CC BY
25
МОРФОЛОГИЧЕСКИИ АНАЛИЗ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИИ ТАБАКА, СВЕРХЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕН CLAVATA3 A. THALIANA
© Э. З. Нургалеева1*, Б. Р. Кулуев2
1Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450076 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
E-mail: nurgaleewa. elina@yandex. ru 2Институт биохимии и генетики УНЦ РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.
Тел./факс: +7 (347) 235 60 88.
E-mail: [email protected]
С целью изучения молекулярных механизмов роста органов нами были получены трансгенные растения табака с конститутивной экспрессией гена CLAVATA3 A. thaliana. Трансгенные растения характеризовались снижением высоты стебля, уменьшением числа листьев и цветков, существенным увеличением размеров клеток в листьях и, соответственно, сокращением их количества, приходящегося на один орган. У опытных растений были уменьшены размеры апикальной меристемы побега и зачатков листьев, однако по площади листьев трансгенные растения почти не отличались от контроля. Полученные данные свидетельствуют в пользу существования в растениях компенсаторного механизма, направленного на сохранение размеров органов в пределах нормы.
Ключевые слова: CLAVATA3, трансгенные растения, апикальная меристема побега, клеточная пролиферация, конститутивная экспрессия.
Введение
Апикальная меристема побега может давать начало органам и вторичным меристемам на протяжении всей жизни растения. Стволовые клетки, локализованные в центральной зоне меристемы, активно делятся, смещая дочерние клетки к периферии, где они становятся частью зачатков органов и дифференцируются [1]. Под двумя слоями клеток центральной зоны L1 и L2 располагается организующий центр, который состоит из недифференцированных, но при этом митотически малоактивных стволовых клеток [1]. Правильное функционирование меристемы и сохранение стволовых клеток в центральной зоне достигается за счет согласованности процессов поддержания меристематической компетентности, деления клеток и их дифференци-ровки [1]. Гены CLAVATA (CLV1, CLV2, CLV3) являются негативными регуляторами клеточной пролиферации в апикальной меристеме побега, при этом мутанты арабидопсиса clv1, clv2 и clv3 фенотипиче-ски не различаются [2]. Продуктом гена CLV3 является небольшой секретирующийся в межклеточное пространство пептид, состоящий из 78 аминокислот, способный к транспорту по апопласту, при этом в зрелом состоянии он гликозилирован L-арабинозой и состоит из 12-ти аминокислот, которые составляют так называемый CLE-домен [3]. CLV3 относится к широко распространенным в растениях пептидам семейства CLE, которые иногда называют также гликопептидными фитогормонами [3]. CLV1 кодирует рецепторную киназу с внеклеточным лейцин-богатым повторяющимся рецепторным доменом и внутриклеточной серин/треонин-киназной областью. CLV2 кодирует белок с внеклеточным доменом, по-
хожим на домен CLV1, однако у этого белка отсутствует цитоплазматический киназный домен [2]. Было показано, что CLV3 связывается непосредственно с CLV1 [4], то есть, в конечном счете, продукт гена CLV3 является сигнальной молекулой, а продукт гена CLV1 является его рецептором. Недавно было обнаружено, что в передаче сигнала CLV3 важную роль играет мембрано-ассоциированная ки-наза CORYNE (CRN) [5]. Было показано, что сигнальный путь CLV3 включает как минимум два различных рецепторных комплекса, один из которых состоит из гомодимера CLV1, а второй из CLV2/CRN гетеродимера [5].
Известно, что CLV3 не только подавляет клеточную пролиферацию, но также стимулирует дифференцировку стволовых клеток [6]. В араби-допсисе конститутивная экспрессия гена CLV3 выражалась в том, что меристема побега прекращала закладку органов сразу же после появления первых листьев [7], лишь у части трансгенных растений меристема продолжала функционировать, побег формировался, но листья и цветки были уродливыми, а тычинки и плодолистики вообще не развивались. В других же видах растений проявления данного гена, вероятно, могут быть не столь катастрофичны, что могло бы позволить вырастить опытные растения и выявить отклонения в морфологических параметрах и подойти ближе к пониманию вопроса о регуляции клеточной пролиферации в апикальной меристеме побега и листьях. Кроме арабидопсиса одним из лучших модельных растений, легко поддающейся генетической трансформации является табак. В связи с вышесказанным цель данной работы заключалась в исследовании регуляции клеточной пролиферации в апикальной
* автор, ответственный за переписку
меристеме побега и выяснения взаимосвязи этого процесса с делением и дифференцировкой клеток в листьях трансгенных растений табака с конститутивной экспрессией гена CLV3 A. thaliana.
