CC BY
22
ХИРУРГИЯ ОРГАНОВ ЭНДОКРИННОЙ СИСТЕМЫ
«Вестник хирургии»^2007
© Коллектив авторов, 2007 УДК 616.441-006.5-091.8
А.В.Павлов, Ю.К.Александров, И.Е.Беляков, Т.В.Кораблева
морфологический анализ генетически поврежденных тироцитов при узловой
патологии щитовидной железы
Ярославская государственная медицинская академия (ректор — академик РАМН Ю.В.Новиков)
Ключевые слова: тироциты, микроядра, рак щитовидной железы, узловой зоб.
Введение. В современной литературе имеются работы о важной роли нарушения стабильности генома тироцитов в развитии узловой патологии щитовидной железы [4, 6, 8]. Это связано с тем, что по сравнению с другими разновидностями железистого эпителия тироциты имеют повышенную устойчивость к действию стимулов, вызывающих апоптоз, поэтому при мутациях в них преимущественно активизируются системы репарации ДНК, неполная репарация может приводить к появлению клонов опухолевых клеток [12,
15]. В настоящее время выделены гены и группы генов, мутация которых связана с определенным видом узловой патологии щитовидной железы (ЩЖ). Так, мутации генов GSP и TSHR ассоциируются с доброкачественными гиперфункциони-рующими узлами ЩЖ и аденомами, генов RAS, PTEN — с фолликулярной аденомой [14, 15]. Для спорадического папиллярного рака ЩЖ наиболее характерны мутации генов семейства BRAF [5,
16], при радиоиндуцированном раке ЩЖ преобладают внутрихромосомные перестройки онкогенов семейства RET/PTC [11, 13].
Выраженность генетических нарушений может колебаться в достаточно широких пределах. Как правило, точечные мутации не сопровождаются нарушением целости хроматид и хромосом и могут быть зарегистрированы только по нарушениям экспрессии определенных белков. Более грубые повреждения генома часто приводят к разрывам хромосом и могут быть визуализированы при метафазном анализе делящихся клеток или с помощью цитогенетического метода анализа микроядер. Последний основан на подсчете количества интерфазных клеток с добавочными ядерными тельцами (микроядрами), которые образуются из изолированных фрагментов или
целых хромосом в результате генотоксического действия кластогенов (факторов, вызывающих разрывы хромосом) и анеугенов (повреждающих митотический аппарат) во время предшествующего митоза [3].
В ранее проведенных нами исследованиях экспериментально продемонстрировано, что микроядерный тест на модели предварительно стимулированных к размножению фолликулярных тироцитов крыс в опытах in vivo является информативным методом оценки интенсивности влияния генотоксичных агентов на тиреоидную паренхиму, позволяющим выявлять кумулятивный эффект субпороговых доз мутагенов [1]. В плане дальнейшего развития этих исследований большой интерес представляет оценка информативности подсчета содержания тироцитов с микроядрами при узловой патологии ЩЖ человека. Данные литературы по этому вопросу единичны и отрывочны. G.Nilsson [9] при изучении мазков тироцитов, полученных методом тонкоигольной аспирационной биопсии, описано появление клеток с мелкими (1-3 мкм в диаметре) микроядрами при карциномах, токсическом зобе и лимфоидном тиреоидите. Продолжает оставаться неизученным вопрос о характере распределения генетически поврежденных клеток в железистой ткани вне узла. Все это свидетельствует о перспективности углубленного количественного изучения микронуклеированных тироцитов, как одного из возможных морфологических критериев раннего выявления и дифференциальной диагностики узловых поражений ЩЖ.
