Морфология и оптимизация условий получения рецепторного слоя пьезокварцевого ДНК-сенсора Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

УДК 577.1

МОРФОЛОГИЯ И ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПОЛУЧЕНИЯ РЕЦЕПТОРНОГО СЛОЯ ПЬЕЗОКВАРЦЕВОГО ДНК-СЕНСОРА

О.Ю. Шашканова, О.В. Воронежцова,Т.Н. Ермолаева

Липецкий государственный технический университет, г. Липецк, ул. Московская д.30, e-mail: ermolaeva@stu.lipetsk.ru.

Эффективность работы пьезокварцевого ДНК - сенсора в значительной степени определяется характеристиками биорецепторного слоя. Изучены условия иммобилизации денатурированной и на-тивной ДНК на поверхности электродов пьезокварцевых резонаторов. Показано, что пришивка ДНК на подложку из Y-аминопропилтриэтоксисилана с помощью глутарового альдегида, а также закрепление ДНК за счет аффинной системы авидин - биотин на частицах коллоидного золота диаметром 5 нм обеспечивает получение покрытия с высокой концентрацией и доступным пространственным расположением «сайтов связывания» с анти - ДНК. Ил. 4. Табл. 2. Библиогр. 7 назв

Ключевые слова: пьезокварцевый ДНК-сенсор, антитела к ДНК, иммобилизация, наночастицы золота.

MORPHOLOGY AND CONDITION OPTIMIZATION OF PIEZOELECTRIC DNA-SENSOR RECEPTOR LAYER PRODUCING

O.Yu. Shashkanova, O.V. Voronezhtseva, T.N. Ermolaeva

Lipetsk State Technical University,

30, Moscow St., Lipetsk, 398600 Russia, ermolaeva@stu.lipetsk.ru.

The efficiency of piezoelectric DNA - sensor is largely determined by the characteristics of the bioreceptor layer. The conditions for immobilization of denatured and native DNA on the electrode surface of piezoelectric resonators were studied. It was shown, that DNA binding on a Y-aminopropyltriethoxysilane substrate with glu-taraldehyde, and with avidin - biotin affinity complex on the particles of colloidal gold with a diameter of 5 nm provides coating with high concentration and available spatial arrangement of "binding sites" with the anti -DNA.

4 figures. 2 tables. 7 sources.

Keywords: piezo quartz DNA - sensor, antibodies of DNA, immobilization, gold nanoparticles.

ВВЕДЕНИЕ

Пьезокварцевые биосенсоры являются удобным инструментом для проведения биохимических и клинических исследований, сертификации пищевых продуктов и фармацевтических препаратов, мониторинга объектов окружающей среды [1,2]. Аналитическим сигналом служит уменьшение частоты колебаний при образовании биокомплекса на поверхности его электрода. Поэтому необходимым условием при разработке пье-зокварцевых сенсоров является получение на поверхности электрода прочного, конформационно доступного биоселектирующего покрытия. Качество рецепторного слоя зависит от природы подложки и кросс-реагента, технологии процесса иммобилизации, а также свойств применяемых биореагентов, в качестве которых могут быть использованы ферменты, антитела или антигены, молекулы ДНК. Создание ДНК-сенсоров актуально для ранней диагностики таких заболеваний, как ревматоидный артрит, системная красная волчанка, хронический гломерулонефрит, сопровождающихся повышением уровня специфических биомаркеров (антител к ДНК) в плазме крови.

При разработке методики иммобилизации ДНК на поверхности золотого электрода пье-зокварцевого сенсора необходимо добиваться сохранения высокой активности и равномерного распределения рецепторных молекул по всей поверхности электрода, физической и химической устойчивости покрытия при контакте с жидкостью, минимальной толщины и массы слоя [3].

