CC BY
11
Для корреспонденции
Никитин Николай Сергеевич - младший научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Адрес: 109240, Российская Федерация, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-97 E-mail: nikolay_sergeevich87@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-5091-0991
Никитин Н.С., Тышко Н.В.
Морфологические особенности печени крыс в условиях разной обеспеченности витаминами и минеральными веществами
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 109240, г. Москва, Российская Федерация
Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 109240, Moscow, Russian Federation
Сложившаяся в России практика оценки безопасности пищевой продукции нового вида предполагает проведение токсикологических исследований на модели алиментарного снижения адаптационного потенциала лабораторных животных. Поскольку дефицит витаминов и минеральных веществ может оказывать влияние на размеры структурных элементов тканей, объективная оценка получаемых при использовании данной модели результатов возможна при определении диапазона колебаний изучаемыхморфометрических параметров в условиях разной обеспеченности эссенциальными веществами, а также в условиях моделированных токсических воздействий на фоне соответствующей обеспеченности.
Цель исследования - изучение морфологических и морфометрических особенностей печени под влиянием сниженного поступления витаминов и минеральных веществ с рационом в сочетании с токсическими воздействиями различной природы в период роста и полового созревания крыс-самцов линии Вистар. Материал и методы. В статье проанализированы данные от 140 животных из 4 модельных экспериментов, получавших полусинтетический казеиновый рацион с разной обеспеченностью витаминами В1, В2, В3, В6 и минеральными
Финансирование. Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена при финансировании Российского научного фонда (проект № 20-16-00083-П).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Тышко Н.В.; сбор и статистическая обработка данных - Никитин Н.С.; написание текста, редактирование, утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи - все авторы. Для цитирования: Никитин Н.С., Тышко Н.В. Морфологические особенности печени крыс в условиях разной обеспеченности витаминами и минеральными веществами // Вопросы питания. 2023. Т. 92, № 5. С. 70-79. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5-70-79 Статья поступила в редакцию 09.06.2023. Принята в печать 26.09.2023.
Funding. The research was funded by the Russian Science Foundation (Project No. 20-16-00083-П). Conflict of interest. The authors have no conflict of interest to declare.
Contribution. Concept and design of the study - Tyshko N.V.; collecting and statistical processing the material - Nikitin N.S.; text writing, editing, approval of the final version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article - all authors.
For citation: Nikitin N.S., Tyshko N.V. Rats' liver morphological features under conditions of different supply with vitamins and minerals. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (5): 70-9. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5-70-79 (in Russian) Received 09.06.2023. Accepted 26.09.2023.
Rats' liver morphological features under conditions of different supply with vitamins and minerals
Nikitin N.S., Tyshko N.V.
веществами Feи Mg +, а также данные от 180 животных из 2 экспериментов с моделированной токсической нагрузкой солями кадмия Cd2+ и четыреххлористым углеродом. Возраст крыс на момент отбора материала составлял ~95 дней, продолжительность экспериментов составляла ~65 дней. Для анализа использовали данные о массе тела крыс на день отбора материала, абсолютной и относительной массе печени, диаметре гепатоцита, диаметре ядра и размере цитоплазмы гепатоцитов в центральной и периферической зонах печеночной дольки. Всего было проанализировано по 200 клеток в каждой группе животных. В соответствии со структурой исследования все количественные признаки групп, получавших рационы с обеспеченностью эссенциальными веществами в диапазоне от 75 до 2%, сравнивали с группой, получавшей полноценный рацион (100%).
Результаты. Морфометрические исследования гепатоцитов выявили линейное снижение размеров структурных элементов клетки в ряду сокращения содержания эссенциальных веществ в рационах. В условиях 2-4% обеспеченности витаминами и минеральными веществами диаметры клетки и ядра, а также размер цитоплазмы были соответственно на 16,8; 12,6 и 21,1% ниже (p<0,05), чем у крыс с оптимальной обеспеченностью этими веществами; в условиях 9-19% обеспеченности - на 9,2; 9,7 и 8,7% ниже (p<0,05); более высокие уровни обеспеченности вызывали снижение размеров гепатоцитов, их ядер и цитоплазмы в диапазоне, не превышавшем 5,0% (р>0,05). При сравнении размеров гепатоцитов крыс, испытывавших токсическую нагрузку, с гепатоцитами крыс, отнесенных к эталонному стандарту, отмечено повышение размеров гепатоцитов под действием четыреххлористого углерода в среднем на 17,4% (p<0,05), под действием солей кадмия - на 4,6% (p<0,05).
Заключение. На основании анализа данных морфологических и морфометрических исследований печени были установлены размеры структурных элементов гепатоцитов у крыс, содержавшихся на рационах со снижающейся обеспеченностью витаминами группы В, солями железа и магния; выявлено линейное снижение размеров структурных элементов гепатоцитов в ряду сокращения содержания витаминов группы В, железа и магния в рационах. Токсические воздействия четыреххлористым углеродом и солями кадмия на фоне 19-30-75% обеспеченности эссенциальными веществами приводили к увеличению размеров гепатоцитов, взаимосвязь степени воздействия токсиканта с уровнем обеспеченности незначительна.
Ключевые слова: токсикологические исследования; алиментарная модель снижения адаптационного потенциала; морфометрия; структурные элементы гепатоцитов; дефицит эссенциальных веществ
The current practice of novel food safety assessment in the Russian Federation involves toxicological studies on the alimentary model of adaptation potential reduction of laboratory animals. Since vitamin and mineral deficiency can affect the size of structural elements of tissues, an objective estimation of the results obtained using this model is possible when determining the range of fluctuations of the studied morphometric parameters under conditions of different essential substances' supply, as well as under conditions of simulated toxic effects on the background of the corresponding supply.