Материал и методы. Проведено исследование тироцитов с микроядрами у пациентов с узловой патологией ЩЖ. Объектом исследования была ткань ЩЖ, взятая у 25 пациентов во время хирургических операций: у 7 из них были фолликулярная аденома, у 5 — узловой коллоидный зоб, у 4 — диффузно-узловой токсический зоб, у 8 — папиллярный рак, у 1 — фолликулярный рак. В каж-
дом случае изучали образцы нефиксированной ткани ЩЖ из участков: а — область узла; б — ткань вне узла той же доли; в — 1-2 фрагмента ткани противоположной доли. Свежие фрагменты ткани ЩЖ помещали в изотонический раствор натрия хлорида при +4 °С на 1,5-2 ч, после чего подвергались ферментативной обработке в 0,25% растворе коллагеназы (Collagenase for pancreatic islet isolation type XI, collagen digestive activity 1,205 units/mg, Sigma, USA) в течение 1-2,5 ч при 37 °С. Из полученной суспензии клеток изготовляли мазки, которые после подсушивания фиксировали в 96% этаноле, окрашивали на ДНК по Фельгену или гал-лоцианин-хромовыми квасцами по Эйнарсону с подкраской цитоплазмы световым зеленым или нафтоловым желтым.
Подсчет частоты аберрантных тироцитов (в%) проводили из расчета 1 тыс. клеток в каждом взятом для исследования участке ЩЖ. Таким образом всего в каждом наблюдении изучены не менее 2-4 тыс. тироцитов. Полученные количественные результаты обрабатывали на персональном компьютере класса Pentium IV с помощью пакета прикладных программ Statistica (Version 6.0).
Результаты и обсуждение. Морфологическая идентификация генетически поврежденных клеток в ЩЖ человека представляет определенные сложности. Вследствие достаточно часто встречающихся инвагинаций, складок и выпячиваний ядерной оболочки тироцитов (особенно
при папиллярном раке) диагностика микроядер требует повышенного внимания. В случае, когда микроядра на мазке накладываются на основное ядро и обе ядерные структуры имеют одинаковую оптическую плотность, бывает сложно отличить его от фрагментации ядра. Поэтому в качестве микронуклеированных клеток учитывали тиро-циты с микроядрами, лежащими изолированно от основного ядра (рисунок, а, б, в, г) Кроме того, отдельно учитывали тироциты с выростами и фрагментацией ядер (рисунок, д, е). Последний феномен описан в культуре клеток при длительном действии мутагенов, как один из морфологических эквивалентов генотоксических повреждений [2].
Структура микроядер в тироцитах человека существенно варьирует. Мелкие микроядра из-за преобладания конденсированного гетерохрома-тина чаще выглядят пикнотичными (см. рисунок, а, в), реже они содержат преимущественно тонкодисперсный эухроматин и поэтому выглядят оптически более светлыми (см. рисунок, б). Микроядра встречаются преимущественно в одноядерных клетках, в качестве единичных ред-
»
*
А
д
к
Микрофото мазка изолированных клеток щитовидной железы. а, б, в, г — микроядра (стрелки) в аберрантных железистых клетках; д, е — тироциты с фрагментацией (стрелки) ядер. Окраска по Фельгену и нафтоловым желтым (а-в, д, е), галлоцианин-хромовыми квасцами по Эйнарсону и световым
зеленым (г). Ув. 900.
в
г
А.В.Павлов и др.
«Вестник хирургии»^2007
Таблица 1
Содержание аберрантных тироцитов при доброкачественных узловых заболеваниях щитовидной железы (M±m)
Число наблюдений Клетки с микроядрами,% Клетки с фрагментацией ядер,%
Диагноз a (ткань узла) б (ткань вне узла из той же доли) a (ткань узла) б (ткань вне узла из той же доли)
Диффузно-узловой токсический зоб 4 0,05±0,03 0,15±0,06 0,05±0,03 0,15±0,06
Фолликулярная аденома 3 0,17±0,04 0,18±0,07 0,18±0,04 0,22±0,07
Макромикрофолликулярная аденома 4 0,18±0,05 0,30±0,04 0,13±0,06 0,35±0,07*
Узловой коллоидный зоб 5 0,08±0,04 0,10±0,04 0,11±0,04 0,22±0,04
Средние значения по группе наблюдений - 0,11±0,02 0,18±0,04 0,11±0,02 0,24±0,03*
Здесь и в табл. 2: * p<0,05 по сравнению с тканью узла (a).