Цель настоящего исследования - изучение условий формирования рецепторного слоя ДНК-сенсора, включающего получение подложки на основе самоорганизующихся монослоев серосодержащих соединений или силоксана, аффинного авидин-биотинового комплекса, тиолированных наночастиц золота. Применение методов пье-зокварцевого микровзвешивания и атомной силовой микроскопии позволяет поэтапно контролировать приращение массы и изменение морфологии поверхности для выявления и обоснования оптимального способа иммобилизации молекул ДНК.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Рецепторными молекулами сенсора служили молекулы денатурированной ДНК цыпленка, предоставлено |В.Г. Винтером| (Казанский государственный университет), человека (Roche, Германия) и тимуса крупного рогатого скота (Merck, Германия). Все растворы иммунореагентов были приготовлены на фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS), pH 7,2: NaCl (8,015 г); KCl (0,201 г); Na2HP0412H20 (2,864 г); КН2Р04 (0,204 г) смешивали и доводили бидистиллиро-ванной водой до одного литра.

Денатурацию ДНК осуществляли при нагревании водного 0,1% раствора ДНК (2 мл) в тече-

ние 10 мин при 100 оС и резком введении предварительно замороженного PBS (1 мл).

Для получения подложек были использованы конканавалин А - Con A (Sigma, США), Y-аминопропилтриэтоксисилан - APTS ('КеапаГ, Венгрия), меркапто-пропионовая кислота - MPA, 11-меркаптоундеканол - 11-MUD, поли-Ь-лизин, авидин и биотин (Sigma, США). В качестве кросс-реагентов применяли - глутаровый альдегид-GA ('КеапаГ, Венгрия), 1-этил-3-(3-диметиламинопропилкарбодиимид) - EDAC и N-гидросукцинимид (Sigma, США) - NHS.

Для биотинилирования ДНК к 1 мл раствору денатурированной ДНК (1 мг/мл) при постоянном перемешивании добавляли 100 мкл по 25 мкл через 30 мин раствора биотина (10 мг/мл) и инкубировали смесь в течение 2 ч при температуре +22 °С, а затем в течении 12 ч при +4 °С.

Иммобилизацию ДНК осуществляли следующими способами:

Способ 1. На поверхность электрода резонатора наносили 5 мкл 11- MUD и выдерживали 30 мин при комнатной температуре и 12 ч при 4 оС, промывали раствором PBS и наносили 5 мкл ДНК (1 мг/мл).

Способ 2. На золотые электроды наносили 1 мкл MPA (0,1%-ный раствор в этиловом спирте) и выдерживали 12 ч при температуре 22-23 °C, промывали этиловым спиртом и добавляли по 5 мкл 2%-ный раствор EDAC в ацетонитриле (способ 2.1) или 2 мМ раствор NHS в этиловом спирте (способ 2.2), выдерживали 20 мин при комнатной температуре, промывали буферным раствором и наносили 5 мкл раствора ДНк (1 мг/мл). Сенсор помещали во влажную камеру и выдерживали 12 ч при 4 °С.

Способ 3. На поверхность золотого электрода наносили раствор Con A объемом 10 мкл (5 мг/мл в PBS) и выдерживали два часа при температуре 22-23 °C и 12 ч в при 4 °C, промывали PBS для удаления несвязавшихся молекул белка и наносили по 5 мкл бифункционального реагента [2,5%-ный свежеприготовленный раствор GA в биди-стиллированной воде (способ 3.1) или 2%-ный раствор EDAC в этиловом спирте (способ 3.2)], выдерживали 20 мин, затем 5 мкл раствора ДНК (1 мг/мл).

Способ 4. Поверхность электрода пьезоквар-цевого резонатора обрабатывали 0,8 мкл 2,5%-го раствора APTS в ацетоне, высушивали на воздухе и выдерживали 20 мин при 90 °С. Затем наносили 15 мкл свежеприготовленного 2,5%-ного раствора GA (способ 4.1) или 2%-ный раствор EDAC в ацетонитриле (способ 4.2) и раствор ДНК (1мг/мл). Иммуносенсор помещали во влажную камеру, насыщенную парами GA и выдерживали 12 ч при 4 оС.