The purpose of the research was to investigate the morphological and morphometric features of the liver under the influence of reduced intake of vitamins and mineral elements in the combination with toxic effects of various nature, during growth and puberty of male Wistar rats.
Material and methods. The article analyzed data of 4 model experiments on 140 animals that received semi-synthetic casein diet with different supply of vitamins B1, B2, B3, B6 and mineral elements Fe3+ and Mg2+, as well as data of 2 experiments on 180 animals with simulated toxic load of cadmium (Cd2+) salts and carbon tetrachloride. The animals were ~95 days old at the time of sampling, the duration of the experiments was ~65 days. For the analysis we used data on rats' body weight on the day of material sampling, absolute and relative liver weight, hepatocyte diameter, nucleus diameter and hepatocyte cytoplasm size in the central and peripheral zones of hepatic lobules. A total of 200 cells were analyzed in each group of animals. In accordance with the study design, all quantitative traits of the groups that received diets with an essential nutrient supply ranging from 75 to 2% were compared with the group that received a complete diet (100%).
Results. Morphometric examination of hepatocytes revealed a linear decrease in the size of cell structural elements in the series of reducing the content of essential micronutrients in the diet. Under the conditions of 2-4% vitamin and mineral supply, cell and nucleus diameters as well as cytoplasm size were by ~16.8, 12.6 and 21.1% (p<0.05) lower respectively than in rats with optimal supply of these substances; under the conditions of 9-19% supply were by ~9.2, 9.7 and 8.7% lower (p<0.05); higher levels of supply caused reduction of hepatocyte, nucleus and cytoplasm sizes in a range not exceeding 5% (p>0.05). When comparing the size of hepatocytes of rats subjected to toxic load with the hepatocytes of rats referred to the reference standard, an increase in the size of hepatocytes under the action of carbon tetrachloride by 17.4% (p<0.05) on average and under the action of cadmium salts by 4.6% (p<0.05) was noted. Conclusion. Based on the analysis of liver morphological and morphometric studies' data, there were established sizes of hepatocytes structural elements in the rats kept on diets with decreasing supply with B group vitamins, iron and magnesium salts; the linear decrease in the sizes of structural elements of hepatocytes in the series of reduction of B group vitamins, iron and magnesium intake was revealed. Toxic exposures to carbon tetrachloride and cadmium salts against the background of a 19-30-75% supply with essential substances led to an increase in the hepatocytes size, the correlation between the degree of toxicant exposure and the supply level is not significant.
Keywords: toxicological research; alimentary model of adaptation potential reducing; morphometry; hepatocytes' structural elements; essential substances' deficiency
Одним из приоритетных направлений Стратегии научно-технологического развития Российской Федерации, утвержденной Указом Президента РФ от 01.12.2016 № 642, является переход к высокопродук-
тивному и экологически чистому агро- и аквахозяйству. Реализация этого направления позволит обеспечить не только стабильное развитие сельскохозяйственного производства, но и расширение продовольственной
50
$ 50 60 Обеспеченность витаминами B.|, B2, B3, B6 cÇ> солями Fe3+, Mg2+, %
*100% соответствует содержанию эссенциальных веществ в рационе AIN-93
Supply of vitamins Bp B2, B3, BB, salts of Fe3+, Mg2+, %
*100% corresponds to the content of essential substances in the AIN-93 diet
<b
03
03- "
Рис. 1. Используемые дозировки эссенциальных веществ в рационах
Fig. 1. Doses of essential substances used in diets
базы за счет пищевой продукции нового вида. Использование нетрадиционных источников пищи относится к устойчивому тренду начала XXI в., обеспечение безопасности такой продукции регулируется на государственном уровне, и к настоящему времени уже сформированы подходы к оценке безопасности этой продукции и накоплена научно обоснованная доказательная база отсутствия неблагоприятных эффектов для здоровья, в том числе - результаты исследований на поколениях.
В рамках совершенствования российской системы оценки безопасности генно-инженерно-модифициро-ванной пищевой продукции нового вида была проведена масштабная научная работа, результатом которой, в частности, стала in vivo модель повышения чувствительности лабораторных животных к токсической нагрузке [1]. Принцип действия данной модели основан на модификации состава рациона, вызывающей снижение адаптационного потенциала организма, ее эффективность подтверждена в токсикологических и репротоксикологических исследованиях с низкими дозами токсикантов [2-6].
Важным этапом исследований по формированию модели снижения адаптационного потенциала являлось установление границ нормы для целого ряда изучаемых параметров, поскольку очевидно, что в условиях дефицита эссенциальных веществ эти границы могут быть смещены.
Цель работы - изучение морфологических и мор-фометрических особенностей печени под влиянием сниженного поступления витаминов и минеральных веществ с рационом в сочетании с токсическими воздействиями различной природы в период роста и полового созревания крыс-самцов линии Вистар.
