CC BY
26
ЕКС ПЕРИМЕИТЛЛЬИЛ МЕДИЦИНА
EXPERIMENTAL MEDICINE
DOI 10.26724/2079-8334-2019-4-70-183-187 УДК 591.44: 615.375
Р.Ф. \4iimi'., В.К. Смрмов1. О.В. Фе ню < ва1. О.К. Фролов {апорг.ькмм намшна. и.нмм минерсми-т »апоргжжя 1 >aii<>|>i;i.Kiiii ц-р'жаг-ммм мешчнмм унтерсми-т »апоргжжя
МОРФОЛОГ1ЧН1 ПОКАЗНИКИ СЕЛЕЗ1НКИ ТА ТИМУСУ ЩУР1В П1СЛЯ ВПЛИВУ СОЛЬОВОГО ЕКСТРАКТУ HIRUDO VERBANA
e-mail: [email protected]
Робота була спрямована на дослщження морфологiчних показниюв селезiнки та тимусу щурiв на фот впливу сольового екстракту Hirudo verbana. Самицям внутршньочеревинно вводився стандартизований сольовий екстракт i3 тiл медичио' п'явки, два рази до злучки i3 самцями та два рази тсля. Пiсля вигодовування приплоду на 60 добу тсля останнього введення речовини, самиць та !х приплод у динамщ на 15, 30, 45 та 60-ту добу постембрюнального онтогенезу пiддавали декаттацп. Аналiзували бшу пульпу селезiнки - площу та дiаметр лiмфатичних фолiкулiв, центральних артерш та кiлькiсть лiмфоцитiв на одиницю площi (400 мкм2) у лiмфоi'дному фолiкулi, у тимусi - юльюсть клiтин на одиницю площi, як в юрковш, так i мозковш речовинi. Пiд впливом бiологiчно активних речовин медично! п'явки у бшй пульт селезшки збiльшуються розмiри лiмфоi'дних фолiкулiв та центральних артерiй, тдвищуеться кiлькiсть лiмфоцитiв на одиницю площi (400 мкм2) лiмфоi'дного фолiкула, а у тимус приплоду, як в юрковш, так i мозковiй речовинах збшьшуеться кiлькiсть клiтин на одиницю площi (400 мкм2), виявляеться переважання юрково! над мозковою речовиною. У результат дослiдження виявлено стимулюючий вплив сольового екстракту Hirudo verbana на iмуногенез у центральних та перефершних органах iмунноi' системи.
Ключов! слова: медична п'явка, прудотерашя, морфогенез, селезшка, тимус
Робота е фрагментом НДР «Бiотехнологiя перспективних тльчещв з вивченням iMyHompomoi ди гх бiологiчно активних речовин», № державног реестраци 0117U000704.
Одним ¡з центральних л1мфо'дних оргашв ¡мунно' системи е тимус, який переважно визначае стан перифершних оргашв 1мунно' системи, 1муногенезу, а також захисш реакцп всього оргашзму [2, 6]. Селезшка е важливим периферичним л1мфо'дним органом кровотворення та 1мунного захисту. Одшею ¡з найважливших функцш селезшки е 1мунна, яка полягае в захопленш та знешкодженш макрофагами шкщливих речовин, очищення кров1 вщ чужорщних агента. Окр1м того, макрофаги та шш1 антигенпризентуюч1 кттини через корецепторш структури та цитокши активують л1мфоцитарш 1муногенезш реакцп. Тому, при будь-якому порушеш антиген структурного гомеостазу виникають морфолопчш змши в селезшщ: бласттрансформащя та прол1феращя л1мфоципв [6]. Щд д1ею р1зних несприятливих фактор1в порушуеться будова л1мфо'дних оргашв 1мунно' системи змшюеться взаемозв'язок 1мунокомпетентних кл1тин, вмют в них бюлопчно активних речовин [3, 4].
