Научная статья на тему 'Морфология печени при экспериментальной острой кишечной инфекции в условиях терапии коллоидным наноаквахелатом серебра'

Морфология печени при экспериментальной острой кишечной инфекции в условиях терапии коллоидным наноаквахелатом серебра Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
217
47
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ПЕЧЕНЬ / LIVER / МОРФОЛОГИЯ / MORPHOLOGY / НАНОАКВАХЕЛАТ СЕРЕБРА / СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ / SCANNING ELECTRONIC MICROSCOPY / ОСТРАЯ КИШЕЧНАЯ ИНФЕКЦИЯ / ACUTE INTESTINAL INFECTION / NANOSILVER

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Половьян Екатерина Сергеевна, Москаленко Роман Андреевич, Чемич Николай Дмитриевич, Романюк Анатолий Николаевич, Бончев Сергей Дмитриевич

Изучены морфологические изменения печени самцов крыс при острой кишечной инфекции, вызванной условно патогенными микроорганизмами. Применение наноаквахелата серебра уменьшает активность воспалительного процесса и морфологических изменений в печени. Исследование ткани печени с помощью сканирующей электронной микроскопии с микроанализом показало отсутствие накопления серебра в органе.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Половьян Екатерина Сергеевна, Москаленко Роман Андреевич, Чемич Николай Дмитриевич, Романюк Анатолий Николаевич, Бончев Сергей Дмитриевич

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

The morphology of the liver in case of experimental acute intestinal infection in a therapy colloidal nanoaccumulator silver

The morphological state and morphometric indexes of liver of rats are studied in the conditions of design on males of rats of the acute intestinal infection caused by conditionally pathogenic flora. The application of nanosilver diminishes activity of inflammatory process and morphological changes in an organ. Research of tissue of liver by means of scanning electronic microscopy with microanalysis showed absence of accumulation of silver in an organ.

Текст научной работы на тему «Морфология печени при экспериментальной острой кишечной инфекции в условиях терапии коллоидным наноаквахелатом серебра»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

© Авторы, 2014

УДК 616.36-091:616.34-022.7

МОРФОЛОГИЯ ПЕЧЕНИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ОСТРОЙ КИШЕЧНОЙ ИНФЕКЦИИ В УСЛОВИЯХ ТЕРАПИИ КОЛЛОИДНЫМ НАНОАКВАХЕЛАТОМ СЕРЕБРА

Е.С. ПОЛОВЬЯН, Р.А. МОСКАЛЕНКО, Н.Д. ЧЕМИЧ, А.Н. РОМАНЮК, С.Д. БОНЧЕВ

Сумский государственный университет, г. Сумы

THE MORPHOLOGY OF THE LIVER IN CASE

OF EXPERIMENTAL ACUTE INTESTINAL INFECTION IN A THERAPY COLLOIDAL NANOACCUMULATOR SILVER

E.S. POLOVYAN, R.A. MOSKALENKO, M.D. CHEMYCH, A.M. ROMANYUK, S.D. BONCHEV

Sumy state University, Sumy

Изучены морфологические изменения печени самцов крыс при острой кишечной инфекции, вызванной условно патогенными микроорганизмами. Применение наноаквахелата серебра уменьшает активность воспалительного процесса и морфологических изменений в печени. Исследование ткани печени с помощью сканирующей электронной микроскопии с микроанализом показало отсутствие накопления серебра в органе.

Ключевые слова: печень, морфология, наноаквахелат серебра, сканирующая электронная микроскопия, острая кишечная инфекция.

The morphological state and morphometric indexes of liver of rats are studied in the conditions of design on males of rats of the acute intestinal infection caused by conditionally pathogenic flora. The application of nanosilver diminishes activity of

inflammatory process and morphological changes in an organ. Research of tissue of liver by means of scanning electronic microscopy with microanalysis showed absence of accumulation of silver in an organ.

Keywords: liver, morphology, nanosilver, scanning electronic microscopy, acute intestinal infection.