Материал и методы
Исследования выполнены на крысах-самцах линии Вистар, полученных из питомника лабораторных животных Филиал «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. В статье проанализированы данные
от 140 животных из 4 модельных экспериментов [1, 2, 7], получавших полусинтетический казеиновый рацион с разной обеспеченностью витаминами В1, В2, В3, В6 и минеральными веществами Fe3+ и Mg2+ (рис. 1), а также данные от 180 животных из 2 экспериментов с моделированной токсической нагрузкой солями кадмия Cd2+ (доза кадмия различалась в зависимости от возраста крыс и составляла 1 мг/кг массы тела с 0-го по 35-й день эксперимента и 2 мг/кг массы тела с 36-го по 65-й день эксперимента) [2] и четыреххлористым углеродом (CCl4) (суммарно каждое животное получило CCl4 в количестве 6,5 г/кг массы тела) [8]. Дизайн экспериментов с токсикантами представлен в табл. 1.
Все данные получены от крыс одного возраста (~95 дней), длительность экспериментов составляла ~65 дней. Для анализа использовали данные о массе тела крыс на день отбора материала, абсолютной и относительной массе печени, диаметре ядра, диаметре гепатоцита, размере цитоплазмы в центральной и периферической зонах печеночной дольки.
Материалом для морфометрических исследований были ткани печени из левой боковой доли, окрашенные гематоксилином и эозином. Приготовление и окрашивание гистологических препаратов проводили по стандартной схеме [9]. Гистологические препараты изучали в световом микроскопе Axio Imager Z1 (Carl Zeiss, ФРГ), для фотосъемки использовали цифровую фотокамеру AxioCam HRc (Carl Zeiss, ФРГ), морфо-метрию проводили с помощью программного обеспечения AxioVision Rel.4.8 (Carl Zeiss, ФРГ) с применением калибровочного слайда X/Y (Микромед, цена деления шкалы - 0,01 мм).
Принимая во внимание различия морфофункцио-нальных признаков гепатоцитов периферии и центра дольки, затрагивающие размеры клеток, органелл и др., в данном исследовании проведена морфометрия гепа-тоцитов центральной (3-я зона печеночного ацинуса) и периферической (1-я зона ацинуса) зон печеночной дольки. C каждого микропрепарата анализировали не менее 20 клеток центральной и периферической зоны дольки от каждого животного, всего было проанализировано по 200 клеток в каждой группе. На гистологических препаратах печени при увеличении х400 определяли диаметр ядер гепатоцитов и диаметр всей клетки, размер цитоплазмы рассчитывали по формуле:
Цитоплазма = DK
, - D
ядра>
где D - диаметр в мкм.
Полученные данные представлены в виде M±m, где М - среднее арифметическое измеряемого показателя, m - стандартная ошибка. Статистическую обработку проводили, используя программы Microsoft Excel 2013 и IBM SPSS Statistics 23 (IBM, США). Были применены параметрические методы статистики при условии соблюдения нормальности распределения и равенства дисперсий - сравнение средних с помощью f-критерия
Таблица 1. Дизайн экспериментов с кадмием и четыреххлористым углеродом Table 1. Design of experiments with cadmium and carbon tetrachloride
Группа Group Обозначение группы на рис. 5 The group designation In Fig. 5 Рацион Diet Содержание витаминов В-,, В2, В3 и В6, солей Fe3+ и Mg2+ в рационе, % от базового (AIN-93) уровня Content of vitamins Bb B2. B3 and Be. salts of Fe3+ and Mg2+ in the diet, % of the base (AIN-93) level Токсическое воздействие: Cd2+ или CCl4 Toxic effect: Cd 2+ or CCl4
Контроль-75 / Control-75 - = ■ 1 75 -
Опыт-75 / Test-75 75+Cd / 75+CCl4 Ü +
Контроль-30 / Control-30 - Is 30 -
0пыт-30 / Test-30 30+Cd / 30+CCl4 1 +
Контроль-19 / Control-19 - 19 -
Опыт-19 / Test-19 19+Cd / 19+CCl4 о ^ +
для независимых выборок, критический уровень значимости (р) принимали равным 0,05. В соответствии со структурой исследования все количественные признаки групп, получавших рационы с обеспеченностью эссенциальными веществами в диапазоне от 75 до 2%, сравнивали с группой, получавшей полноценный рацион (100%).
Результаты и обсуждение
В рамках каждого эксперимента были проведены комплексные гравиметрические, гематологические, биохимические, морфологические исследования, изучены показатели системы антиоксидантной защиты, в том числе целый ряд системных биомаркеров - интегральных показателей, отражающих уровень адаптации организма к неблагоприятным факторам окружающей среды [1-6, 9]. На основании анализа полученных данных группы животных были объединены в 4 диапазона по содержанию эссенциальных веществ: 100%+75%+50%, 30%+25%+21%, 19%+9% и 4%+2%, -внутри которых отмечены незначительные различия изучаемых показателей и не выявлено явных закономерностей изменения оцениваемых параметров в зависимости от уровней содержания витаминов и минеральных веществ в рационе. В качестве эталонного стандарта использовали значения соответствующих показателей, полученные от крыс, содержавшихся на рационе со 100% обеспеченностью всеми пищевыми веществами.
Общее состояние крыс групп с обеспеченностью эссенциальными веществами в диапазоне 100-9% было удовлетворительным, по внешнему виду, качеству шерстного покрова, поведению разницы между группами не отмечено. При этом масса тела крыс достоверно снижалась в ряду 100%^100%+75%+50%^ 30%+25%+21%^19%+9%. Поедаемость корма самцами групп 100-21% была примерно одинаковой и составляла ~18-19 г/крысу в сутки, тогда как поедаемость корма самцами группы 19%+9% была несколько ниже и составляла ~14-15 г/крысу в сутки.