Способ 5. На поверхность электрода наносили 5 мкл авидина и выдерживали 12 ч при 4 оС, добавляли биотинилированную ДНК (1 мг/мл) и вновь помещали во влажную камеру при 4 оС на 12 ч.

Способ 6. На поверхность кварца помещали 1 мкл спиртового раствора MPA с концентрацией 1 мкг/мл, выдерживали 30 мин., наносили 1 мкл смеси NHS и EDAC (1 мкг/мл), выдерживали 30 мин при комнатной температуре, наносили 0,6 мкл раствора авидина (1 мкг/мл) и помещали на 24 ч в холодильник при температуре 4 °С. Затем помещали на поверхность слоя 0,8 мкл раствора комплекса ДНК-биотин (1 мг/мл). Иммуно-сенсор выдерживали во влажной камере в течение 12 ч при 4 оС.

Способ 7. На поверхность электрода наносили 5 мкл раствора поли-Ь-лизина (1 мг/мл) и выдерживали в течение 12 ч при 4 оС, добавляли 5 мкл раствора ДНК (1 мг/мл). Сенсор помещали во влажную камеру и выдерживали 12 ч при 4 °С.

Способ 8. На электрод пьезокварцевого резонатора наносили 5 мкл раствора золотых тиоли-рованных наночастиц диаметром 5 нм (4 мМ) и выдерживали 30 мин, промывали раствором PBS и добавляли 5 мкл ДНК (1 мг/мл).

Способ 9. Аналогично способу 5, но предварительно на поверхность электрода наносили 5 мкл раствора тиолированных наночастиц золота диаметром 5 нм (4 мМ) и выдерживали 30 мин.

Исследования проводили на установках, собранных из стандартных блоков [3] и приборе QCM-200 (SRS, США), используя программное обеспечение LabVIEW StandAlone (National Instruments, USA). Физическим преобразователем сенсора служили резонаторы АТ-среза с собственной частотой колебаний 10 МГц с электродами диаметром 5 мм (ЗАО «ЭТНА», Россия), а так же кварцевые кристаллы производства Stanford Research Systems, США (собственная частота колебаний 5 МГц, площадь поверхности электрода 5,06 см2).

Характеристику покрытий на основе ДНК, определяющих стабильность работы сенсора, осуществляли с учетом следующих показателей: массы биорецепторного покрытия (Am, мкг), рассчитанной по уравнению Заурбрея: AF = - 2,3^0^10-6Ат/А, где AF - изменение частоты колебаний кристалла, Гц, F0 - собственная частота колебаний кристалла, МГц, А - площадь по-

2

верхности электрода, см ; концентрационной чувствительности (Sc, Гцмлмкг-1), показывающей изменение частоты колебаний сенсора (AF ) при контакте с 1 мкг/мл анти - ДНК; числу циклов измерений (N), в которых AF снижается не более чем на 5%.

Исследование поверхности золотых электродов, формируемых тонких пленок проводили методом атомной силовой микроскопии при комнатной температуре с помощью сканирующего зондо-

вого микроскопа высокого разрешения SOLVER P47 Pro (ЗАО «Нанотехнология-МДТ», Зеленоград, Россия) в режиме прерывистого контакта на воздухе с использованием кантилеверов NSGO 1/20 (Зеленоград, Россия) из кремния с номинальной жесткостью 5 Н/м, резонансной частотой сканирования в диапазоне 120-180 кГц и радиусом закругления 10 нм. Получены 2D, 3D - изображен ия поверхности и рассчитаны средние коэффициенты шероховатости (Ra) с применением программного обеспечения NOVA.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Эффективность работы пьезокварцевого ДНК-сенсора в значительной степени определяется параметрами биорецепторного слоя. Поверхность золотого электрода пьезокварцевого резонатора, полученного методом магнетронного напыления, имеет значительную шероховатость, что может быть причиной неоднородности рецеп-торного слоя. Для выравнивания поверхности и повышения адгезии во всех изученных способах присутствует стадия получения подложки, затем на нее с помощью бифункциональных реагентов пришивались молекулы ДНК. Методом пьезоквар-цевого микровзвешивания определяли массу подложки (тпод,) и массу иммобилизованных молекул ДНК (тднк), а методом атомной силовой микроскопии регистрировали изменение морфологии поверхности. Поверхностную концентрацию кон-формационно доступных молекул ДНК оценивали с помощью величины Sc, рассчитанной с учетом значения аналитического сигнала сенсора, зарегистрированного при связывании рецепторного слоя с анти-ДНК. Путем многократных измерений на одном рецепторном слое устанавливали значение N.