Важливо, що в процес еволюцп вщ нижчих хребетних до вищих створюеться оптимальна структура та локал1защя оргашв 1мунно' системи, але повною м1рою не вщдшяються вщ оргашв кровотворення. Незважаючи на значну кшьюсть робгт щодо впливу бюлопчно активних речовин медично' п'явки на оргашзм тварини [7] та людини [10], нам не вдалося знайти робгт, яю б демонстрували пстолопчну будову цього органу за впливу сольового екстракту Hirudo verbana. Медична п'явка (МП) е одним ¡з перспективних продуцешгв понад 100 ушкальних бюлопчно активних речовин (БАР), що не мають аналопв у свт та необхщш в сучаснш ветеринарп та медициш — прудин, еглши, бделши, ферменти: палурошдаза, дестабшаза, колагеназа, ашраза, еластаза та ш. Використання медичних п'явок у прудотерапп обумовлено широким спектром терапевтично' д1' 'х БАР: регулящею гемостазу та судинного тонусу, протизапальним, регенерацшним, нейротропним, бактерюстатичним, 1муномодуляторним ефектами [7, 8].
Метою роботи було дослщити стан л1мфо'дних оргашв самиць тсля вигодовування приплоду, !х приплщ у динамщ на 15, 30, 45 та 60-добу постембрюнального онтогенезу.
Матер1ал i методи дослщжеммя. Робота виконана на 40 бших лабораторних щурах-самицях та 200 'х приплоду. Тварин утримували в умовах в1вар1ю на стандартному харчовому
© Р.Ф. Амшов, В.К. Сирцов, 2019
рацюш в шдивщуальних кликах. Дослщження проводилося у вщповщносп до етичних норм та рекомендацш щодо гуматзаци роботи з лабораторними тваринами, яю вщображеш у «Gвропейськiй конвенцп по захисту хребетних тварин, що використовуються для експериментальних та iнших цшей» (Страсбург, 1985). Тварини були роздшеш на контрольну та експериментальну групи. Контрольним щурам-самицям внутршньочеревно вводився фiзiологiчний розчин у кшькосп 0,5 мл. Експериментальним щурам-самицям один раз на тиждень, два тижнi до злучки iз самцями та два тижнi тсля, вводився внутрiшньочеревно стандартизований сольовий екстракт МП Hirudo verbana (Carena, 1820) у кшькосп 0,5 мл (з кшцевою концентрацieю речовини 5 мкг/г тварини), отриманий методом, запропонованим Фроловим А. К. (2013). Дозування антигетв сольового екстракту здшснювали за вмютом бiлка (концентрацiю бiлка визначали за Лоур^. Тварин виводили з експерименту шляхом декаштаци пiд тiопенталовим наркозом дотримуючись «Методичних рекомендацiй з виведення лабораторних тварин з експерименту». Забiр, фiксацiю у 10% розчинi нейтрального формал^ селезiнки та тимусу, виготовлення парафшових блокiв з розмiщеними в них шматочками органу виконували у вщповщносн до загальноприйнятих методик. Сершш зрiзи всього органу селезiнки та тимусу виготовляли за допомогою мшротома Thermo Scientific HM 325 товщиною 4-6 мкм. Для вивчення структурних компоненнв селезiнки та тимусу пстолопчш зрiзи забарвлювали гематоксилiном та еозином. Деталi гiстологiчноi будови органiв вивчали за допомогою цитоморфолопчного комплексу та програмного забезпечення мшроскопу Carl Zeiss Primo Star та цифрово! камери Axiocam, за допомогою яких були зроблеш цифровi фотографii мiкропрепаратiв. У яких, визначали - площу та дiаметр лiмфоiдних фолiкулiв в бшш пульпi селезiнки, площу, дiаметр та товщину стiнки центральних артерiй та кшьюсть лiмфоцитiв у лiмфоiдних фолшулах на одиницю площi (400 мкм2), кшьюсть клiтин на одиницю площi в кiрковiй та мозковiй речовинах тимусу. Комп'ютерний програмний аналiз пстолопчних препаратiв здiйснювали за допомогою програми ZEISS ZEN 2011. Статистичну обробку даних здшснювали за допомогою комп'ютерно! програми SPSS v.21,0. (IBM SPSS Statistics., USA). Вибiрковi параметри, наведет далi в таблицi, мають таю позначення: X - вибiркове середне, SE - стандартна помилка середнього. Вiрогiднiсть вiдмiнностей мiж середнiми величинами оцшювали за критерiем Ст'юдента. Рiзницi вважали достовiрними при р < 0,05.
