CC BY
55
УДК 581.4:582.28
МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕМ СЕМЕЙСТВА EREMOTHECIACEAE
Пензенский государственный университет, 440026, г. Пенза, ул. Красная, 4 о
Е.Ф. Семенова А.И. Шпичка
Выявлены макро- и микроморфологические особенности 2 видов семейства Eremotheciaceae. В сравнительном аспекте дана морфологическая характеристика мицелия на разных стадиях роста и развития.
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: Eremothecium ashbyi Guilliermond,
Eremothecium gossypii Kurtzman, макро- и микроморфология, культура in vitro.
Введение
Как известно, представители семейства Егешо^емасеае являются фитопатогенами, они развиваются на плодах, вызывая так называемые стигматомикозы. Виды рода Eremothecium паразитируют на коробочках хлопчатника и образуют мицелий ярко-желтого цвета, обусловленного накоплением рибофлавина. Промышленные штаммы E. ashbyi и E. gossypii являются сверхсинтетиками витамина В2 [1]. Кроме того, было обнаружено, что виды рода Eremothecium также способны синтезировать эфирное масло, основными компонентами которого являются гераниол (69,5.84,9 %) и в-фенилэтанол (12,7.27,7 %), а минорными - нерол, цитронеллол, нераль и гераниаль, что свидетельствует о сходстве изучаемого масла с эфирным маслом из свежих цветков розы. Количество эремотециевого масла достигает 180 мг/л культуральной жидкости в течение первых двух суток роста на ферментационной среде, что сопоставимо с содержанием розового эфирного масла в 500.600 г ферментированных цветков [2-5].
Целью данного исследования является изучение макро- и микроморфологиче-ских особенностей некоторых видов семейства Eremotheciaceae.
Объектами исследования служили штаммы Eremothecium ashbyi Guilliermond 1935 BKM F-124, ВКМ F-3009 (мутант, получен селекционным путем из штамма BKM F-124) и Eremothecium gossypii (S.F.Ashby et W.Nowell 1926) Kurtzman 1995 (синоним Ashbya gossypii (S.F.Ashby et W.Nowell 1926) Guilliermond 1928) BKM F-1398, BKM F-3276 (мутант, получен путем отбора из штамма BKM F-1398), BKM F-3296. Данные микроорганизмы относятся к царству Fungi, типу Ascomycota, классу Endomycetes, порядку Saccharomycetales, семейству Eremotheciaceae [6,7].
Изучаемые штаммы поддерживали на скошенной агаризованной среде, содержащей соевую муку (4%) и сахарозу (1%) [5], сусло-агаре, агаре Сабуро, картофельно-глюкозном агаре, мясо-пептонном агаре, среде Чапека, питательном агаре [1]. Морфологию поверхностных культур исследовали под микроскопом БИОМЕД-3 (кратность увеличения 10, 40, 100) в окрашенных метиленовым синим, черной тушью микропрепаратах. Фотографирование осуществляли аппаратом Panasonic DMC-FX100 с объективом Lumix 12 mega pixels.
Макроморфология. E. ashbyi на твердой агаризованной среде образует плоские матовые (позднее глянцевые) колонии желтого цвета, легко снимающиеся с агара. Форма колоний округлая, диаметром 8.12 мм (на сусло-агаре через 3 сут. роста при 27±1°С). На мясо-пептонном, питательном агарах и агаре Сабуро пигментация изучае-
Объекты и методы исследования
Результаты и обсуждение
мых штаммов менее выражена по сравнению с глюкозо-картофельным агаром, сусло-агаром, средой Чапека.
Следует отметить, что популяция штамма E. аshbyi ВКМ F-124 была наиболее гетерогенна, по сравнению с другими изучаемыми штаммами, по некоторым морфологическим показателям отдельных колоний (диаметру, пигментации и др.).