Введение

За последнее десятилетие на Украине, как и во всем мире, ежегодно растет заболеваемость острыми кишечными инфекциями (ОКИ), которые по количественным показателям стабильно занимают второе место в структуре инфекционной патологии. При этом наблюдается увеличение роли условно патогенной микрофлоры (УПМ) семейства Enterobacteriaceae (Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Serratia marcescendes и др.) [2]. Одной из причин высокой частоты ОКИ, является высокая пластичность УПМ, обусловленная генетическим контролем активации факторов патогенности, антагонизмом с представителями нормальной микрофлоры, способностью к образованию биопленок [1]. Также, вследствие неконтролированного использования населением антибиотиков (АБ), происходит искусственная селекция УПМ с множественной устойчивостью к медикаментам. Таким образом, происходит циркуляция АБ во внешней среде, что приводит к антибиотикоре-зистентности УПМ [5]. Исходя из это-

го, возникает необходимость пересмотра традиционного этиотропного лечения ОКИ, вызванных УПМ.

Сегодня значительный теоретический и практический интерес вызывают научные разработки нанотокси-кологии и нанофармакологии по выяснению биофизических механизмов действия наночастиц на функции органов и систем организма, различных клеток, их мембран, митохондрий, рибосом, ферментов, нуклеиновых кислот [7]. Современные нанотехно-логии позволяют воздействовать на пораженные органы и системы без негативного влияния общее состояние здоровья [3, 4]. Например, в качестве альтернативы АБ используется коллоидный наноаквахелат серебра, стабилизированный лимонной кислотой, с размерами частиц 25 нм. Именно такие размеры позволяют действующему препарату занимать большую площадь, что приводит к увеличению контакта серебра с возбудителями инфекционных заболеваний [11].

Для объяснения механизма действия наносеребра используется абсорбционная теория, согласно которой этот химический элемент поглощается

бактериальными протопластами с дальнейшим связыванием тиамина и гуанина ДНК и деструкцией мембраны, что приводит к гибели возбудителя [10]. Широкий спектр антисептического действия серебра, отсутствие к нему резистентности у микроорганизмов, способствуют повышению заинтересованности исследователей к этому микроэлементу во многих странах мира. На современном этапе серебро относят в группу микроэлементов с малоизученной биологической ролью, и, учитывая изменение физико-химических свойств серебра в нанометровом диапазоне, необходимо создание практического и теоретического базиса нанофармаколо-гии и нанотоксикологии для предупреждения ятрогенных микроэлементозов, в данном случае, аргирозов [8].

Цель исследования

Изучение влияния препарата коллоидного наноаквахелата серебра на морфологию печени на экспериментальной модели ОКИ, вызванной УПМ.

Материалы и методы

Эксперимент проводили согласно положения "Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей" (Страсбург, Франция, 1985 г.). ОКИ вызывали у 16 половозрелых самцов крыс массой 200-250 г путем перо-рального введения 1,0 мл смеси куль-

тур УПМ каждые 4 часа на протяжении 5 дней (E. coli гемолизирующая 1010 КОЕ/мл, K. pneumoniae 1010 КОЕ/мл, St. aureus (гиалуронидазная, лецитиназная, коагулазная, гемагглю-тинирующая активность) 1010 КОЕ/мл, Ps. aeruginosae 1010 КОЕ/мл, Enterobacter cloacae 1010 КОЕ/мл, Str. fecalis 1010 КОЕ/мл). Животные были разделены на две группы: 1-ой контрольной группе (8 крыс) - в качестве базисной терапии перорально вводили регидрон (2,5 мл/сутки), смекту (0,15 г/сутки в 3 приема) и панкреатин (12 мг/сутки в 3 приема); 2-я экспериментальная группа (8 крыс) - на фоне базисной терапии перорально получала по 2 мл коллоидного наноаквахелата серебра (0,02 мг/сутки), стабилизированного лимонной кислотой, с концентрацией 10мг/л каждые (24±2) часа в течение 7 дней. Раствор наносеребра необходимой концентрации готовили ex tempore. Общая длительность эксперимента составила 14 дней.

После выведения животных из эксперимента путем декапитации в условиях эфирного наркоза, осуществляли взятие фрагмента печени. Проводку, заливку материала, изготовление гисто-логических срезов. Гистологические срезы окрашивались гематоксилином и эозином по стандартной методике [6]. В печеночной ткани измеряли площадь ядер и цитоплазмы гепатоцитов, подсчитывали количество клеток Купфера

в поле зрения и количество гепато-цитов в печеночной балке [9]. Микрофотографии гистологических препаратов получали и обрабатывали с помощью цифровой системы вывода изображения «SEO Scan ICX 285 AK-F IEE-1394» и морфометрической программы «SEO Image Lab 2.0» (Сумы, Украина).