Общее состояние крыс группы с обеспеченностью эссенциальными веществами на уровне 4%+2% было
неудовлетворительным, отмечены ухудшение качества шерстного покрова (выпадение волос), склонность к кровотечениям (слизистые оболочки носа и глаз), снижение поедаемости корма (~12-14 г/крысу в сутки). Начиная с 45-го дня эксперимента зафиксированы случаи гибели животных этой группы. При проведении постмортальной некропсии обнаружены патологические изменения, характерные для кахексии: уменьшение висцеральной и подкожной жировой ткани, атрофия всех групп скелетных мышц, уменьшение размеров внутренних органов и др. Масса тела животных этой группы была значительно ниже, чем масса тела крыс со 100-9% обеспеченностью эссенциальными веществами (табл. 2).
Общее состояние крыс в группах, подвергшихся воздействию кадмия или СС14 на фоне различной обеспеченности эссенциальными веществами, было удовлетворительным, по внешнему виду, поведению и качеству шерстного покрова различий между группами, а также отличий от соответствующих контрольных групп не выявлено.
Масса печени крыс коррелировала со значениями массы тела, также уменьшаясь в ряду 100%^100%+ 75%+50%^30%+25%+21%^19%+9%^4%+2%, относительная масса печени не различалась между группами (см. табл. 2).
Морфологические исследования печени показали, что у животных всех групп микроструктура печени сохранена: пластинки гепатоцитов в виде балок радиально расходятся от периферии печеночной дольки к центральной вене. Центральные вены, сосуды портальных трактов, синусоидальные капилляры оставались умеренно кровенаполнеными форменными элементами крови, желчные капилляры обычного размера. Меж-дольковая соединительная ткань выражена слабо. Гепа-тоциты имели хорошо выраженные контуры округлой формы с расположенным в центре круглым ядром и преимущественно однородной, без включений, цитоплазмой (рис. 2-4).
У животных, подвергавшихся воздействию кадмия, в печени не обнаружено морфологических признаков интоксикации, тогда как на фоне действия СС14 отмечен ряд патологических изменений, включавших средне- и крупнокапельный стеатоз всех зон ацинуса, лобулярное
А/А Б/В
Рис. 2. Печень, центральная зона: группа 2% (А); группа 100% (Б). Окрашивание гематоксилином и эозином, х200 Fig. 2. Liver, centrilobular zone: group 2% (A); group 100% (B). H&E, х200
воспаление, а также перипортальный и центролобу-лярный фиброз (см. рис. 4). Действие CCl4 на фоне 19% обеспеченности витаминами и минеральными веществами вызывало более выраженные признаки стеатоза, липидные включения встречались у большего количества гепатоцитов [8].
Морфометрические исследования структуры паренхимы печени выявили определенные различия между группами животных, получавшими рационы с разным содержанием витаминов и минеральных веществ: размер гепатоцитов центральной и периферической зоны дольки снижался в ряду понижения содержания эссенциальных веществ в рационе - 100%^100%+75%+50%^-30%+25%+ 21%^19%+9%^4%+2% (см. табл. 2, рис. 5).
В группах, получавших токсическую нагрузку CCl4, размер гепатоцитов центральной и периферической
зоны дольки значительно увеличивался, причем наиболее заметные изменения наблюдались у группы с 19% обеспеченностью эссенциальными веществами в рационе (см. табл. 2, рис. 5).
В группах, получавших токсическую нагрузку кадмием, размер гепатоцитов центральной и периферической зоны дольки имел схожие изменения, но не такие выраженные, и наиболее заметные изменения наблюдались у группы с 30% обеспеченностью эссенциальными веществами (см. табл. 2).
Для упрощения оценки степени изменения изученных показателей все результаты были обобщены на графиках, где значение каждого показателя в группе с оптимальной обеспеченностью эссенциальными веществами (эталонный стандарт) принято за 100% (на графике соответствуют нулю по оси абсцисс),
А/А Б/В
Рис. 3. Печень, центральная зона: группа 2% (А); группа 100% (Б). Окрашивание гематоксилином и эозином, х400 Fig. 3. Liver, centrilobular zone: group 2% (A); group 100% (B). H&E, х400
ш
о
"О
о о
О"
ш
I
s аз
H
о
CD Ю
Ю О Ю Gû
Таблица 2. Масса тела и печени крыс, морфометрические показатели гепатоцитов центральной и периферической зон Table 2. Rats body and liver weight, morphometric parameters of hepatocytes from centrilobular and periportal zone
Показатель Indicator Группа животных / Animal group