Характеристики изменения массы, концентрационной чувствительности и шероховатости поверхности рецепторного слоя приведены в табл. 1.

Серосодержащие соединения наиболее часто применяются для создания промежуточной прослойки при иммобилизации биомолекул и обеспечивают прочную связь с поверхностью золотого электрода за счет якорных групп, содержащих а т о м ы с е р ы , формируют плотно упакованные самоорганизующиеся монослои со строгой ориентацией (практически параллельно друг к другу). Использование 11-MUD (способ 1) и MPA (способы 2.1 и 2.2) способствует получению покрытий невысокой массы, выравниванию поверхности, что сопровождается снижением средней шероховатости с Ra=56 нм до Ra=34 нм для MPA (рис.1) и до 18 нм для 11-MUD.

При активации MPA бифункциональным реагентом отмечается возрастание шероховатости и появление равномерно расположенных выпуклых структур, способствующих увеличению общей площади поверхности и числа активных центров

Таблица 1

Изучение условий форми рования рецепторного слоя ДНК-сенсора (n = 3; P = 0,95)

№ способа 1Т1под, МКГ Тднк, мкг Sc, Гцсм2мкг-1 Ra, НМ N

1 8,6 3,5 13,8 40±5 9

2.1 10,3 2,3 18,2 26±4 12

2.2 9,8 6,0 16,6 24±3 15

3.1 14,7 12,6 8,6 - 18

3.2 16,3 11,8 8,6 - 21

4.1 34,9 26,4 23,3 21 ±3 20

4.2 26,0 22,1 18,5 60±7 16

5 19,0 7,4 14,0 26±3 8

6 17,1 15,1 17,9 25±4 12

7 10,7 27,2 18,4 22±2 5

8 9,5 5,7 15,4 30±5 12

9 21,9 28,1 26,3 20±2 18

для присоединения рецепторных молекул, повышению концентрационной чувствительности биослоя (табл.1). Недостатком таких покрытий является относительно невысокая устойчивость при эксплуатации в жидкости (возможно лишь 8-15 циклов измерений без разрушения слоя). Несмотря на то, что на подложке из Con A (способы 3.1 и 3.2) происходит закрепление достаточно большого числа молекул ДНК (тдНК примерно в 2 раза больше, чем на серосодержащих пленках), наблюдается снижение числа доступных активных сайтов связывания, что может быть связано как с морфологией поверхности, так и с меньшей доступностью терминальных карбоксильных и ами-но- групп, заключенных внутрь белковых глобул, что подтверждают низкие значения SG.

С применением способов 4.1 и 4.2 были получены покрытия с оптимальными характеристиками концентрационной чувствительности и устойчивости (табл. 1). Подложка на основе APTS характеризуется высокой адгезией к поверхности золотого электрода, упорядоченным расположением и пространственной доступностью функциональных групп для закрепления рецепторных молекул. Природа кросс-реагента, определяющая как прочность закрепления рецепторных молекул, так и длину линкерной «ножки», также оказывает влияние на эффективность взаимодействия ре-цепторных молекул ДНК с антителами. Применение EDAC (способ 4.2) значительно увеличивает шероховатость (Ra=60 нм) и уменьшает концентрационную чувствительность по сравнению с использованием GA (табл. 1), что связано с образованием укороченной линкерной «ножки» (рис. 2), что является причиной неупорядоченного закрепления большого количества молекул ДНК, недо-

ступных для связывания с антителами из-за пространственных затруднений. Использование в качестве кросс-реагента ОА способствует формированию более длинной и гибкой «ножка» и, следовательно, обеспечивает большую конформацион-ную подвижность близко расположенных молекул ДНК за счет свободного вращения вдоль а-связей дополнительных метиленовых групп бифункционального реагента и более эффективное связывание с молекулами антител.