Для проведения сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с микроанализом исследуемые образцы печени нарезали на блоки размером 3х3 мм и толщиной 1-1,5 мм, которые фиксировали в 3,125 % растворе глютарово-го альдегида на фосфатном буфере. Минимальное время фиксации образцов составляло 4-5 часов. Далее образцы промывали фосфатным буфером (pH 7,2) и помещали в 1% раствор тетраок-сида осмия на том же фосфатном буфере на 2 часа. После фиксации осмием образцы промывали трижды бидистил-лированной водой. Затем проводилась дегидратация в спиртах возрастающей концентрации. Обезвоженные образцы помещали в вакуумную камеру для просушивания под разрежением в течение 5 часов. Далее высушенные образцы монтировали на предметных столиках и напыляли золотом. Исследование проводилось на сканирующем электронном микроскопе РЕМ 100-У с микроанализом (ПО «Электрон», Сумы).

Результаты и их обсуждение

В ходе эксперимента у исследуемых животных на (2,88±0,18)

день введения смеси культур УПМ наблюдалось угнетение познавательной и двигательной активности, снижение потребление корма. К четвертому дню (4,63±0,13) присоединились жажда, жидкий стул зелено-коричневого цвета без примесей слизи, крови; наблюдалось снижение массы тела на 9,81±0,3 %.

Во время лечения подопытных крыс обеих групп нормализация двигательной реакции, и активности употребления корма наступала в одинаковые сроки - на второй день (2,13±0,53) от начала лечения. Использование разных схем лечения повлияло на длительность диарейного синдрома. Так, у крыс 2-й группы быстрее, по сравнению с 1 -й, происходила нормализация функции кишечника на третьи (3,88±0,13) и пятые (5,38±0,18) сутки от начала лечения соответственно, р<0,001. За весь период наблюдения за животными летальных случаев не было.

В условиях базисной терапии ОКИ, вызванной УПМ, в печени были выявлены морфологические изменения. Гистологическая структура печени характеризовалась частичной диском-плексацией печеночных балок, отеком паренхимы. Наблюдалось умеренное количество двуядерных гепатоцитов, некоторые печеночные клетки находились в состоянии выраженной баллонной дистрофии (рис. 1).

Портальные тракты расширены за счет отека и воспалительной ин-

Рис. 1. Печень после базисной терпии ОКИ, вызванной УПМ.; Гепатоциты в состоянии балонной дистрофии. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. Х 360

фильтрации. В перипортальной зоне определялась незначительная лимфо-идно-гистиоцитарная инфильтрация с формированием одиночных очагов некрозов. В поврежденных портальных трактах отмечались деструктивные изменения желчных протоков, дистрофические изменения эндотелия сосудов. Воспаление иногда распространялось в порто-портальном направлении, имелись одиночные внутридольковые ин-

фильтраты. Центральные вены полнокровны, их эндотелий с признаками десквамации, базальная мембрана утолщена. Большинство синусоидов расширены и содержали цепочки лимфоцитов, наблюдалось увеличение клеток Купфера.

В условиях терапии ОКИ раствором наноаквахелата серебра было выявлено нормализация гистологической структуры печени (рис. 2).

Рис. 2. Печень после лечения наноаквахелатом серебра ОКИ, вызванной УПМ. Гепатоциты без дистрофических изменений, много двуядерных гепатоцитов и клеток Купфера. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. Х 360

Уменьшался отек паренхимы, однако сохранялось расширение пространств Диссе и незначительная дис-комплексация печеночных балок. По сравнению с первой группой крыс, количество двуядерных гепатоцитов уменьшалось, отдельные гепатоциты находились в состоянии гидропиче-ской дистрофии. В части портальных трактов выявлялась умеренная воспалительная лимфоидно-гистиоцитарная инфильтрация, иногда с распространением в перипор-тальные зоны, одиночные фокусы воспаления встречались внутри долек. В пораженных портальных трактах наблюдались явления деструкции и компенсаторной пролиферации желчных протоков, дистрофические изменения эндотелия сосудов. Также

Исследование химического состава образцов печени проходило через всю толщину при помощи СЭМ с микроанализом. Средняя длина сканирования по линии составляла 510±200 мкм. В ходе исследования

наблюдались полнокровие центральных вен, мелкие кровоизлияния в паренхиме печени. Некоторые синусоиды были расширены, содержали еди-ночные лимфоциты, нейтрофилы.