Табл и ца 2
Содержание аберрантных тироцитов при раке щитовидной железы (M±m)
Клетки с микроядрами,% Клетки с фрагментацией ядер,%
Диагноз Число наблюдений а(ткань узла) б (ткань вне узла из той же доли) в (ткань вне узла из противоположной доли) а (ткань узла) б(ткань вне узла из той же доли) в (ткань вне узла из противоположной доли)
Папиллярный рак 8 0,40±0,06 0,93±0,07* 1,00±0,11* 1,46±0,20 1,32±0,09 1,49±0,22
Фолликулярный рак 1 0,3 0,55 - 1,3 1,6 -
Средние значения по группе наблюдений - 0,39±0,05 0,88±0,08* 1,00±0,11* 1,44±0,17 1,36±0,09 1,49±0,22
ких находок они могут обнаруживаться и в дву-ядерных тироцитах (см. рисунок, в). В среднем 96% микронуклеированных клеток содержали 2 микроядра (см. рисунок, г). Основные ядра в аберрантных клетках сходны по микроскопическому строению с ядрами одноядерных тироцитов, однако по сравнению с последними они более часто содержат крупные глыбки гетерохроматина и частично спирализованные хромосомы (по типу профазной перестройки).
Результаты количественного анализа содержания микронуклеированных тироцитов свидетельствуют, что при всех изученных видах доброкачественной узловой патологии щитовидной железы при сравнении изученных показателей в ткани узла (а) и вне его (б) статистически достоверных различий не установлено, средние значения параметров находились в интервале 0,1-0,3% (табл. 1). Эти значения соответствуют спонтанному уровню содержания аберрантных тироцитов в ЩЖ интактных крыс, а также ряда других высокоспециализированных клеточных популяций у человека и лабораторных животных [1, 3]. Для клеток с фрагментированными ядрами обнаруживается тенденция к преобладанию концентрации данного вида клеток в ткани вне узла, однако, как и в случае с микроядрами, средние значения параметров находились в интервале 0,1-0,3%.
При папиллярном раке ЩЖ (табл. 2) средняя частота микронуклеированных тироцитов в опухолевом узле (а) составила в среднем 0,4%, а клеток с фрагментацией ядер — достигала 1,5%. Однако в ткани вне опухоли, взятой как из одноименной
(6), так и из противоположной (в) долей, содержание клеток с микроядрами оказалось существенно выше — в среднем в 2,4 раза (0,93-1,0%; р<0,05). Частота клеток с фрагментацией ядер во всех изученных участках также сохранялась на достаточно высоком уровне (1,3-1,5%), достоверных региональных различий этого параметра не выявлено.
Таким образом, выраженное повышение концентрации генетически поврежденных клеток в тиреоидной паренхиме обнаружено только при раке щитовидной железы. Эти результаты хорошо коррелируют с данными ^М^Ш:аке и соавт.
[7], обнаруживших, что в культуре опухолевых тироцитов индукция экспрессии гена BRAF приводит к отчетливому увеличению частоты клеток с микроядрами. Обнаруженный факт наличия в ткани вне узла многочисленных аберрантных клеток, которые при действии стимулирующих пролиферацию гормонов, факторов роста и промежуточных метаболитов могут явиться источниками новых очагов опухолевого роста [6], свидетельствует о целесообразности радикального характера операций при папиллярном раке ЩЖ.
Выводы. 1. При доброкачественной узловой патологии щитовидной железы содержание аберрантных тироцитов (с микроядрами и с фрагментацией ядер) составляет 0,1-0,3% как в узле, так и в ткани вне узла.
2. При раке щитовидной железы частота генетически поврежденных тироцитов возрастает в 2,4 — 5 раз преимущественно в ткани вне узла по всей железе.
3. Феномен увеличения частоты тироцитов с микроядрами может являться одним из прогностических критериев повышенного риска злокачественной неопластической трансформации тиреоидной паренхимы.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Павлов А.В., Гансбургский М.А., Гансбургский А.Н. и др. Использование микроядерного теста для выявления геноток-сических повреждений щитовидной железы // Бюл. экспер. биол.—2006.—Т. 141, № 1.-С. 99-102.
2. Сальникова Л.Е., Бахитова Л.М., Пашин Ю.В. Влияние алки-лирования и карбамоилирования на характер генетических повреждений в соматических клетках млекопитающих, культивируемых in vitro // Бюл. экспер. биол.—1988.—Т. 105, № 1.—С. 66-67.