Результати дослщження та Тх обговорення. При аналiзi приплоду у селезшщ експериментально! групи тварин на 15 добу у порiвнянi з контрольною групою червона i бiла пульпа межоваш, чiтко контуруються лiмфоiднi фолшули та !х зони, але разом з тим вiзуалiзуеться значна кшьюсть мегакарiоцитiв, кiлькiсть лiмфоiдних фолiкулiв на одиницю площi бiльша у порiвняннi з контрольною групою. На 15 добу у приплоду експериментальноi групи показники площi та дiаметру лiмфоiдних фолiкулiв селезiнки були бiльшi у порiвняннi з контролем на 43,8% та 21,9% вщповщно (табл. 1).
Таблиця 1
Змши л1мфоТдних фол1кул1в селезшки приплоду пiд впливом сольового екстракту
Hirudo verbana
Група тварин Площа лiмфolднoгo фолжулу, мкм2 Дiаметp лiмфolднoгo фoлiкулу, мкм Кiлькiсть лiмфoцитiв в середньому на 400 мкм2 Площа центрально! ■■■ 2 артери мкм2
Контроль 15 доба 18936,1±2033,8 154,8±14,1 10,97±0,30 819,6±101,0
Експеримент 15 доба 33676,8±13080,3* 198,2±13,7* 11,01±0,49 1442,7±203,1*
Контроль 30 доба 23293,1±2943,1 167,1±12,0 8,41±0,31 479,5±88,9
Експеримент 30 доба 28843,2±2945,3* 199,5±9,0* 13,09±0,30* 728,4±69,5*
Контроль45 доба 52347,0±2778,7 275,27±11,2 12,29±0,27 1314,2±103,1
Експеримент 45 доба 103160,0±1933,3* 346,3±22,3* 16,19±0,54* 1348,4±111,7
Контроль 60 доба 35263,2±5292,0 238,2±18,3 11,30±0,84 818,0±71,1
Експеримент 60 доба 51886,1±1388,6* 267,1±14,7 12,73±0,83 819,1±83,3
Самищ контроль 15302,3±2353,9 137,8±15,8 16,09±0,54 831,5±165,9
Самищ експеримент 50944,8±16976,2 * 222,1±41,3* 15,88±0,57 2302,4±539,1*
Примггка: * - р < 0,05 nopiB^HO i3 контрольною групою.
Стромальний компонент селезшки представлений ретикулярною тканиною, яка yтворенa ретикyлоендотелiaльними, дендритними та iнтердигитyючими клiтинaми.
На 30 до6у y дослiдноï групи щyрiв зростае кiлькiсть мaкрофaгiв y бiлiй пульт, мегaкaрiоцити переважно розтaшовaнi пiдкaпсyлярно та y полюшв селезiнки близько до бшо1' пульпи (рис.5). Переважае бша пyльпa (рис. 4). На 60 до6у y дослiдноï групи тварин крайова зона лiмфоïдних фолiкyлiв мютить значну кiлькiсть мaкрофaгiв (бар'ерна функщя), великi фолiкyли зливаються мiж собою, починають формуватися гермiнaтивнi центри у лiмфоïдних фолiкyлaх, де вiзyaлiзyються фтури мiтозy. Дещо меншою стае чисельшсть мегaкaрiоцитiв порiвняно з 15 та 30 добою експерименту, але порiвняно з контрольною групою (на 60 добу мегакарюцитсв немае) пiдкaпсyлярнa частина полюшв селезiнки мiстить групи мегакарюцитсв (рис. 6), що свiдчить про прудолопчний вплив на тромбоцитопоез (шщюе тромбоцитарний компонент - гомеостатична дiя бiологiчно активних речовин медично1' п'явки).