не подвергались токсическому воздействию have not been exposed to any toxic effects подвергались токсическому воздействию have been exposed to toxic effects
100% 100%+75%+50% 30%+25%+21% 19%+9% 4%+2% 75%+CCI4 30%+CCI4 19%+ССЦ 75%+Cd 30%+Cd 19%+Cd
Масса тела, г Body weight, g M±m 414±8 394±3* 351±5* 279±7* 137±3* 350±8* 331±7* 305±8* 377±6* 343±6* 264±10*
min-max 352^187 260-505 236-440 100-394 110-177 264^168 230-415 241-391 303-433 283-410 164-356
Масса печени, г Liver weight, g M±m 12,51±0,37 11,49±0,16* 10,39±0,15* 8,41 ±0,20* 4,11 ±0,17* 11,02±0,38* 10,41 ±0,31* 9,28±0,31* 10,96 ±0,22* 10,09 ±0,20* 8,41 ±0,32*
min-max 9,12-15,62 7,51-15,68 7,54-14,60 2,33-12,47 2,25-6,02 7,32-15,99 7,59-13,48 7,17-12,97 9,13-13,59 8,14-12,28 5,35-12,54
Относительная масса печени, % Relative liver weight, % M±m 3,02±0,07 2,92 ±0,03 3,01 ±0,05 3,07±0,06 2,98±0,07 3,14±0,06 3,15±0,07 3,04±0,04 2,91 ±0,04 2,94 ±0,05 3,19±0,04*
min-max 2,55-3,68 2,04-3,77 2,18-5,00 2,33-6,63 2,04-4,06 2,66-4,08 2,29-4,65 2,72-3,48 2,50-3,30 2,50-3,51 2,76-3,52
Центральная зона / Centrilobular zone
Диаметр клетки, мкм Hepatocyte diameter, ¡rm M±m 16,07±0,17 16,16±0,09 15,50 ±0,09* 14,60±0,13* 13,26±0,14* 18,77±0,24* 18,15±0,26* 20,04±0,29* 16,49±0,16 17,44 ±0,21* 15,81 ±0,22
min-max 12,60-20,45 11,15-23,08 10,31-21,47 9,07-22,22 9,33-18,41 14,52-23,70 13,01-25,58 14,42-26,60 12,65-19,95 12,40-22,64 11,42-23,23
Диаметр ядра, мкм Nucleus diameter, ¡rm M±m 8,10±0,07 8,01 ±0,04 7,74±0,04* 7,21 ±0,06* 7,00 ±0,06* 9,57±0,10* 9,26±0,11* 9,85±0,10* 7,73±0,08* 8,45±0,08* 7,42±0,08*
min-max 6,52-10,19 5,36-10,48 5,78-9,62 4,65-10,07 5,11-9,47 7,62-12,19 7,26-12,10 7,85-13,17 5,83-9,19 6,25-10,57 5,77-10,37
Размер цитоплазмы, мкм Dimension of cytoplasm, ¡rm M±m 7,97±0,15 8,15±0,08 7,76±0,08 7,38±0,11* 6,26±0,12* 9,20±0,21* 8,89±0,20* 10,19±0,26* 8,77±0,14* 9,00±0,17* 8,39±0,20
min-max 4,86-12,04 4,37-14,16 3,94-12,90 2,64-14,01 2,41-11,21 4,00-14,84 5,12-14,74 5,17-17,48 5,75-11,79 4,56-12,78 4,91-15,94
Периферическая зона / Perlportal zone
Диаметр клетки, мкм Hepatocyte diameter, ¡rm M±m 16,07±0,14 16,45±0,08 15,58±0,09* 14,59±0,11* 13,49±0,14* 19,08±0,21* 18,36±0,26* 18,85±0,24* 16,75±0,16* 17,58±0,19* 16,80 ±0,19*
min-max 12,76-19,31 12,06-22,27 9,94-20,51 9,36-21,03 8,66-18,44 14,87-24,54 12,37-25,27 12,94-24,88 11,45-20,57 12,78-23,30 13,44-22,79
Диаметр ядра, мкм Nucleus diameter, pm M±m 8,01 ±0,06 8,29±0,04* 7,85±0,04* 7,33±0,05* 7,09±0,05* 9,54 ±0,09* 8,97±0,10* 9,66±0,11* 7,93±0,07 8,36±0,08* 8,07±0,09
min-max 6,55-9,53 6,00-11,21 5,99-10,02 5,13-10,05 5,23-8,84 7,56-12,06 6,71-11,90 7,62-12,63 6,19-10,13 6,42-10,21 5,86-10,31
Размер цитоплазмы, мкм Dimension of cytoplasm, ¡rm M±m 8,06 ±0,14 8,16±0,08 7,72±0,08 7,25±0,10* 6,40±0,12* 9,54 ±0,19* 9,38 ±0,23* 9,18±0,21* 8,82 ±0,14* 9,22±0,18* 8,73±0,17*
min-max 4,21-11,61 3,12-12,91 3,45-12,81 2,99-12,94 3,24-11,86 5,17-15,63 4,23-14,12 3,33-14,64 5,21-12,65 5,68-15,18 5,74-14,85
in
Примечание. * - статистически значимое отличие (р<0,05) от уровня контрольной группы с оптимальной обеспеченностью эссенциальными веществами (эталонный стандарт). Note. * - differences are significant (p<0.05) from the level of the control group with optimal intake of essential nutrients (reference standard).
г
E
Ж
о
IE
bo
Рис. 4. Печень, центральная зона: группа 19% - контроль (A); группа 19% +CCl4 (Б). Окрашивание гематоксилином и эозином, х200 Fig. 4. Liver, centrilobular zone: control group 19% (A); test group 19%+CCL4 (B). H&E, х200
а процентные соотношения различии с анализируемыми группами представлены в виде столбиков (см. рис. 5).
Как показано на рис. 5, масса тела и печени крыс снижалась в ряду понижения обеспеченности рационов витаминами и минеральными веществами: наиболее выраженное снижение массы тела и печени у крыс отмечено в группе с 2-4% обеспеченностью -на ~65-68% от оптимального уровня. Масса тела и абсолютная масса печени крыс, получавших токсическую нагрузку кадмием и СС14 на фоне снижающейся обеспеченности эссенциальными веществами, не имели значимых различий с животными, содержавшимися на аналогичных рационах и не подвергавшихся токсическому воздействию. Так, снижение массы тела и печени у крыс, получавших рационы с 19% обеспеченностью эссенциальными веществами, вне зависимости от наличия/отсутствия токсической нагрузки, составляло ~30%. Относительная масса печени у крыс всех групп варьировала в незначительных пределах от -4 до 6%.