E. gossypii образует колонии, которые на сусло-агаре, картофельно-глюкозном агаре, среде Чапека с кукурузным экстрактом через 3 суток роста при температуре 27±1°С достигают 6 мм, пигментированы, желтого цвета с четким краем. Форма колоний округлая, они плоские, матовые, плотные, с агара легко снимаются петлей в виде пленки. Спустя 10 суток светло-желтые, слегка выпуклые в середине, с поверхностноразбросанным бесцветным краем. Пигмент (рибофлавин) окрашивает среды в желтокоричневые тона. Рост по штриху на среде Чапека - скудный, сусло-агаре, картофель-но-глюкозном агаре - умеренный, на среде Чапека с кукурузным экстрактом, питательном агаре - хороший.
Микроморфология. E. ashbyi имеет дихотомически ветвящийся мицелий, состоящий из многоядерных клеток, желтеющий с возрастом. Окраска мицелия обусловлена присутствием рибофлавина, который накапливается в таких количествах, что может выпадать в виде кристаллов в вакуолях. Диаметр гиф варьирует в пределах 2,5.16,5 мкм. При старении некоторые клетки становятся спорогенными. Конидии веретеновидные. Спорангии продолговатые, многоспоровые, в цепочках, но иногда и одиночные, б5-90х14-20 мкм, в них свободно расположены аскоспоры, которые высвобождаются и прорастают после разрыва оболочки аска. Споры булавовидноигольчатые, прямые или часто изогнутые, простые, часть споры сужается к концу и лишена гранул. Размеры аскоспор составляют: длина - 20,2.26,7 мкм, диаметр -2,5.2,8 мкм.
E. gossypii образует гифы, часто вакуолизированные и содержащие многочисленные включения, сначала несептированные, при старении септированные, дихотомически ветвящиеся. Вегетативное размножение осуществляется латеральными конидиями или поперечным расщеплением гифы. У некоторых штаммов участки гиф становятся раздутыми и толстостенными. Аски (спороносные сумки, спорангии) многочисленны, одиночные, в группах или цепочках, 100-200х10-20 мкм, вакуолизирован-ные или содержащие гранулированную протоплазму. Их форма от булавовидной до цилиндрической или более часто сигмоидальная. Аскоспоры параллельно сгруппированы в 2 или более грозди из 2 или 6, уложенные по длине аска; количество их составляет от 4 до 32 на аск. Размеры аскоспор - 25-37х2-5 мкм; форма от игловидных до веретеновидных, часто с тонкой септой в центре.
При культивировании изучаемых штаммов на твердых питательных средах существенных отличий микроморфологических показателей не наблюдалось. В вегетативных гифах суточной культуры (экспоненциальная фаза роста) присутствуют липо-сомы. Выраженная вакуолизация мицелия отмечается в период 36.48 часов культивирования. Спорогенез начинается при старении культуры, не ранее стационарной фазы (48.60 часов роста): аски с аскоспорами образуются интеркалярно, а почкующиеся клетки (конидии) - терминально или латерально на гифах мицелия. Сумки разрываются или автолизируются для высвобождения зрелых аскоспор, начиная со стационарной фазы роста и развития культуры.
В результате проведенного микроскопического анализа не было выявлено существенных отличий по микроморфологическим показателям между Eremothecium ashbyi, Eremothecium gossypii (Ashbya gossypii, Nematospora gossypii), что подтверждает предложенную Ки^7шап'ом таксономическую классификацию, основанную на результатах дивергенции последовательностей рибо-сомальной РНК и рибосомальной ДНК, и позволяет отнести их к одному роду семейства Eremotheciaceae [6,7].
Рис. 1. Мицелий в процессе развития: А - экспоненциальная фаза;
Б - фаза замедления роста; В - стационарная фаза;
Г - начало фазы отмирания (увеличение 4x100, окраска метиленовым синим)
Рис. 2. Аскопоры (увеличение: слева 4x40, справа 4x100; окраска метиленовым синим)
Рис. 3. Слева - толстостенные вздутия (выросты), расположенные латерально на гифах мицелия; справа - участок гифы мицелия с межклеточной перегородкой - септой (увеличение 4x100, окраска метиленовым синим)
Рис. 4. Липидные капли в гифах мицелия (увеличение 4x100, негативный способ окраски тушью)
Рис. 5. Слева - почкующиеся дрожжеподобные клетки; в центре - дихотомическое ветвление гифы мицелия; справа - веретеновидные конидии (увеличение 4x100, окраска метиленовым синим)
Таким образом, для изучаемый видов xарактерны следующие морфологические признаки: возможное при определенный условияx культивирования наличие почкую-щик, мультилатеральнык на тонком основании клеток шаровидной, яйцевидной, эллипсоидальной или цилиндрической формы; образование конидий и присутствие псевдогиф и истинным гиф; колонии гладкие или матовые белого или желтого цвета; аски содержат 4-32 веретеновидньк или игольчатые аскоспоры, часто изогнутые, имеющие центральную септу и иногда клиновидное, терминальное утолщение клеточной стенки, что согласуется с данными приведенными в научной литературе [2-4, 6,7].