3. Фраш В.Н., Ванчугова Н.Н. Микроядерный тест как краткосрочный метод выявления потенциальной онкогенности различных групп химических веществ // Экспер. онкол.— 1987.—Т. 9, № 2.—С. 8-14.
4. Щитовидная железа: Фундаментальные аспекты / Ред. А.И.Кубарко и С.Ямасита.—Минск—Нагасаки, 1998.—398 с.
5. Ciampi R., Nikiforov YE. Alterations of the BRAF gene in thyroid tumors // Endocr. Pathol.—2005.—Vol. 16, № 3.—P. 163-172.
6. Learoyd D.L., Messina M., Zedenius J., Robinson B.G. Molecular genetics of thyroid tumors and surgical decision-making // World J. Surg.—2000.—Vol. 24, № 8.—P. 923-933.
7. Mitsutake N., Knauf J.A., Mitsutake S. et al. Conditional BRAFV600E expression induces DNA synthesis, apoptosis, dedifferentiate, and chromosomal instability in thyroid PCCL3 cells // Cancer Res.—2005.—Vol. 65, № 6.—P. 2465-2473.
8. Moretti F., Nanni S., Pontecorvi A. Molecular pathogenesis of thyroid nodules and cancer // Baillieres Best Pract. Clin. Endocrinol. Metab.—2000.—Vol. 14, № 4.—P. 517-539.
9. Nilsson G. Micronuclei studied in fine needle goitre aspirates // Acta Pathol. Microbiol. Scand.—1978.—Vol. 86, № 3.—P. 201-204.
10. Pierotti MA. Chromosomal rearrangements in thyroid carcinomas: a recombination or death dilemma // Cancer Lett.—2001.— Vol. 166, № 1.—P. 1-7.
11. Sarasin A., Bounacer A., Lepage F. et al. Mechanisms of mutagen-esis in mammalian cells. Application to human thyroid tumours // C. R. Acad. Sci. III.—1999.—Vol. 322, № 2-3.—P. 143-149.
12. Shirokawa J.M., Elisei R., Knauf J.A. et al. Conditional apoptosis induced by oncogenic ras in thyroid cells // Mol. Endocrinol.— 2000.—Vol. 14, № 11.—P. 1725-1738.
13. Soares P., Trovisco V., Rocha A.S. et al. BRAF mutations and RET/PTC rearrangements are alternative events in the etiopatho-genesis of PTC // Oncogene.— 2003.—Vol. 17, № 22 (29).— P. 4578-4580.
14. Suarez H.G. Molecular basis of epithelial thyroid tumors // C. R. Acad. Sci. III.—2000.—Vol. 323, № 6.—P. 519-528.
15. Tallini G. Molecular pathobiology of thyroid neoplasms // Endocrinol. Pathol.—2002.—Vol. 13, № 4.—P. 271-288.
16. Xing M. BRAF mutation in thyroid cancer // Endocrine-Related Cancer.—2005.—Vol. 12.—P. 245-262.
Поступила в редакцию 23.10.2006 г.
A.V.Pavlov, Yu.K.Aleksandrov, I.E.Belyakov, T.V.Korableva
MORPHOLOGICAL ANALYSIS OF GENETICALLY DAMAGED THYROCYTES IN NODuLAR PATHOLOGY OF THE THYROID GLAND
The smears of isolated thyrocytes with micronuclei taken from 25 patients with nodular pathology of the thyroid gland were investigated. In all kinds of benign nodular pathology the number of micronucleated thyrocytes comes to 0.1-0.3%. These values correspond to the spontaneous level of the content of aberrant thyrocytes in the thyroid gland of highly specialized cell populations. In papillary carcinoma of the thyroid gland the average occurrence of micronucleated thyrocytes in the tumor nodule was about 0.4%. In the tissue outside the tumor taken from both the same and the opposite lobes, the content of cells with micronuclei proved to be substantially higher — 0.93-1%. So, the marked increase of the concentration of genetically damaged cells in the thyroid parenchyma proved to be characteristic of the carcinoma of the thyroid gland.