Биорецепторный слой на основе аффинного авидин-биотинового комплекса (способ 5) [5] генерируется при прикреплении биотинилированных молекул ДНК к поверхности электрода сенсора, модифицированной авидином (рис. 3а).

Биотинилирование осуществляется при взаимодействии аминогрупп молекул ДНК с карбоксильными группами биотина, который связываясь с макромолекулой сохраняет способность вступать в реакцию с активным центром авидина. Энергия связи авидина с биотином существенно выше (константа аффинности 1015 М-), чем ави-дина с поверхностью золотого электрода, что может быть причиной отрыва иммунокомплекса от поверхности сенсора вместе с подложкой и сокращения срока его службы. Кроме того, низкие значения концентрационной чувствительности и массы иммобилизованной ДНК при достаточно тяжелой подложке (табл. 1) свидетельствуют о невысокой концентрации рецепторных молекул на поверхности.

Скорость отдельных стадий формирования рецепторного слоя и связывания с анти-ДНК может существенно различаться. Изучение кинетики генерирования биослоя, включающего закрепление молекул ДНК на подложке МРА и авидина

поверхность МРА МРА + EDAC + EDAC + DNA

золотого электрода 1^=33,5*3.1 нм FL=39,5±2,7 нм f^=25,8±4,4 нм

Sc=18,2 Гцсм нг-1

Рис. 1. Изменение рельефа поверхности пьезокварцевого сенсора при иммобилизации ДНК на

подложку MPA с помощью EDAC.

поверхность золотого электрода

APTS + GA +DNA Rj 20,6+3,1 нм St=2 3.3 Гц" см'нг"1

АРТЗ RJ21,2±0,4hm

APTS + ED АС + DNA %59,9±6,7 нм Sc= 1 8,5Гцхмнг-1

Рис. 2. Изменение морфологии поверхности пьезокварцевого сенсора при иммобилизации ДНК на подложку АРТБ и применения бифункциональных реагентов

с применением биотинилированной ДНК (способ 6), показало, что образование самоорганизованного слоя осуществляется с максимальной скоростью за счет координации тиогрупп MPA с золотой поверхностью электрода пьезокварцевого резонатора. (рис. 4).

Скорость остальных стадий, определяемая по тангенсу угла наклона касательной к соответствующему участку графика (рис. 4), ниже, за исключением аффинной реакции ДНК - анти-ДНК. Использование одновременно двух бифункциональных реагентов (NHS + EDAC) позволяет увеличить массу иммобилизованной ДНК по сравнению со способами 2.1 и 2.2. В тоже время, повышения чувствительности по сравнению с этими способами не происходит, что свидетельствует о взаимодействии с антителами не всех молекул ДНК поверхностного слоя вследствие стерических затруднений. Аналогичные закономерности выявлены и при формировании подложки на основе п-L-лизина (способ 7).

Для увеличения площади активной поверхности электрода были использованы тиолированные наночастицы золота, полученные согласно [6] (способы 8, 9). Наибольшее значение аналитического сигнала наблюдается при применении нано-

частиц золота диаметром 5 нм, способствующих максимальному возрастанию общей поверхности электрода, поскольку доля атомов в поверхностном слое существенно выше по сравнению с частицами большего диаметра [7]. Закрепление на-ночастиц золота на первой стадии иммобилизации способствует выравниваю поверхности (Ра =20±2 нм) и получению более упорядоченных структур, повышению интегральной концентрационной чувствительности (до 26 Гц см2 мкг-1), вследствие размещения большого количества биомолекул на поверхности электрода и их функциональной активности для последующего взаимодействия с антителами. Такой способ иммобилизации позволяет осуществлять детектирование антител к ДНК на уровне 0,005 мкг/мл. Изучено влияние природы ДНК (цыпленка, крупного рогатого скота и человека) на величину концентрационной чувствительности (табл. 2). Отмечено, что закрепление денатурированных молекул ДНК крупного рогатого скота и человека приводит к формированию более гибких структур, по сравнению с нативными двуните-выми молекулами ДНК тех же размеров, что создает условия для более легкого взаимодействия с антителами к ДНК.