Анaлiзyючи бiлy пульпу селезiнки встановлено, що у самок збшьшуеться площа (на 69 %) та дiaметр (на 37%) лiмфоïдних фолiкyлiв, збшьшуеться площа (на 64%), дiaметр (на 46%) та товщина стiнки (на 49%) центральних aртерiй (р < 0,05). Таку ж тенденцiю змш лiмфоïдних фолiкyлiв бiлоï пульпи селезшки вiдмiчaли при aнaлiзi ix приплоду табл. 1: на 30 добу експерименту збшьшувались площа (на 19,2%), дiaметр (на 16,3%) та кшьюсть лiмфоцитiв на одиницю площi 400 мкм2 (на 35,8%) (рис. 2) у порiвняннi з контрольною групою; на 45 добу продовжуеться збшьшення числових значень покaзникiв площi (на 49,2%), дiaметрy (на 20,5%) та кшькост лiмфоцитiв на одиницю площi лiмфоïдниx фолiкyлiв (на 24,1%); на 60-ту добу вiдбyвaeться збiльшення площi (на 32,1%) та дiaметрy (на 10,8%) лiмфоïдниx фолiкyлiв бiлоï пульпи селезшки вщносно вiдповiдниx покaзникiв контрольно].' групи тварин табл. 1 (р < 0,05).
При дослщжеш центральних артерш лiмфоïдниx фолiкyлiв у самок та ïx приплоду на 15 та 30-ту добу спостерiгaлaсь тенденщя до збiльшення товщини стiнки та ïx площi табл. 1 вщповщно (р<0,05), а також збiльшення площi периaртерiaльноï зони за рахунок посилення лiмфоïдноï iнфiльтрaцiï, що свiдчить про активащю диференцiювaння Т-клiтинного пулу лiмфоцитiв.
Дослiджyючи тимус експериментальних тварин приплоду виявили, що кiрковa речовина превалюе над мозковою. У тимyсi приплоду в юрковш та мозковiй речовинах часточок збшьшуеться кшьюсть лiмфоïдниx кттин на одиницю площi (р < 0,05), спостер^аеться переважання кiрковоï речовини над мозковою, що свщчить про iмyностимyлюючий вплив БАР Hirudo verbana на розвиток лiмфоïдниx оргaнiв (селезшки та тимусу) iмyнноï системи. Дослщжуючи кiрковy речовину часточок тимусу приплоду визначаеться достовiрне збiльшення кiлькостi клпин на одиницю площi: на 15 добу (на 11,0%), на 30 добу - на 11,2%, на 45 добу - на 20,8% та на 60-ту -на 24,4% вщповщно. При дослщженш мозковоï речовини достовiрно збшьшуеться кшьюсть клпин на одиницю площi на 30- ту добу на 5,5% (р < 0,05). Тимус експериментально].' групи самиць достовiрно не вiдрiзнявся вщ контрольноï.
Узагальнюючи результати наших дослщжень, нами виявлено, що активно проявлявся стимулюючий ефект на тканину внутршнього середовища: лiмфоïднy, структурною основою якоï е ретикулярна тканина, що вщноситься до спецiaлiзовaноï пyxкоï сполyчноï тканини, основнi влaстивостi якоï: трофiчнa, захисна, регуляторна, що в повнш мiрi пояснюе в наших дослщах збiльшення покaзникiв лiмфоïдниx оргaнiв iмyнноï системи (селезiнки та тимусу). Отримаш дaнi пояснюють опyблiковaнi нами рашше результати отримaнi на дaнiй дослщнш грyпi тварин про пiдвищення маси цих оргашв та подальше збшьшення показниюв червоноï, бiлоï кровi та ïx фyнкцiонaльного стану. Окрiм того, стимулящя морфогенезу призводила до збшьшення маси тварини, яка позитивно високо в межах 0,7 - 0,9 корелювала з iмyнологiчними показниками, i зокрема з масою тимусу та селезшки [8]. Причому, збшьшення iмyнологiчниx показниюв тд впливом БАР МП вщбувалась в фiзiологiчниx межах норми реакцп генотипу щyрiв без тератогенних ознак. Пролонгована стимулящя морфогенезу у дослiдноï групи щyрiв, окрiм можливого депонування в тканинах залишкових кшькостей сольового екстракту п'явки, бшьш ймовiрно, обумовлено основною фyнкцieю iмyнноï системи - контроль та регуляци пстогенезу yсix тканин, яка за багатьма дослщниками називаеться морфогенетичною фyнкцieю iмyнноï системи. Наприклад, при переносi сепарованих Т- та В^мфоципв кровi вщ оперованих щyрiв (резекцiя печiнки) штактним тваринам iндyкyвaв у остaннix в печшщ репaрaтивнi процеси. А при штучному шпбуванш стaдiй гiстогенезy у оперованих щyрiв, видiленi ïx Т- та В^мфоцити у iнтaктниx тварин шдукували морфогенез саме з iнгiбyючоï стад^ гiстогенезy
[1, 9].
