CC BY
49
УДК біб.36-006.68-091.8-092.9
Т.А. Кунц, А.В. Ефремов, Е.В. Овсянко, Г.И. Вакулин, М.Г. Пустоветова
МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПЕЧЕНИ КРЫС С ПРОДВИНУТОЙ СТАДИИ РАЗВИТИЯ КАРЦИНОСАРКОМЫ WALKER 256 НА ФОНЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ
Новосибирский государственный медицинский университет (Новосибирск)
Изучены морфологические особенности печени крыс-самцов Wistar с карциносаркомой Walker 256 через 14 суток после однократного введения циклофосфана, тормозящего рост, опухоли. Показано повышение выраженности дистрофических и некробиотических изменений в клетках паренхимы, и стромы. сравнительно с группой крыс-опухоленосителей в связи с возросшей токсической нагрузкой на орган, вызванной биотрансформацией препарата в печени. Противоопухолевый эффект циклофосфана способствует, снижению выраженности, влияний паранеопластической интоксикации, что выражается, в уменьшении, застойных явлений в сосудистом, русле печени и активации иммунных реакций. Морфологические изменения в части гепатоцитов, несущих повышенную функциональную нагрузку, свидетельствуют, об усилении функции детоксикации, и запуске адаптационных механизмов, направленных на усиление синтеза белков и обменно-транспортных процессов между эндотелием синусоидов и паренхимой.
Ключевые слова: печень, карциносаркома Walker 256, циклофосфан
MORPHOLOGICAL ANALYSIS OF RAT LIVER AT CARCINOCARCOMA WALKER 256 ADVANCED STAGE AFTER ANTITUMOR THERAPY
Т.П. ^nts, D.V. Efremov, Е.У. Ovsyanko, G.M. Vakulin, M.G. Pustovetova
Novosibirsk State Medical University, Novosibirsk
Morphological liver features are investigated, in male Wistar carcinosarcoma Walker 256-bearing rats on the 14th day after single cyclophospamide administration for the purpose of tumor growth limitation. Distrophy and necrobiosis increase in parenchymal and stromal cells caused, by cyclophosphamide biotransformation in the liver were revealed, in comparison, with tumor-bearing rat liver. Antitumor cyclophosphamide effect contributes to decrease in liver vascular-bed and immune reactions activation. Morphological changes in part of hepatocytes with, strong functional pressure suggest intensification of detoxication, and trigger the adaptive mechanisms to stimulate the protein synthesis, exchange and. transport between sinusoidal endothelium, and. parenchyma. Key words: liver, carcinosarcoma Walker 256, cyclophosphamide
ВВЕДЕНИЕ
Развитие опухоли сопровождается синдромом эндогенной интоксикации, обусловленным распадом опухолевых клеток и выделением паранеопластических токсических продуктов, разносимых током крови по организму и повреждающих мембраны нормальных клеток [3]. Это приводит к системному нарушению обменных, иммунных и регуляторных функций организма и метаболических и адаптационных функций печени — центрального органа гомеостаза, обезвреживающего токсические вещества, в том числе и цитостатики. Применяемый в экспериментальной и клинической практике цитостатик циклофосфан оказывает выраженный тормозящий эффект на рост злокачественных опухолей, в частности, на карциносаркому Walker 256 [1, 10], но, метаболизи-руясь в печени в токсические агенты, оказывает на нее побочные повреждающие воздействия. Анализ литературы, посвященный изменениям печени при действии циклофосфана и на фоне развития карциносаркомы Walker 256, показал фрагментарность и недостаточную изученность этих вопросов в области сочетанных влияний данного препарата и факторов эндогенной паранеопластической интоксикации — протеолитического влияния, ток-
сического действия молекул средней массы, действия опухолевых цитокинов и, в первую очередь, фактора некроза опухоли, оказывающего наиболее выраженные цитолитические повреждения [3].
Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение морфологических особенностей печени крыс с карциносаркомой Walker 256 на продвинутой стадии и крыс-опухоленосителей спустя 14 суток после введения циклофосфана.