Материалы и методы исследования
В работе использованы бактерии E. coli штамма XLl-Blue и A. tumefaciens штамма AGL. Из плазмид использовали Т-вектор pKRX и бинарный вектор pCambia 1301 с геном устойчивости к гиг-ромицину и репортерным геном GUS (CAMBIA, Австралия). Ген CLAVATA3 был выделен из геномной ДНК арабидопсиса при помощи праймеров ClaF CACTCAGTCACTTTCTCTCT и ClaR GAAAATCATGAGATATAATAGTG. Для подбора праймеров и амплификации гена CLV3 арабидопси-са была использована последовательность под номером NM_128283 из GenBank. Для получения ам-пликонов с "тупыми" концами использовали Pfu ДНК-полимеразу (Сибэнзим, Россия), для "затупления" липких концов после рестрикции или амплификации использовали Т4-ДНК-полимеразу (Сибэнзим, Россия). Для поиска целевых клонов при лигировании в векторе pCambia 1301 использовали праймер 35SCambF: AGAGGACCTAACAGA-ACTCG в паре с праймером 1301R TGCTCTAG-CATTCGCCATTC. Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе "ABI PRISM 310 Genetic Analyzer" (Applied Biosystems, США). Трансгенные формы табака (Nicotiana tabacum L. Petit Havana SR-1) получали методом агробактериаль-ной трансформации листовых дисков, для получения которых использовали листья растений 3-х месячного возраста. Первичные трансгенные Т0-побеги отбирали на селективной среде (соли среды МС с добавлением 1 мг/л 6-БАП, 0,1 мг/л НУК), содержащей 25 мг/л гигромицина (Hyg). Качественную оценку активности репортерного гена GUS в листьях Т0-побегов определяли гистохимически, используя субстрат x-gluc [8]. Образцы ткани листьев инкубировали в течение ночи при 370C в 0.1% растворе X-Gluc (натриевая соль 5-бром-4-хлор-З-индолил^-О-глюкуроновой кислоты, Fermentas), содержащем 0.1 M натриевый фосфатный буфер (pH 7.0), 10 мМ Na2EDTA и 0.1% Triton X-100. После инкубации с гистохимическим реактивом в течение ночи, зеленые ткани отбеливались обработкой 70% этанолом и исследовались под стереомик-роскопом на наличие синей окраски. Все полученные Т0 GUS+ побеги каждого варианта укореняли в присутствии 25 мг/л Hyg, затем переносили в почвенную смесь, акклиматизировали к условиям све-топлощадки, доводили до цветения, самоопыляли и получали семена (Т1 потомство).
Для контроля наследования трансгенов и определения количества вставок, часть Т1 семян каждой полученной линии поверхностно стерилизовали последовательным погружением в 70% спирт, 5% раствор гипохлорита натрия, промывали в сте-
рильной дистиллированной воде и проращивали на среде MC с добавлением гигромицина в климатической камере Binder (Германия). Через 3 недели производили подсчет устойчивых и неустойчивых к селективному агенту сеянцев и определяли расщепление при наследовании гена селективного маркера. Результаты обрабатывали методом X по стандартной методике и выделяли для дальнейшей работы линии с одной интегрированной копией трансгенов. Интеграцию собственно целевого гена в растительные геномы определяли с помощью ПЦР анализа.