При исследовании морфометри-ческих показателей ткани печени были получены следующие результаты (таблица 1): средняя площадь ядер гепатоцитов в условиях базисного лечения ОКИ была в 1,4 раза меньше чем у крыс при использовании нано-аквахелата серебра, а средняя площадь цитоплазмы в 1,7 больше. При этом количество клеток Купфера на 73,3 % было больше, а количество ге-патоцитов в балке на 76,0 % меньше в поле зрения по сравнению с показателями, полученными при исследовании печени крыс 2-й группы.

устанавливали уровни содержания в образцах Fe, Zn, Ag.

В печени животных, получавших базисную терапию (1 группа), в ходе микроанализа образцов материалов выявлены следующие уровни со-

Таблица 1

Морфометрические показатели печени крыс опытной и контрольной группы

Группа Статистич. показатель Площадь, мкм Количество

ядра цитоплазмы клеток Купфера (в поле зрения) гепатоцитов в балке

I Х" 116,37+6,65 1151,02+44,41 50,63+1,73 17,38+0,68

II Х" 168,09+6,21* 679,2 +23,42* 37,13 +1,37* 22,88 +0,64*

Примечание: * - статистически значимые достоверные различия по сравнению с показателями первой группы, Р<0,001

держания в массовых долях: Fe - 0 %, ^ - 5,45 %, Zn - 2,83 %, Ag - 0 %. У животных 2-й группы: Fe - 0 %, ^ -4,61 %, Zn - 1,95 %, Ag - 0 %.

Вопрос о физиологической роли серебра изучен недостаточно. Большинство ученых относят серебро к потенциально-токсичным и к потенциально-канцерогенным элементам [8]. Известно, что в организме серебро образует соединения с белками, может блокировать тиоловые группы ферментных систем, угнетать тканевое дыхание. При длительном контакте с серебром в производственных условиях этот элемент может накапливаться в печени [8]. Использование серебра в виде наночастиц предупреждает развитие осложнений, так как показано, что токсичность металлов в атомарном состоянии во много раз меньше, чем в ионном, полученном с применением солей [3]. С другой стороны, биоцидные свойства наноча-стиц меди, серебра, выражены только в отношении микроорганизмов [4].

Гистологическое исследование ткани печени крыс показало наличие морфологических изменений разной степени выраженности. Изучение морфометрических показателей печени выявило достоверное различие всех характеристик - средней площади ядра и цитоплазмы, количества клеток Купфера и гепатоцитов в печеночной балке. Ядерно-цитоплазматическое соотношение в I группе животных со-

ставило 0,1, во II группе - 0,25. Существенная разница в показателях ядра и цитоплазмы в исследуемых группах можно объяснить наличием выраженной баллонной дистрофии гепатоцитов крыс, получавших только базисную терапию. Средняя площадь ядра у животных I группы свидетельствует об угнетении синтетических процессов в клетках печени. Уменьшение количества гепатоцитов в печеночных балках в условиях базисной терапии, по-видимому, обусловлено их повреждением токсинами условно патогенных бактерий и воспалительным процессом, увеличение же количества звездчатых макрофагов (клеток Купфера) является показателем напряженности фагоцитоза, что может быть связано с утилизацией продуктов распада клеточных структур и микробных организмов. Таким образом, в 1 -й группе преобладали явления неспецифического гепатита умеренной активности, а во 2-й активность воспалительного процесса в исследуемом органе была незначительной или минимальной.

Полученные результаты СЕМ с микроанализом состава микроэлементов в исследуемых образцах показывают наличие меди и цинка в постоянных концентрациях. Наличие серебра и железа в исследуемых образцах печени не было выявлено. При многоточечном исследовании (п=20) микроэлементов путем СЭМ с микроанализом, результаты не отличались от тех,

которые были получены при сканировании по линии.