Как видно из приведенных данных, наиболь-

Рис. 3. Схема иммобилизации молекул ДНК через аффинный комплекс авидин-биотин на поверхности золотого электрода (а) - способ 5 и на наночастицах золота (б) - способ 9

Рис. 4. Изучение процесса иммобилизации ДНК в режиме реального времени: 1 - меркаптопропионовая кислота; 2 - NHS + EDAC; 3 - авидин; 4 - биотинилированная ДНК; 5 - проба, содержащая антитела к ДНК

Таблица 2

Зависимость аналитического отклика сенсора от природы ДНК (п=3; Р = 0,95)_

ДНК Нативная S,Гц■мл/мкг Денатурированная S,Гц■мл/мкг

Цыпленка 36,9 19,6

Крупного рогатого скота 10,6 11,6

Человека 41,0 41,7

шее сродство к анти-ДНК выявляется при использовании денатурированной ДНК человека, о чем свидетельствуют более высокие значения коэффициента чувствительности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Применение методов пьезокварцевого микровзвешивания и атомной силовой микроскопии позволило выявить наиболее оптимальный способ формирования биораспознающего слоя ДНК-

сенсора при иммобилизации молекул денатурированной ДНК на ДРТБ с помощью бифункционального реагента - ОД, а также молекул биотинили-рованной ДНК на подложке из авидина с применением частиц коллоидного золота, диаметром 5 нм. Данные методы позволяют повысить чувствительность определений антител к ДНК и могут быть использованы при определении антител к ДНК.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК

1. Возможности пьезокварцевых иммуносенсоров для выявления инфекций и ранней клинической диагностики. Кн. Проблемы аналитической химии: Химический анализ в медицинской диагностике / Казанский гос. университет. Ермолаева Т.Н., Калмыкова Е.Н.; отв. ред. Г.К. Будников // М.: Наука. 2010. Глава 2.2. Т. 11. С. 212243.

2. Ермолаева Т.Н., Калмыкова Е.Н., Шашканова О.Ю. Пьезокварцевые биосенсоры для анализа объектов окружающей среды, пищевых продуктов и для клинической диагностики // Рос. хим. журн. 2008. Т. LII. № 2. С. 17-29.

3. Ермолаева Т.Н., Калмыкова Е.Н. Пьезокварцевые иммуносенсоры. Аналитические возможности и перспективы // Успехи химии. 2006. Т.75. № 5. C. 445-459.

4. Chemical derivatization of self-assembled 3-mercaptopropionic and 16-mercaptohexadecanoic acids at platinum surfaces with 3-aminopropyltrimethoxysilane: a

spectroscopic and electrochemical study / Brito R. [and other] // J. Electroanal. Chem. 2003. V.540. P.53-59.

5. Studies on biotin-avidin indirect conjugated technology for a piezoelectric DNA sensor / Gao, Z.X. [and others] // International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 2004. V 84 (8). P. 599-606.

6. Шашканова О.Ю., Ермолаева Т.Н. Новый метод диагностики аутоиммунных заболеваний, основанный на аффинной реакции на поверхности пьезокварцевого сенсора. 1. Изучение условий синтеза золотых наноча-стиц различного размера в присутствии поверхностно-активных веществ // Сорбционные и хроматографиче-ские процессы. 2009. Т. 9. № 5. С. 677 - 684.

7. Шашканова О.Ю., Ермолаева Т.Н. Применение золотых наночастиц для усиления сигнала пьезокварцевого иммуносенсора // Заводская лаборатория. 2010. № 3. С.37-40.

Поступило в редакцию 17 мая 2012 г После переработки 13 июля 2012 г