Наблюдение за растениями поколения Т осуществляли начиная от стадии появления корешков до получения семян, что занимало от 4 до 6 месяцев. На чашках Петри отмечали время появления корешков, семядолей, оценивали скорость роста и дружность всходов. Замеры величины листьев производили только после пересадки в почву, через каждые 15 дней (через 30, 45, 60 дней, и в период цветения), в итоге было осуществлено 4 замера. По каждому варианту (линия трансгенных растений) было отобрано по 5 растений, измеряли по три самых крупных нижних листа в длину, начиная от начала листовой пластины, по центральной жилке до самого кончика. Затем вычисляли среднее значение длины листа для каждого растения. Длину стебля определяли во время последнего замера, так как стебель у табака начинал активно расти только через 60 дней после акклиматизации. Отмечали время перехода к цветению, определяли длину цветка, начиная от цветоножки и заканчивая краем желобка венчика. При этом измеряли длину 3 цветков с каждого растения и вычисляли среднее значение. Определяли площадь 3 самых крупных нижних листьев и вычисляли среднее значение. Считали также количество цветков и листьев и определяли массу надземной части растения в период цветения. Для изучения влияния конститутивной экспрессии целевого гена на размер и количество клеток, проводили измерения площади клеток нижнего эпидермиса листьев одного возраста. Также определяли среднее число клеток, приходящихся на один лист и на 1 мм2 листовой поверхности. Измерения проводили при помощи универсального флуоресцентного микроскопа модели Axio Imager Ml (Carl Zeiss, Германия) с использованием оригинального программного обеспечения. Для приготовления срезов листьев и верхушки побега использовали микротом HM 325 (MICROM Laborgerate, Germany). Кроме сравнительной морфологической характеристики, из растений выделяли ДНК и проводили ПЦР. Растения трансгенных линий и контрольные растения культивировали в вегетационных сосудах объемом 450 мл, заполненных универсальным грунтом («Гера», Россия) на открытой светоплощадке при температуре 25-27 °С с фотопериодом 16/8 ч (свет/темнота) и освещенностью около 5 клк.
Рис. 1. Трансгенные растения табака с повышенной экспрессией гена ^ V3 арабидопсиса поколения Т0. а - контрольные растения линии №5, содержащие в геноме Т-ДНК вектора рСашЫа 1301. б - трансгенные растения табака линии №14, сверхэкспрессирующие ген CLV3 арабидопсиса. в - трансгенные растения табака линии №18, сверхэкспрессирующие ген
CLV3 арабидопсиса.
Результаты исследования
Для экспериментов по трансформации листовых дисков табака была использована генно-инженерная конструкция вектора pCambia 1301 с геном CLAVATA3 в сенс-ориентации. В результате проведенной агробактериальной трансформации листовых дисков табака был отобран 21 трансгенный побег, из которых успешно укоренились лишь 12. Репортерный ген GUS хорошо экспрессировал-ся в 6-ти отобранных растениях табака. 3 трансгенных растения с высоким уровнем экспрессии ре-портерного гена были акклиматизированы к условиям почвы. При выращивании поколения Т0 у двух растений (№14 и №18) были выявлены определенные морфологические особенности, такие как
закругление и пятнистость листьев, бледность их окраски, а также отставание в росте (рис. 1).
Экспрессия целевого гена была показана только для этих двух растений при помощи метода ОТ-ПЦР, причем размер ампликона совпадал с теоретически ожидаемым размером в 285 п.н. Из этих двух трансгенных растений №14 и №18 удалось получить семена, второе поколение которых и использовалось в дальнейших экспериментах по морфологической характеристике.
В ходе роста опытные и контрольные растения практически не различались по длине и площади листьев (табл. 1). Высота стебля лишь у линии опытных растений №18 была снижена на 17% по сравнению с контролем. Размеры цветка у опытных растений были лишь немного меньше, чем у контрольных.
Таблица 1
Морфологические параметры контрольной группы растений табака, содержащей Т-ДНК бинарного вектора рСашЫа 1301 _и трансгенных растений поколения Т1 экспрессирующих ген CLV3 арабидопсиса_
Параметр Линии контрольных растений pCambia 1301 Линии опытных растений pCambia 1301/CLAVATA3
№5 | №19 №14 | №18
Длина листьев, см 30 дней 45 дней 60 дней В период цветения Площадь трех самых крупных листьев, см2 Высота стебля, см Длина цветка, см Площадь клеток эпи-дермиса листьев, мкм2
Число клеток эпидер-миса листьев на 1 мм2 Число листьев Время цветения, дней после акклиматизации Число цветков
4.3±0.3 9.6±0.8 14.7±0.8 16.6±0.8
129.7±10.8 81.7±2.3 4.49±0.02
15517±704
66.2±2.7 17.9±0.5
107.8±2.4 5.6±0.2
3±0.1 6.1±0.4 11.5±0.2 16.5+0.5
169.3±8.8 80.1±3.4 4.50±0.03
13960±531
71.0±4.5 18.7±0.3
110.6±2.1 5.8±0.6
4.1±0.2 10.3±0.2 16.4±0.4 17.1±0.3
153.8±4.8 87.7±1.9 4.37±0.03
