498,99 145,80±156,70* 20,75±40,18**
ц 184,60±134,63 1,20±1,80* 0**
Всего 2041,60±445,20 313,20±309,62* 35,00±64,07**
* — статистически значимо отличается от нормы (р<0,05); ** — от данных в проксимальной культе (р<0,05).
уттжтжтжтжттттжтжтжтжтттт^ттттжтттт^ттттитттттітттттг/' 22 СТМ J 2010 - З Л.Б. Тимофеева, Н.В. Благова, А.Г. Величанская, И.В. Балалаева, И.Л. Ермолин
чувствительных нейронов — в сегментах L3—L6 и со- 7
ставляет — 2041,6±445,2, т.е. соотношение моторных и чувствительных нейронов — 1:2,49.
Через 300 сут после перерезки СН группа переживающих мотонейронов составила 37,41%, а чувствительных — 15,34% от количества нейронов СН в норме. Из них преодолели рубец 50,64% мотонейронов и 11,07% чувствительных нейронов. В группу резервных вошли 49,36% моторных и 88,93% чувствительных нейронов. Потенциальные возможности к регенерации после перерезки периферических отростков у моторных выше, чем у чувствительных нейронов.
Литература
1.
2.
3.
4.
5.
Novikov L., Novikova L., Kellerth J.-O. Brain-derived neurotrophic factor promotes axonal regeneration and long-term survival of adult rat spinal motoneurons in vivo. Neuroscience 1997 May 26; 79(3): 765—774.
Novikova L., Novikov L., Kellerth J.-O. Effects of neurotransplants and BDNF on the survival and regeneration of injured adult spinal motoneurons. Neuroscience 1997 Dec; 9(12): 2274—2777.
Челышев Ю.А., Рагинов И.С., Гусева Д.С., Масгу-тов Р.Ф. Выживание и фенотипическая характеристика аксотомированных нейронов спинальных ганглиев. Морфология 2004; 125(3): 45—49.
Horcholle-Bossavit G., Jami L., Thiesson D., Zytnicki D. Motor nuclei of peroneal muscles in the cat spinal cord. J Comp Neurol 1988 Nov 15; 277(3): 430—440.
Swett J.E., Wikholm R.P., Blanks R.H., Swett A.L., Conley L.C. Motoneurons of the rat sciatic nerve. Exp Neurol 1986 Jul; 93(1): 227—252.
Negredo Р., Castro J., Lago N., Navarro Х., Avendano С. Differential growth of axons from sensory and motor neurons through a regenerative electrode: a stereological, retrograde tracer, and functional study in the rat. Spain Neuroscience 2004; 128(3): 605—615.
Swett J.E., Torigoe Y, Elie V.R. Sensory neurons of the rat sciatic nerve. Exp Neurol 1991 Oct; 114(1): 182—103.
8. Rigaud M., Gemes G., Barabas M.-E., Chernoff D.I., Abram S.E., Stucky C.L., Hoganad Q.H. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: Implications for studies of neuropathic pain. Pain 2008 May; 136(1 — 2): 188—201.
9. Asato F, Butler M., Blomberg H, Gordh T. Variation in rat sciatic nerve anatomy: implications for a rat model of neuropathic pain. J Peripher Nerv Syst 2000 Mar; 5(1): 19—21.
10. Ma J., Novikov L.N., Wiberg M., Kellerth J.-O. Delayed loss of spinal motoneurons after peripheral nerve injury in adult rats: a quantitative morphological study. Exp Brain Res 2001 Jul; 139(2): 216—223.
11. Wessels W.J., Feirabend H.K., Marani E. The rostrocaudal organization in the dorsal root ganglia of the rat: a consequence of plexus formation? Anat Embryol (Berl) 1994 Jul; 190(1): 1—11.
12. Ермолин И.Л. Количественная оценка маркированных нейронов спинномозгового узла T13 в условиях регенерации периферического нерва у взрослой крысы. Нижегородский мед журнал 2006; 2: 24—29.
13. Welin D., Novikova L.N., Wiberg M, Kellerth J.-O., Novikov L.N. Effects of N-acetyl-cysteine on the survival and regeneration of sural sensory neurons in adult rats. Brain Res 2009 Sept 1; 1287(1): 58—66.
14. Koliatsos V.E., Price W.L., Pardo C.A., Price D.L. Ventral root avulsion: an experimental model of death of adult motor neurons. J Comp Neurol 1994 Apr 1; 342(1): 35—44.
15. Li L., Houenou L.J., Wu W, Lei M., Prevette D.M., Oppen-heim R.W. Characterization of spinal motoneuron degeneration following different types of peripheral nerve injury in neonatal and adult mice. J Comp Neurol 1998 Jun 29; 396(2): 158—168.
16. Welin D., Novikova L.N., Wiberg M., Kellerth J.-O., Novikov L.N. Survival and regeneration of cutaneous and muscular afferent neurons after peripheral nerve injury in adult rats. Exp Brain Res 2008 Mar; 186(2): 315—323.