Морфометрические исследования гепатоцитов выявили линейные изменения (снижение размеров структурных элементов клетки) в ряду сокращения содержания эссен-циальных веществ в рационах (см. рис. 5). В условиях 2-4% обеспеченности витаминами и минеральными веществами диаметры клетки и ядра, а также размер цитоплазмы были соответственно на 16,8; 12,6 и 21,1% ниже (р<0,05), чем у крыс с оптимальной обеспеченностью этими веществами; в условиях 9-19% обеспеченности - на 9,2; 9,7 и 8,7% ниже (р<0,05); более высокие уровни обеспеченности вызывали снижение размеров гепатоцитов, их ядер и цитоплазмы в диапазоне, не превышавшем 5,0% (р>0,05). Следует отметить, что 2-4% обеспеченность эссенциальными веществами соответствует наихудшему сценарию, при котором уровень риска развития патологии у животных составлял более 50%, - об этом свидетельствовала высокая смертность крыс в этих группах [1], т.е. степень сокращения размеров гепатоцитов у крыс этой группы можно отнести к патологической, несовместимой с жизнью.
Таблица 3. Морфометрические показатели гепатоцитов у крыс, по данным литературы Table 3. Morphometric parameters of hepatocytes in rats: literature data
Линия крыс / Rat's strain Ядро, мкм / Nucleus, ym Клетка, мкм / Cell, ym Источник литературы / References
Вистар / Wistar 6,05 13,9 [10]
6,65* 18,02* [11]
7,13 19,17 [12]
- 18,35 [13]
7,20* 17,6 [14]
6,47* 16,6 [15]
Белые крысы / White rats 9,90* 25,20* [16]
8,30* 20,32* [17]
Белые беспородные / White outbred rats 7,37 13,53 [18]
7,35 15,53 [19]
П р и м е ч а н и е. * - вычислено из площади. N o t e. * - calculated from area.
Масса тела / Body weight
т
ООО ООО
ООО
0 -10-20-30-40-50-60-70-
Масса печени / Liver weight
—тт[
СТ> СУ о О О "t "t О о о
ООО
20 15 10 5 0 -5 -10 -15 -20
Относительная масса печени / Relative liver weight
75 22
СТ> СУ о О О о о о
ООО
0
2520-
10-
-10-15-20-25-
Диаметр клетки, центральная зона Hepatocyte diameter centrilobular zone
25 20 15 10 5 0 -5 -10 -15 -20 -25
Диаметр ядра, центральная зона Nucleus diameter centrilobular zone
25 20 15 10 5 0 -5 -10 -15 -20 -25
Цитоплазма, центральная зона Cytoplasm centrilobular zone
I J.l-
ООО
ООО
ООО
2520-
10-
Диаметр клетки, периферическая зона Hepatocyte diameter periportal zone
-10-
-20-25-
ш
СП су о о о + + о о о
ООО
25 20 15 10 5 0 -5 -10 -15 -20 -25
Диаметр ядра, периферическая зона Nucleus diameter periportal zone
_
СЛ СУ о О О + + О О О
ООО
25 20 15 10 5 0 -5 -10 -15 -20 -25
Цитоплазма, периферическая зона Cytoplasm periportal zone
I
■ I
ООО ООО
ООО
Рис. 5. Изменение гравиметрических и морфометрических показателей у крыс в зависимости от уровня обеспеченности эссенциаль-ными микронутриентами
П р и м е ч а н и е. Данные представлены в % от уровня контрольной группы с оптимальной обеспеченностью эссенциальными веществами (эталонный стандарт); * - отличия от эталонного стандарта достоверны при р<0,05.
Fig. 5. Changes of gravimetric and morphometric indices in rats depending on the intake of essential micronutrients
N o t e. In % of the level of the control group with optimal content of essential substances (reference standard); * - differences with the reference standard are significant at p<0.05
Сравнительный анализ размеров гепатоцитов крыс, подвергавшихся действию токсикантов на фоне 75, 30 и 19% обеспеченности витаминами и минеральными веществами, продемонстрировал повышение размеров гепатоцитов под действием СС14 в среднем на 17,8; 13,6 и 21,0% (р<0,05) [здесь и далее - от уровня контрольной группы с оптимальной обеспеченностью эссенциаль-ными веществами (эталонный стандарт)]; под действием солей кадмия - на 3,4; 8,9 и 1,4% соответственно (для гепатоцитов периферической зоны р<0,05). При сравнении размеров гепатоцитов крыс, испытывавших токсическую нагрузку, с гепатоцитами крыс, отнесенных к эталонному стандарту, отмечено повышение размеров гепатоцитов под действием СС14 в среднем на 17,4%, под действием солей кадмия - на 4,6% (см. рис. 5).
Сравнение полученных результатов морфометриче-ских исследований гепатоцитов с данными литературы свидетельствует о сходстве размеров гепатоцитов у половозрелых крыс с оптимальной обеспеченностью эссенциальными веществами (табл. 3).