МЕТОДИКА
Крысам-самцам Wistar массой 180 — 200 г в мышцу бедра осуществляли трансплантацию 106 клеток карциносаркомы Walker 256 [7]. Цикло-фосфан («Биохимик», г. Саранск, Россия) вводили на 5-е сутки после перевивки опухоли однократно внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг. Образцы печени для исследования забирали через 14 суток после введения препарата. В качестве контроля использовали интактных крыс (К, n = 7), крыс-опухоленосителей на 14-е сутки после введения опухолевой культуры (ОЦ, n = 7) и здоровых животных на 14-е сутки после введения циклофосфана (Ц, n = 7). Все манипуляции с лабораторными животными проводились с соблюдением международных принципов Хельсинской декларации о гу-
210
ПІІІІІІІІІІІІІІІІІПII IIIIII I I ІІГП □ II II I Г nil II I II
манном отношении к животным. Взятие образцов печени, изготовление и окраску гистологических препаратов (гематоксилином Майера-эозином) проводили по стандартным методикам. Морфометрический анализ проводили при увеличении х 1000 с помощью окулярной сетки на 25 точек. На препаратах, полученных от каждой группы, исследовали по 100 полей зрения. Методом точечного счета при стандартном увеличении на срезах печени определяли долю площади (%), занимаемой цитоплазмой и ядрами гепатоцитов, синусоидными капиллярами и синусоидными клетками. Подсчитывали численные плотности гепатоцитов и синусоидных клеток. На основе полученных данных вычисляли ядерно-цитоплазматическое отношение в гепатоцитах, долю диплокариоцитов в общем пуле паренхиматозных клеток, отношение общего числа синусоидных клеток к общему числу гепатоцитов, а также индекс васкуляриза-ции, представляющий собой отношение площади синусоидов к площади паренхимы [12]. Статистическая обработка результатов заключалась в подсчете средних величин (М) и их стандартных ошибок (т). Достоверность различий оценивали с использованием ^критерия Стьюдента при 95 % уровне значимости.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Через 14 суток развития карциносаркомы (группа О) в печени выявлены признаки нарушения кровотока с проявлением сладж-синдрома и тромбоза междольковых артерий и центральных вен, что сочетается с десквамацией эндотелия, тормозящей кровоток. Агрегация эритроцитов и гра-нулоцитов в просветах синусоидов способствует закупорке части капилляров, застойному расширению синусоидов и гипоксии. Повышение индекса васкуляризации 0,28 ± 0,02 при 0,17 ± 0,01 в контроле ф < 0,05) отражает увеличение относительной площади капиллярной сети (табл. 1). Наблюдается расширение лимфатических пространств Малла. Архитектоника печеночных долек нарушена из-за увеличения зон некроза и дистрофии. В паренхиме печеночных долек обнаружен метастатический
занос клеток карциносаркомы в виде одиночных клеток и их конгломератов. По сравнению с печенью интактных животных отмечено достоверное возрастание численной плотности двуядерных гепатоцитов (табл. 1), прирастающих, как известно, за счет ацитокинетических митозов и являющихся родоначальниками полиплоидных клеток, что может быть компенсацией недостаточности функций клеток паренхимы. Поэтому, видимо, достоверно повышается численная плотность гепатоцитов, процент площади которых уменьшается в соответствии со снижением их функций. Возможно, из-за восполнения утраты клеток эндотелия повышается число митозов в неповрежденной их части, что увеличивает число клеток синусоидов (табл. 1). Последние могут прирастать и за счет печеночных макрофагов, устраняющих клеточный детрит, а также клеток Ито. Известно, что при повреждении клетки печени и крови могут высвобождать трансформирующий р-фактор роста и фактор роста из тромбоцитов, оказывающие стимулирующее действие на митозы клеток Ито и последующую продукцию ими внеклеточного матрикса [11] в результате трансдифференциации их в миофибробласты, что является ключевым событием фиброгенеза в печени [10].
В результате гибели части клеток при патологическом процессе в печени происходит стимуляция регенерации органа, основными клеточными механизмами которой являются пролиферация, по-липлоидизация и гипертрофия гепатоцитов. Гипертрофия гепатоцитов сопровождается увеличением их размера и может быть вызвана повышением плоидности клеток, которое приводит к пропорциональному увеличению их объема и массы [2]. Мы полагаем, что изменение морфометрических показателей цитоплазмы и ядер гепатоцитов в группе животных-опухоленосителей (табл. 1) на фоне увеличения ядерно-цитоплазматического отношения на 60,63 % по сравнению с контролем (р < 0,05) может быть следствием активации репа-ративных механизмов.
В группе здоровых животных спустя 14 суток после введения циклофосфана (Ц) сохраняются
Таблица 1
Результаты морфометрического исследования гистологических срезов печени крыс с карциносаркомой Walker256 после введения циклофосфана (S - относительная площадь, N - численная плотность, M ± m)
Параметр К ц О оц
S цитоплазмы гепатоцитов 0,67 ± 0,01 0,71 ± 0,01*# 0,56 ± 0,01* 0,64 ± 0,01*#
S ядер гепатоцитов 0,14 ± 0,01 0,12 ± 0,01# 0,16 ± 0,01* 0,15 ± 0,01
S паренхимы 0,80 ± 0,01 0,83 ± 0,01*# 0,75 ± 0,01* 0,79 ± 0,01#
S синусоидов 0,13 ± 0,01 0,12 ± 0,01# 0,20 ± 0,01* 0,17 ± 0,01*#
S синусоидных клеток 0,07 ± 0,00 0,05 ± 0,00* 0,05 ± 0,00 0,04 ± 0,00*#
Гепатоциты, N 21,64 ± 0,28 20,55 ± 0,23*# 21,56 ± 0,23 20,14 ± 0,26*#
Диплокариоциты,N 1,24 ± 0,10 1,26 ± 0,10# 1,74 ± 0,13*# 1,22 ± 0,12#
Синусоидные клетки, N 8,46 ± 0,10 6,93 ± 0,23*# 9,77 ± 0,26* 6,65 ± 0,25*#
Примечание: * - достоверные отличия от показателя в группе К, # - достоверные отличия от показателя в группе О.