Рис. 1. Лiмфо!дний фолжул бшо! пульпи селезшки приплоду контрольно! (А) та експериментально! (Б) групи. Вiк: 30 дiб. Забарвлення: гематоксилiн та еозин.
Рис.2. Бша та червона пульпи селезшки приплоду контрольно! (А) та експериментально! (Б) групи. Вж: 30 дiб. Забарвлення: гематоксилш та еозин.
Рис.3. Мегакарюцити селезiнки приплоду експериментально! групи тварин. Вж: 30 дiб (А), 60 дiб (Б). Забарвлення: гематоксилш та еозин.
Участь морфогенетично! функцп у ф1зюлопчних та репаративних пстогенезах шдтверджуеться також, даними ¡муноморфолопв [1, 3]. Вони виявили, що при р1зних функцюнальних навантаженнях на орган, або при порушенш в ньому структурного гомеостазу не шфекцюнними факторами вщбуваетъся шфшьтращя даного органу л1мфоцитами, яю стимулювали репаративш процеси. Таким чином, нами шдтверджена активна участь ¡мунно! системи в регуляци пстогенетичних процес1в, в тому числ1, на раншх етапах онтогенезу. При чому в перше виявлено ¡муномоделюючий вплив сольового екстракту БАР МП, який може бути придатний в ветеринар'! та твариннищта, а в майбутньому, { у людини.
У селезшщ експериментально^' групи тварин переважае бша пульпа, що свщчить про iмуностимулюючий вплив БАР Hirudo verbana на кровотворний iмунний орган (селезшку). Велика кiлькiсть мегакарiоцитiв, особливо у шдкапсулярнш частинi полюсiв селезiнки свщчить про гiрудологiчний вплив БАР на тромбоцитопоез, що доводить стимулюючий ефект гомеостатичноi ди бiологiчно активних речовин медично^' п'явки. При аналiзi тимусу експериментальних тварин виявленi змiни доводять iмуностимулюючий вплив БАР Hirudo verbana на процес антигеннезалежного диференцiювання Т-кттинного пулу лiмфоцитiв у приплоду. Таким чином, перспективним е дослiдження шших центральних та периферiйних органiв iмунноi системи за впливу сольового екстракту БАР Hirudo verbana.
Список .iiic|>;ii>|>ii
1. Babayeva AG. Yeshche raz o morfogeneticheskoy, ili stroitelnoy funktsii limfotsitov. Byulleten Rossiyskoy Akademii Yestestvennykh nauk. 2010; 4: 70-74. [in Russian]
2. Bobryshev IV. Morfofunktsionalnyye osobennosti timusa u raznovozrastnykh krys posle eksperimentalnoy immunosupressii. Byulleten Vitebskogo gosudarstvennogo meditsinskogo universiteta. 2014;13(1): 48-55. [in Russian]
3. Voloshyn NA, Talanova OS. Vplyv prenatalnoho antyhennoho navantazhennya na formuvannya masy shchuriv liniyi Vistar. Svit Biolohiyi i Medytsyny. 2011 Jun 3;2(88): 32-33. [in Ukrainian]
4. Dunaievska OF. Morfolohichni zminy selezinky pid vplyvom riznykh faktoriv. Zhurnal Kharkivskoho natsionalnoho universytetu imeni V.N.Karazina. Seriya Biolohiya. 2016; 27: 106-124. [in Ukrainian]
5. Poroyskaya AB. Morfofunktsionalnyye kharakteristiki selezenki i limfaticheskikh uzlov pri eksperimentalnom razmnozhenii likhoradki Zapadnogo Nila. Volgograd, Volgogradskiy gosudarstvennyy meditsinskiy universitet; 2004. 24c. [in Russian]
6. Struchko GU, Merkulova LM, Moskvichev EB, Kostrova OY, Mikhailova MN. Morfologicheskiye izmeneniya vilochkovoy zhelezy posle primeneniya polioksidoniya. Fundament. issledovan. 2012; 5(1): 197-202. [in Russian]
9. Babaeva AG, Gevorkyan NM, Tishevskaya NV, Komarova IA. Effects of preparations of total RNA from lymphoid cells of rat spleen on in vitro erythropoiesis. Clinical and Experimental Morphology 2014; 4(12): 35-39.