20397±429
49.2±0.9 17.2±0.4
100.1±3.3 4±0.3
8.1±0.6 13.4±1 15.2±1.1 16.6±0.4
129.4±7.1
67.5±2.2 4.45±0.02
24149±1320
43.8±2.7 15.3±0.6
83.7±1.3
3.8±0.2
В то же время у нескольких анализируемых растений, в отличие от контроля, наблюдались уродливые цветки (рис. 2г и 2д), что выражалось в отсутствии симметрии, в наличии большого разрыва в венчике и чашечке, срастании тычинок с лепестками и их неполное развитие. Вызывает интерес то, что опытные растения всегда зацветали раньше контрольных, при этом растения линии №14 - в среднем на девять дней, а растения линии №18 - на 25 дней в сравнении с растениями, содержащими Т-ДНК вектора рСашЫа 1301 (табл. 1). У растений, сверхэкспрессирующих ген СЬУ3 арабидопсиса, также уменьшалось число цветков; например, у линии №18 их число уменьшалось в среднем на 2. При исследовании растений линии №18, кроме уменьшения размеров стебля, было выявлено уменьшение числа листьев (на 3 листа) и иногда -
Рис. 2. Морфологические особенности трансгенных растений табака поколения Т1, сверхэкспрессирующих ген СЬЛУЛТЛЗ Л. 1ка11апа. а - двухмесячное контрольное растение табака. б - двухмесячное трансгенное растение табака поколения Т1 линии №18. в - цветки контрольных растений. г, д - цветки трансгенных растений поколения Т1 линии №18. е - сравнение листьев контрольного (слева) и одного из сильно отличающегося от нормы трансгенного (справа) растения линии №18. ж - клетки нижнего эпидермиса листьев контрольных растений. з - клетки нижнего эпидермиса листьев трансгенных по гену СЬ У3
растений линии №18. и - продольный срез верхушки побега контрольного растения; к - продольный срез верхушки побега трансгенного растения, экспрессирующего ген СЬУ3; л - поперечный срез листа контрольного растения; м - поперечный срез листа трансгенного по гену СЬУ3 растения.
изменение формы листьев: небольшое их удлинении по сравнению с шириной. Наиболее интересные данные были получены нами при измерении размеров клеток у анализируемых растений. Оказалось, что, несмотря на одинаковые размеры листьев у исследуемых растений, размеры клеток у опытных растений всегда были заметно больше, чем у контрольных форм. У опытных растений линии №14 размеры клеток по сравнению с контрольной группой были увеличены на 38%, а число клеток на 1 мм2 листовой поверхности уменьшалось на 28% (табл. 1). Еще более значительным оказалось увеличение размеров клеток эпидермиса листьев у растений линии №18, которое составило 64%. При этом число клеток эпидермиса листьев, приходящихся на 1 мм2 листовой поверхности, напротив, уменьшалось на 36%. Выявленные различия в размерах клеток эпидермиса сохранялись и при измерении площади клеток мезофилла листьев (рис. 2л, м) и эпидермиса цветков. Внутри каждой линии как трансгенных, так и контрольных растений различия в размере клеток листьев и в величине органов между разными вариантами выборки никогда не превышали 10%. Исходя из этого, можно сделать вывод, что морфологические особенности исследуемых трансгенных растений обусловлены эктопической экспрессией гена СЬУ3. К тому же все анализируемые опытные растения, в отличие от контрольных, характеризовались наличием экспрессии мРНК целевого гена.
У некоторых опытных растений наблюдалось уменьшение размера верхушечной почки, а у нескольких растений линии №18 верхушка побега вообще не обнаруживалась (рис. 2б) и в течение двух месяцев эти растения состояли только из двух листьев без стебля. Листья у этих растений были бледные, искривленные, наощупь более твердые, мясистые, шершавые. Проводящая система листьев у этих растений была недоразвитой, размеры клеток нижнего и верхнего эпидермиса листьев увеличены в 5 раз по сравнению с контролем (рис. 2з). У опытных растений также наблюдалось увеличение размеров и уменьшение количества клеток мезофилла листа (рис. 2м). У этого растения размеры устьиц оставались неизменными, но их было очень мало, и они все были закрытыми. На поперечном срезе листа видна только губчатая паренхима с очень крупными межклетниками, столбчатый мезофилл отсутствовал, что косвенно означало также недоразвитость фотосинтетического аппарата. Лишь через три месяца у этого растения образовался небольшой боковой побег со светло-зелеными листьями, состоящими также из крупных клеток. Из особенностей этого растения необходимо также отметить небольшие его размеры, хлороз и некроз листьев, быстрое высыхание нижних листьев, наличие всего одного маленького цветка. Также был сделан поперечный срез верхушки побега исследуемых растений (рис. 2и, к). У опытных растений
табака по сравнению с контролем, были уменьшены размеры апикальной меристемы побега и зачатков органов. В то же время клетки слоев, лежащих под апикльной меристемой побега характеризовались увеличенными размерами (рис. 2к).