nilllllllllllllllllin IIIIII 1111ГП □ I I I I I I III □ nil I I I I I I
211
альтеративные изменения: при сохранении балочной структуры печени отмечается отек интерсти-ция, полнокровие центральных вен, незначительное сужение синусоидных капилляров (табл. 1). Отдельные гепатоциты демонстрируют признаки дистрофии. Полученные данные свидетельствуют о повышении функциональной нагрузки на клетки печени, которая может быть вызвана деструктивным изменениями митохондрий и гладкой цитоплазматической сети в гепатоцитах [14] в связи с супрессивным влиянием на экспрессию в ней цитохромов Р-450 [10]. Кроме того, показано, что циклофосфан может вызывать нарушение обмена глутатиона в клетках эндотелия печени [15], снижая в них активность антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы [14] и вызывая тем самым синусоидальный обструк-тивный синдром [8].
На 14-е сутки после однократного воздействия циклофосфаном (ОЦ) в печени животных-опухоле-носителей выявлены нарушения гемодинамики: неравномерное расширение синусоидов с признаками кровоизлияний в паренхиму долек. Поддолько-вые вены расширены, полнокровны. По сравнению с группой животных, не получавших циклофосфан, наблюдается уменьшение застойных явлений в центральных венах, реже встречаются скопления гемолизированных и секвестрированных эритроцитов, что уменьшает площадь синусоидов (табл. 1). Как и в группе О выявлено метастатическое поражение печени в виде присутствия скоплений атипичных клеток. Обнаруженные конгломераты содержат клетки лимфоидного ряда, отмечается нарастание воспалительно-клеточной инфильтрации, что косвенно может указывать на активацию иммунологических реакций [4]. Часть гепатоцитов дистрофически изменена, в другой части, в зонах фокальных некрозов, ядра клеток паренхимы пик-нотичны, с проявлениями кариорексиса и карио-лизиса. Результаты морфометрического анализа представлены в таблице 1. Достоверное снижение численной плотности диплокариоцитов по сравнению с группой О, вероятно, является следствием депрессии пролиферативных процессов на фоне повреждающего действия опухолевых токсинов и циклофосфана.
Известно, что гипертрофия гепатоцитов не всегда связана с повышением плоидности клеток и может сопровождаться увеличением размера их цитоплазмы и уменьшением ядерно-цитоплазматического отношения. В основе ее лежит усиление процессов внутриклеточной регенерации [6], ведущих к увеличению числа и гипертрофии различных клеточных структур и органоидов и, в конечном счете, — к увеличению объема и массы клеток [2, 5]. В нашем эксперименте введение в печени животных-опухоленосителей на фоне воздействия циклофосфана наблюдается увеличение относительной площади цитоплазмы и площади паренхимы гепатоцитов, при этом ядерно-цитоплазматическое отношение снижается на 30 % ф < 0,05) по сравнению с группой без лечения,
что, возможно, является результатом репаратив-ного процесса, в котором основную роль играет гипертрофия клеток печени. Известно, что гиперплазия клеточных структур характерна для гепатоцитов в состоянии активации функции дезинтоксикации и, видимо, связана с повышением паранеопластической токсической нагрузки на орган: действия протеолитической гиперфермен-темии, цитокинов и среднемолекулярных пептидов [3], а также с повышением функциональной нагрузки, связанной с биотрансформацией ци-клофосфана в печени.
Введение циклофосфана крысам-опухолено-сителям способствует уменьшению относительной площади и численной плотности синусоидных клеток, по-видимому, за счет запуска механизмов апоптоза и токсических эффектов метаболитов циклофосфана на клетки эндотелия синусоидов через изменения состояния системы глутатиона в тканях печени [15].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, спустя 14 суток после однократного воздействия циклофосфаном в печени крыс-опухоленосителей повышается выраженность дистрофических и некробиотических изменений в гепатоцитах в связи с возросшей функциональной нагрузкой на орган, вызванной биотрансформацией циклофосфана в печени. Однако противоопухолевый эффект циклофос-фана способствует снижению выраженности влияний паранеопластической интоксикации, что выражается в уменьшении застойных явлений в сосудистом русле печени и активации иммунных реакций. Морфологические изменения в в части клеток паренхимы, несущих повышенную функциональную нагрузку, свидетельствуют об усилении функции детоксикации и запуске адаптационных механизмов, направленных на усиление синтеза белков и обменно-транспортных процессов между эндотелием и паренхимой.