Согласно [20], различия в размерах органов между животными одного вида, пола и возраста могут быть следствием различий в размере их клеток, количестве клеток или в том и другом. Количество клеток, как и их размер, зависят от внутриклеточных программ и от внеклеточных сигнальных молекул, которые регулируют эти программы. Результаты, изложенные в данной статье, не противоречат этому предположению, дополняя его в части факторов, влияющих на размеры структурных элементов гепатоцитов. В публикациях [21, 22] отмечено, что структура печени млекопита-
ющих преимущественно формируется в антенатальном и раннем постнатальном периодах, что не согласуется с полученными нами результатами в части влияния на размер гепатоцитов обеспеченности эссенциальными элементами в более позднем возрасте - 30-90 дней жизни крыс. Существует целый ряд публикаций об особенностях роста и строения печени в разные периоды онтогенеза: в раннем постнатальном периоде масса печени увеличивается в основном за счет гиперплазии гепатоцитов, а у взрослых и стареющих животных все большее значение приобретает гипертрофия, приводящая к увеличению объема и массы органа или его клеток [23, 24]. В наших исследованиях была смоделирована ситуация, приводящая, как было показано, к гипотрофии гепатоцитов, что свидетельствует о более значительных структурных изменениях, лежащих в основе механизмов снижения адаптационного потенциала крыс в условиях дефицита эссенциальных алиментарных факторов.
Увеличение размеров гепатоцитов на фоне интоксикации СС14 согласуется с данными других авторов [25, 26], связывающих гипертрофию с более значительной функциональной активностью паренхимы печени, активацией внутриклеточных гиперпластических процессов, повышением энергетических и регенераторных возможностей клеток.
Сведения об авторах
Данных о размерах структурных элементов печени крыс в условиях алиментарных дефицитов и интоксикаций на фоне алиментарных дефицитов в доступной литературе не обнаружено.
Заключение
На основании анализа данных морфологических и морфометрических исследований печени 320 крыс были установлены размеры структурных элементов гепатоцитов у крыс, содержавшихся на рационах со снижающейся обеспеченностью витаминами группы В, солями железа и магния; выявлено линейное снижение размеров структурных элементов гепатоцитов в ряду сокращения содержания витаминов группы В, солей железа и магния в рационах; токсические воздействия СС14 и солями кадмия на фоне 19-30-75% обеспеченности эссенциальными веществами приводили к увеличению размеров гепатоцитов, взаимосвязь с уровнем обеспеченности незначительна.
Полученные данные интегрированы в методологию анализа результатов морфологических исследований, проводимых на модели снижения адаптационного потенциала, в том числе при оценке безопасности пищевой продукции нового вида.
Никитин Николай Сергеевич (Nikolay S. ^Шп) - младший научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) Е-таИ: nikolay_sergeevich87@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-5091-0991
Тышко Надежда Валерьевна (Nadezhda V. Tyshko) - доктор медицинских наук, заведующий лабораторией оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) Е-таИ: tnv@ion.ru
https://orcid.org/0000-0002-8532-5327
Литература
Тышко Н.В., Садыкова Э.О., Тимонин А.Н., Шестакова С.И., Тре-бух М.Д., Пашорина В.А. Модификация витаминно-мине-рального состава рационов как модель снижения адаптационного потенциала крыс для токсикологических исследований // Вопросы питания. 2016. Т. 85, № 6. С. 64-71. DOI: https://doi. org/10.24411/0042-8833-2016-00079
Тышко Н.В., Садыкова Э.О., Тимонин А.Н., Шестакова С.И., Мустафина О.К., Сото С.Х. Изучение влияния интоксикации кадмием на модели витаминно-минеральной недостаточности у крыс // Вопросы питания. 2018. Т. 87, № 1. С. 63-71. DOI: https:// doi.org/10.24411/0042-88332018-10007
Никитин Н.С. Морфологические изменения печени крыс в условиях витаминно-минеральной недостаточности // Вопросы питания. 2018. Т. 87, № S5. C. 39-40. DOI: https://doi.org/10.24411/ 0042-8833-2018-10122
Tsatsakis A., Goumenou M., Tyshko N.V., Shestakova S.I., Sadyko-va E.O., Zhminchenko V.M. et al. Detrimental effects of 6 months exposure to very low doses of a mixture of six pesticides associated with chronic vitamin deficiency on rats // Food Chem. Toxicol. 2021. Vol. 152. Article ID 112188. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fct.2021.112188 Tyshko N.V., Sadykova E.O., Shestakova S.I., Nikitin N.S., Tre-bukh M.D. et al. The use of the adaptation potential reduction model for reproductive toxicity research in vivo // J. Toxicol. 2020. Vol. 2020. Article ID 8834630. DOI: https://doi.org/10.1155/2020/8834630
10.
Тышко Н.В., Никитин Н.С., Шестакова С.И., Садыкова Э.О., Тре-бух М.Д., Гусева Г.В. и др. Системные биомаркеры и морфология печени крыс при хроническом введении малых доз токсикантов на фоне витаминной недостаточности // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2022. Т. 174, № 9. С. 356-360. DOI: https://doi.org/10.47056/0365-9615-2022-174-9-356-360 Tyshko N.V., Shestakova S.I. Model of vitamin and mineral deficiency for toxicological research: apoptosis activity under conditions of CCL4 intoxication // Toxicol. Rep. 2018. Vol. 6. P. 151-154. DOI: https://doi. org/10.1016/j.toxrep.2018.12.005
Никитин Н.С., Кузнецов С.Л., Тышко Н.В. Микроструктура печени у крыс при введении CCL4 на фоне витаминно-мине-ральной недостаточности // Морфология. 2019. Т. 155, № 3. С. 42-47.