Выводы

1. Активность воспалительного процесса и выраженность морфологических изменений в печени при моде-лированнии острой кишечной инфекции в группе животных, которые получали наноаквахелат серебра, снижается, что свидетельствует о позитивном эффекте исследуемого препарата по сравнению с базисной терапией.

2. По результатам сканирующей электронной микроскопии с микроанализом накопления серебра в ткани печени не происходит.

Литература

1. Бондаренко В.М. Идеи И.И. Мечникова и современная микроэкология кишечника человека /

B.М. Бондаренко, В.Г. Лиходед // Журн. микробиологии. - 2008. - № 5. -

C. 23-29.

2. Возианова Ж.И. Диарееген-ные кишечные палочки / Ж.И. Возиа-нова // Сучасш шфекцп. - 2008. - № 3. - С. 4-9.

3. Использование биологически активных препаратов на основе наноча-стиц металлов в медицине и сельском хозяйстве / И.П. Арсентьева [и др.] // Индустрия наносистем и материалы: оценка нынешнего состояния и перспективы развития. - М.: Центр «Открытая экономика», 2006. - С. 26-33.

4. Каплуненко В.Г. Эрозионно-взрывные нанотехнологии на основе нового физического явления / В.Г. Каплуненко, Н.В. Косинов // Вюник Запорiзького нащонального ушверси-тету. - 2008. - №2. - С. 80-84.

5. Копча В.С. Корекщя мшробюценозу при лшуванш гострих кишкових шфекцш / В.С. Копча, С.А. Деркач // 1нфекцшш хвороби. - 2008. -№ 2. - С. 31-37.

6. Микроскопическая техника: руководство для врачей и лаборантов / под ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Перова. - М.: Медицина, 1996. - 542 с.

7. Нанотехнологл, наномедици-на: перспективи наукових дослщжень та впровадження !х результат у медичну практику / Л.Г. Розенфельд [та ш.] // Украшський медичний часо-пис. - 2008. - № 5 (67). - С. 63-68.

8. Скальный А.В. Биоэлементы в медицине / А.В. Скальный, И.А. Рудаков. - М.: Издат. дом «Оникс 21 век»: Мир, 2004. - 272 с.

9. Ткаченко А.В. Морфофунк-циональные изменения в печени крыс при экспериментальной гипокинезии / А.В. Ткаченко, Г.И. Губина-Вакулик // Буковинський медичний вюник. -2006. - Т. 10, №2. - С. 111-114.

10. Чекман 1.С. Бiохiмiчний мшмум. Наночастинки: властивосп та перспективи застосування / 1.С. Чекман // Украшський бiохiмiчний журнал. - 2009. - Т. 81, № 1. - С. 122-129.

11. Farah A.A. Chemically stable silver nanoparticle-crosslinked polymer microspheres / A.A. Farah, R.A. Al-

zarev-Puebla, H. Fenniri // Colloid Interface Science. - 2008. - Vol. 319, №2. -P. 572-576.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ

Половьян Екатерина Сергеевна - аспирант кафедры инфекционных болезней с эпидемиологией, курсом микробиологии, вирусологии и иммунологии медицинского института Сумского государственного университета.

Тел.: +380505018850.

E-mail: keetys@rambler.ru.

Москаленко Роман Андреевич - ассистент кафедры патоморфологии медицинского института Сумского государственного университета.

40007, г. Сумы, ул. Мира, 25.

Тел.: +380979802731.

E-mail: eriugen@ukr.net.

Романюк Анатолий Николаевич - д-р мед. наук, проф., зав. кафедрой патоморфологии медицинского института Сумского государственного университета.

40022, г. Сумы, ул. Привокзальная, 31.

Тел.: +380956006435.

E-mail: pathomorph@gmail.com.

Чемич Николай Дмитриевич - д-р мед. наук, проф., зав. кафедрой инфекционных болезней с эпидемиологией, курсом микробиологии, вирусологии и иммунологии медицинского института Сумского государственного университета.

40021, г. Сумы, ул. 20 лет Победы, 15.

Тел.: +380506310579.

E-mail: chemych@gmail.com.

Бончев Сергей Дмитриевич - аспирант кафедры нормальной анатомии медицинского института Сумского государственного университета.

40030, г. Сумы, ул. Санаторная, 31.

Тел.: +380951030027.

E-mail: Bonchev_sd@ukr.net.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.