ЛИТЕРАТУРА
1. Амосова Е.Н. и др. Потенциированный циклофосфан: экспериментальное исследование действия на развитие опухолевого процесса и эффективность цитостатической терапии // Бюлл. эксп. биол. и мед. — 2003. — Прил. 1. — С. 16-19.
2. Безбородкина Н.Н. и др. Морфометрия митохондриального аппарата гепатоцитов нормальной и цирротически измененной печени крыс // Цитология. - 2008. - Т. 50, № 3. - С. 228-236.
3. Ганцев Ш.Х. Онкология. - М., 2004. - 516 с.
4. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология. - М., 2000. - 592 с.
5. Сакута Г.А., Кудрявцев Б.Н. Клеточные механизмы регенерации цирротически измененной печени крыс. II Влияние частичной гепатэктомии на пролиферацию, полиплоидизацию и гипертрофию гепатоцитов // Цитология. - 2005. - Т. 47, № 5. - С. 379-387.
212
П11111111111111111П111111 1111ГП □ I I I I I I 1111 □ П1 11111
6. Саркисов Д.С. и др. О влиянии ритма действия повреждающего агента на характер репа-ративной регенерации печени // Арх. патол. — 1975. - Т. 37. - С. 80-87.
7. Хегай И.П., Попова Н.А., Иванова Л.Н. Влияние экспрессии гена вазопрессина на рост карциносаркомы Walker 256 у крыс // Генетика. — 2000. - Т. 42, № 7. - С. 993-995.
8. Beltinger J. et al. Hepatic Veno-Occlusive Disease Associated with Immunosuppressive Cyclophosphamide Dosing and Roxithromycin // The Ann. of Pharmacotherapy. - 2006. - Vol. 40, N 4. - P. 767-770.
9. Gressner A.M. Transdifferentiation of hepatic stellate (Ito) cells to myofibroblasts: a key event in hepatic fibrogenesis // Kidney Int. - 1996. - Vol. 49, N 1. - P. 39-45.
10. LeBlanc G.A., Waxman D.J. Mechanisms of cyclophosphamide action on hepatic P-450 expression // Cancer Res. - 1990. - Vol. 50, N 9. - P. 5720-5726.
11. Okuno M. et al. Liver fibrosis and hepatic stellate cells // Connect Tissue. — 2000. — Vol. 32. — P. 401 -406.
12. Onori P. et al. Hepatic microvascular features in experimental cirrhosis: a structural and morphometrical study in CCl4-treated rats // J. Hepatol. - 2000. - Vol. 33, N 4. - P. 555-563.
13. Sladek N.E. Therapeutic efficacy of cyclophosphamide as a function of inhibition of its metabolism // Cancer Res. - 1972. - Vol. 32, N 5. -P. 1848-1854.
14. Sulkowska M., Sulkowski S., Skrzydlewska E. The effect of pentoxifylline on ultrastructure and antioxidant potential during cyclophosphamide-induced liver injury // J. Submic. cytology and pathology. - 1999. - Vol. 31, N 3. - P. 413-422.
15. Wang X., Kanel G.C., DeLeve L.D. Support of sinusoidal endothelial cell glutathione prevents hepatic veno-occlusive disease in the rat // Hepatology. -2000. - Vol. 31. - P. 428-434.
Сведения об авторах
Кунц Татьяна Анатольевна - младший научный сотрудник Центральной научно-исследовательской лаборатории НГМУ (630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52; тел.: (383) 226-35-60; e-mail: [email protected])
Ефремов Анатолий Васильевич - д.м.н., профессор, член-корр. РАМН, заведующий кафедрой патофизиологии НГМУ (630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52)
Овсянко Елена Владимировна - к.м.н., доцент кафедры анатомии, гистологии, биологии стоматологического факультета НГМУ (630091, г Новосибирск, Красный проспект, 52)
Вакулин Геннадий Михайлович - к.м.н., старший научный сотрудник Центральной научно-исследовательской лаборатории НГМУ (630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52)
Пустоветова Мария Геннадьевна - д.м.н., профессор, заведующий Центральной научно-исследовательской лабораторией НГМУ (630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52)
niiiiiiiiiiiiiiiiin пип пит □ 11 I i □ nil I 11111
213