10. Tagesu A Therrapeutic importance of leech and impact of leech in domestic animals. MOJ Drug Development and Therepy. 2018; 2 (6): 235-242.
тшштшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшш
IY(|k'|>;nii
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ СЕЛЕЗЕНКИ И ТИМУСА КРЫС ПОСЛЕ ВЛИЯНИЯ СОЛЕВОГО ЭКСТРАКТА HIRUDO VERBANA Аминов Р.Ф., Сырцов В.К., Федосеева О.В., Фролов А. К.
Работа была направлена на изучение морфологических показателей селезенки и тимуса крыс на фоне воздействия солевого экстракта Hirudo verbana. Самкам внутрибрюшинно вводился стандартизированный солевой экстракт из тел медицинской пиявки, два раза до случки с самцами и два раза после. После вскармливания потомства на 60 сутки после последнего введения вещества, самок и их приплод в динамике на 15, 30, 45 и 60-е сутки постэмбрионального онтогенеза подвергали декапитации. Анализировали белую пульпу селезенки - площадь и диаметр лимфоидных фолликулов, центральных артерий и количество лимфоцитов на единицу площади (400 мкм2) в лимфоидных фолликулах, в тимусе - количество лимфоцитов на единицу площади, как в корковом, так и мозговом веществе. Под влиянием биологически активных веществ медицинской пиявки в белой пульпе селезенки увеличиваются размеры лимфоидных фолликулов и центральных артерий, повышается количество лимфоцитов на единицу площади (400 мкм2) лимфоидного фолликула, а в тимусе приплода, как в корковом, так и мозговом веществе увеличивается количество клеток на единицу площади (400 мкм2), наблюдается преобладание коркового над мозговым веществом. В результате исследования выявлено стимулирующее влияние солевого экстракта Hirudo verbana на иммуногенез в центральных и периферических органах иммунной системы.
Ключевые слова: медицинская пиявка, гирудотерапия, морфогенез, селезенка, тимус.
Стаття надшшла 16.04.2019 р.
MORPHOLOGICAL PARAMETERS OF SPLEEN AND THYMUS OF THE RATS AFTER THE INFLUENCE OF SALINE EXTRACTS
HIRUDO VERBANA Aminov R.F., Syrtsov V.K., Fedosieieva O.V., Frolov A.K.
The work was aimed to investigate the morphological parameters of the spleen and thymus of rats against the background of influence of the saline extract Hirudo verbena. The females were injected intraperitoneally with a standardized salt extract from the bodies of a medical leech, twice before mating with males and twice after it. On feeding offspring, on the 60th day after the last injection of the substance, the females and their offspring in dynamics, on the 15th, 30th, 45th and 60th days of the postembryonic ontogenesis, were decapitated. We analyzed the white pulp of the spleen - the area and diameter of lymphoid follicles, central arteries and the number of lymphocytes per a unit area (400 ¡m2) in lymphoid follicles, in the thymus - the number of lymphocytes per a unit area, both in the cortical and brain substance. Under the influence of biologically active substances of a medicinal leech in the white pulp of the spleen, the sizes of lymphoid follicles and central arteries grow, the number of lymphocytes per a unit area (400 ¡im2) of the lymphoid follicle grows, and the number of cells per a unit area in the thymus of the offspring, both in the cortical and brain substance areas (400 ¡ m2), there is a predominance of cortical substance over the medulla. The study revealed a stimulating effect of the Hirudo verbana salt extract on immunogenesis in the central and peripheral organs of the immune system.
Key words: medicinal leech, hirudotherapy, morphogenesis, spleen, thymus.
Рецензент Шеттько B.I.