Обсуждение результатов
Результаты проведенного нами морфологического анализа подтверждают литературные данные о том, что продукт гена СЬУЗ способствует уменьшению количества стволовых клеток в апикальной меристеме побега, что проявляется в снижении числа клеток, приходящихся на один орган [7]. Наши данные также позволяют говорить о тесной взаимосвязи регуляции клеточной пролиферации в апикальной меристеме побега, зачатках листьев и растущих листьях. Сокращение времени зацветания у трансгенных растений по-видимому, обусловлено тем, что экспрессия СЬУЗ способствует дифферен-цировке клеток, в то время как WUS-фактор ответственен за поддерживание меристематически компетентных клеток в центре апикальной меристемы [9]. Число листьев и цветков у исследуемых растений уменьшалось вероятнее всего из-за сокращения количества недифференцированных стволовых клеток в апикальной меристеме побега, что привело к более редкой закладке их зачатков. Причиной уменьшения количества и размеров цветков могло быть также снижение уровня экспрессии гена ЛОЛМОПБ из-за подавления экспрессии WUS-фактора [10].
Исходя из полученных нами данных следует, что конститутивная экспрессия гена СЬУЗ способствует уменьшению количества стволовых клеток в апикальной меристеме побега, что в свою очередь приводит к уменьшению количества меристемати-ческих клеток, рекрутированных в зачатки листьев. Так как листья в итоге образуются из меньшего числа клеток, эти клетки компенсаторно растягиваются по сравнению с контролем, способствуя
поддержанию конечных размеров листьев в пределах физиологической нормы. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе выявленного нами компенсаторного эффекта, остаются пока неизвестными.
ЛИТЕРАТУРА
1. Lenhard M., Jürgens G., Laux T. The WUSCHEL and SHOOTMERISTEMLESS genes fulfil complementary roles in Arabidopsis shoot meristem regulation. Development. 2002. V. 129. P. 3195-3206.
2. Clark S. E., Williams R.W., Meyerowitz E.M. The CLAVATA1 gene encodes a putative receptor kinase that controls shoot and floral meristem size in Arabidopsis. Cell. 1997. V. 89. P. 575-585.
3. Shinohara H., Matsubayashi Y. Arabinosylated glicopeptide hormones: new insights into CLAVATA3 structure. Current Opinion in Plant Biology. 2010. V. 13. P. 515-519.
4. Trotochaud A. E., Hao T., Wu G., Yang Z., Clark S.E. The CLAVATA1 leceptor-like kinase requires CLAVATA3 for its assembly into a signaling complex that includes KAPP and rho-related protein. Plant Cell. 1999. V. 11. P. 393-406.
5. Zhu Y., Wang Y., Li R., Song X., Wang Q., Huang S., Bo Jin J., Liu C.M., Lin J. Analysis of interactions among the CLAVATA3 receptors reveals a direct interaction between CLAVATA2 and CORYNE in Arabidopsis. Plant Journal. 2010. V. 61. P. 223-233.
6. Додуева И. Е., Юрлова Е. В., Осипова М. А., Лутова Л. А. CLE-пептиды - универсальные регуляторы развития меристем // Физиология растений. 2012. Т.59. № 1. С. 17-31.
7. Brand U., Fletcher J.C., Hobe M., Meyerowitz E.M., Simon R. Dependence of stem cell fate in Arabidopsis on a feedback loop regulated by CLV3 activity. Science. 2000. V. 289. P. 617-619.
8. Stomp A.M. Histochemical localization of ß-glucuronidase. In : S.R. Gallagher GUS Protocols: Using the GUS Gene as a Reporter of Gene Expression. Academic Press, San Diego. CA. 1992. P. 103-113.
9. Leibfried A., To J.P., Busch W., Stehling S., Kehle A., Demar M., Kieber J.J., Lohmann J.U. WUSCHEL controls meristem function by direct regulation of cytokinin-inducible response regulators. Nature. 2005. V. 438. P. 1172-1175.