Выводы
1. Макроморфологическими особенностями Eremothecium ashbyi являются более крупные (в 1,5-2 раза) по сравнению с Е. gossypii матовые колонии на твердый питательные средаx, которые становятся глянцевыми при культивировании свыше 3 суток.
2. В условияx поверxностного культивирования штаммов видов Eremothecium ashbyi и Eremothecium gossypii на твердые питательные средаx микроморфологиче-скиx отличий не выявлено; определены общие признаки: возможность наличия поч-кующл, мультилатеральным на тонком основании клеток шаровидной, яйцевидной, эллипсоидальной или цилиндрической формы; образования конидий и присутствия псевдогиф; наличия асков с веретеновидными или игольчатыми аскоспорами, часто изогнутыми и септированными.
3. Сравнительный макро- и микроскопический анализ показал, что не имеется существенные морфологических отличий между Егешоїкесіиш авЬЬуі, Егешоїкесіиш доввуріі (вуп. ЛвЪЪуа доввуріі, Мешаїоврога доввуріі), что подтверждает предложенную Кш17шап'ом таксономическую классификацию дрожжеподобнык и мицелиальнык грибов и позволяет отнести их к одному роду семейства ЕгешоїИесіасеае.
Список литературы
1. Билай В.И. Методы экспериментальной микологии. - Киев: Наукова думка, 1973- -
242 с.
2. А.с. 1454845 СССР. Штамм гриба Eremothecium ashbyi БКЫР-3009Д - продуцент эфирного масла / Семенова Е.Ф., Родов В.С., Бугорский П.С. (СССР) Заявл. 28.07.87. Опубл. 30.01.89, БИ № 4.
3. А.с. 1794948 СССР. Штамм гриба Ashbya gossypii BKMF - 3276Д - продуцент эфирного масла / Семенова Е.Ф., Бугорский П.С., Радзимовская С.Б. (СССР). Заявл. 23.08.90. Опубл. 15.02.93, БИ № 6.
4. О биосинтезе компонентов эфирного масла грибом Eremothecium ashbyi (структурнофункциональные особенности) / Погорельская А.Н., Бугорский П.С., Семенова Е.Ф., Бузулукова Н.П., Горнунг Е.И. // Вестник Российской академии с.-x. наук, 2003. - № 1.- С. 83-85
5. Семенова Е.Ф. Биосинтетическая активность и антимикробные свойства Eremothecium ashbyi Guill. // Известия вузов. Поволжский регион, 2007.-Серия «Медицинские науки», № 4.-С. 44 - 50.
6. The yeast, a taxonomic study. Ed. by Kurtzman С.Р., Fell J. W. Fourth Edition, Elsevier Sci-ence,1998. - 1055 p.
7. Kurtzman C.P. Relationships among the genera Ashbya, Eremothecium, Holleya and Nematospora determined from rDNA sequence divergence// Journal of Industrial Microbiology, 1995. - Vol.14.- P. 523-530.
MORPHOLOGICAL RESEARCH OF SOME REPRESENTATIVES OF FAMILY EREMOTHECIACEAE
E.F. Semenova JU.Shpichka
The Penza Slate University, 40, Krasnuyu St., Pen/a,
440026, Russia
e-mail: [email protected]
The macro- and micromorphological features of 2 species of family Eremotheciaceae. are revealed. The mycelium morphological characteristic on different stages of growth and development is given in comparative aspect.
Key words: Eremothecium ashbyi Guilliermond, Eremothecium
gossypii Kurtzman, macro- and micromorphology, culture in vitro.