10. Ikeda M., Mitsuda N., Ohme-Takagi M. Arabidopsis WUSCHEL is a bifunctional transcription factor that acts as a repressor in stem cell regulation and as an activator in floral patterning. Plant Cell. 2009. V. 21. P. 3493-3505.
Поступила в редакцию 09.10.2013 г. После доработки - 28.03.2014 г.
MORPHOLOGIC ANALYSIS OF TRANSGENIC TOBACCO PLANTS, OVEREXPRESSING GENE CLAVATA3 A. THALIANA
© E. Z. Nurgaleeva1*, B. R. Kuluev2
1Bashkir State University 32 Zaki Validi St., 450074 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.
2Institute of Biochemistry and Genetic Ufa Scientific Centre of Russian Academy of Sciences 71 Oktyabrya Ave., 450054 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.
Phone: + 7 987 587 09 17.
E-mail: nurgaleewa. elina@yandex. ru
In order to study the molecular mechanisms of organ growth, we obtained transgenic tobacco plants with constitutive expression of the gene CLAVATA3 A. thaliana. Transgenic plants were characterized by a decline in stem height, reducing the number of leaves and flowers, a significant increase in the size of leave cells and, consequently, a reduction in their number per single organ. The apical shoot meristem and leaf primordial of the experimental plants were reduced in size, however for leaf area the transgenic plants almost did not differ from control leaves. The findings suggest that there is a compensatory mechanism in plants, aimed at keeping the size of organs within normal range.
Published in Russian. Do not hesitate to contact us at [email protected] if you need translation of the article.
Keywords: CLAVATA3; transgenic plants; shoot apical meristem; cell proliferation; ectopic expression.
REFERENCES
1. Lenhar. Moscow, Jurgens G., Laux T. The WUSCHEL and SHOOTMERISTEMLESS genes fulfil complementary roles in Arabidopsis shoot meristem regulation. Development. 2002. Vol. 129. Pp. 3195-3206.
2. Clark S. E., Williams R.W., Meyerowitz E.M. The CLAVATA1 gene encodes a putative receptor kinase that controls shoot and floral meristem size in Arabidopsis. Cell. 1997. Vol. 89. Pp. 575-585.
3. Shinohara H., Matsubayashi Y. Arabinosylated glicopeptide hormones: new insights into CLAVATA3 structure. Current Opinion in Plant Biology. 2010. Vol. 13. Pp. 515-519.
4. Trotochaud A. E., Hao T., Wu G., Yang Z., Clark S.E. The CLAVATA1 leceptor-like kinase requires CLAVATA3 for its assembly into a signaling complex that includes KAPP and rho-related protein. Plant Cell. 1999. Vol. 11. Pp. 393-406.
5. Zhu Y., Wang Y., Li R., Song X., Wang Q., Huang S., Bo Jin J., Liu C.M., Lin J. Analysis of interactions among the CLAVATA3 receptors reveals a direct interaction between CLAVATA2 and CORYNE in Arabidopsis. Plant Journal. 2010. Vol. 61. Pp. 223-233.
6. Dodueva I. E., Yurlova E. V., Osipova M. A., Lutova L. A. Fiziologiya rastenii. 2012. Vol. 59. No. 1. Pp. 17-31.
7. Brand U., Fletcher J.C., Hob. Moscow, Meyerowitz E.M., Simon R. Dependence of stem cell fate in Arabidopsis on a feedback loop regulated by CLV3 activity. Science. 2000. Vol. 289. Pp. 617-619.
8. Stomp A.M. Histochemical localization of p-glucuronidase. In : S.R. Gallagher GUS Protocols: Using the GUS Gene as a Reporter of Gene Expression. Academic Press, San Diego. CA. 1992. Pp. 103-113.
9. Leibfried A., To J.P., Busch W., Stehling S., Kehle A., Dema. Moscow, Kieber J.J., Lohmann J.U. WUSCHEL controls meristem function by direct regulation of cytokinin-inducible response regulators. Nature. 2005. Vol. 438. Pp. 1172-1175.
10. Iked. Moscow, Mitsuda N., Ohme-Takagi M. Arabidopsis WUSCHEL is a bifunctional transcription factor that acts as a repressor in stem cell regulation and as an activator in floral patterning. Plant Cell. 2009. Vol. 21. Pp. 3493-3505.
Received 09.10.2013. Revised 28.03.2014.