Коржевский. Д.Э. Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии. Санкт-Петербург : СпецЛит, 2013. 128 с. ISBN 978-5-299-00569-1.
Bhadoria P., Nagar M., Bahrioke V., Bhadoria A. S. Effect of ethephon on the liver in albino rats: a histomorphometric study // Biomed. J. 2015. Vol. 38, N 5. P. 421-427. DOI: https://doi.org/10.4103/2319-4170.155589
Янко Р.В., Чака Е.Г., Зинченко А.С., Сафонов С.Л., Левашов М.И. Особенности моделирования жирового гепатоза у крыс разного
6
2
7
8
3.
9
4
5
возраста на основе высококалорийного рациона // Ожирение и метаболизм. 2021. Т. 18, № 4. С. 387-397. DOI: https://doi. org/10.14341/omet12789 19.
12. Rosioru C., Talu S., Talu M., Giovanzana S., Craciun C. Morphometric assessments for the healthy rat hepatocytes // Ann. RSCB. 2012. Vol. 17,
N 1. P. 74-79. 20.
13. Prawitasari S., Saraswati T.R., Tana S. Liver histological structure of rats (Rattus norvegicus) in the lactation period after supplemented
with organic quail eggs // J. Phys. Conf. Ser. 2019. Vol. 1217. Article 21. ID 012154. DOI: https://doi.org/10.1088/1742-6596/1217/1/012154
14. Янко Р.В., Чака Е.Г., Литовка И.Г., Левашов М.И. Морфологические изменения печени крыс разного возраста после введения хлорида магния // Журнал Белорусского государственного 22. университета. Биология. 2019, № 3. С. 40-48. DOI: https://doi. org/10.33581/2521-1722-2019-3-40-48
15. Yanko R., Chaka E., Levashov M. Morphofunctional changes in the rat's liver of different ages after L-methionine administration //
J. Educ. Health Sport. 2022. Vol. 12, N 1. P. 125-137. DOI: https://doi. 23. org/10.12775/JEHS.2022.12.01.010
16. Лебедева Е.И., Мяделец О.Д., Прудников В.С. Морфофункцио- 24. нальная характеристика печени белых крыс в норме // Ученые записки УО ВГАВМ. 2015. T. 51, № 1. С. 80-83.
17. Ельчанинов А.В., Большакова Г.Б. Размер гепатоцитов и их 25. ядер в регенерирующей фетальной печени крыс // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2011. Т. 19, № 2. С. 1-4.
18. Джадранов Е.С., Ергазина М.Ж., Джангельдина З.Н., Красно- 26. штанов А.В., Красноштанов В.К. Возрастные морфологические
особенности печени и щитовидной железы беспородных лабораторных крыс // Вестник КазНМУ. 2015. № 3. С. 220-222. Андреева С.Д. Цитокиновый статус и деструктивные поражения печени при экспериментальном остром панкреатите // Иппология и ветеринария. 2020. № 3. С. 69-73.
Conlon I., Raff M. Size control in animal development // Cell.
1999. Vol. 96, N 2. P. 235-244. DOI: https://doi.org/10.1016/s0092-8674(00)80563-2
Sasaki K., Sonoda Y. Histometrical and three-dimensional analyses of liver hematopoiesis in the mouse embryo // Arch. Histol. Cytol.
2000. Vol. 63, N 2. P. 137-146. DOI: https://doi.org/10.1679/aohc. 63.137
Guo Y., Zhang X., Huang J., Zeng Y., Liu W., Geng C. et al. Relationships between hematopoiesis and hepatogenesis in the midtrimester fetal liver characterized by dynamic transcriptomic and proteomic profiles // PLoS One. 2009. Vol. 4, N 10. Article ID e7641. DOI: https://doi. org/10.1371/journal.pone.0007641
Бабаева А.Г. Регенерация: факты и перспективы. Москва : Изд-во РАМН, 2009. 336 с. ISBN 978-5-7901-0085-7.
Timchenko N.A. Aging and liver regeneration // Trends Endocrinol. Metab. 2009. Vol. 20, N 4. P. 171-176. DOI: https://doi.org/10.1016/j. tem.2009.01.005
Байгильдин С.С., Каримов Д.О., Хуснутдинова Н.Ю., Смолянкин Д.А., Репина Э.Ф. Морфология печени крыс через 72 часа после воздействия тетрахлорметана // Медицина труда и экология человека. 2018. № 4. С. 143-149.
Rui L. Energy metabolism in the liver // Comp. Physiol. 2014. Vol. 4, N 1. P. 177-197. DOI: https://doi.org/10.1002/cphy.c130024
References
1. Tyshko N.V., Sadykova E.O., Timonin A.N., Shestakova S.I., Trebukh 13. M.D., Pashorina V.A. Modification of vitamin-mineral diet composition as a model of adaptive potential reducing in laboratory animals. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2016; 85 (6): 64—71. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2016-00079 (in Russian) 14.
2. Tyshko N.V., Sadykova E.O., Timonin A.N., Shestakova S.I., Mustaphina O.K., Soto C.J. Research of the cadmium intoxication effect on the model of vitamin-mineral deficiency in rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (1): 63-71. DOI: https://doi. 15. org/10.24411/0042-88332018-10007 (in Russian)
3. Nikitin N.S. Morphological changes in the liver of rats under conditions of vitamin-mineral deficiency. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (S5): 39-40. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2018- 16. 10122 (in Russian)
4. Tsatsakis A., Goumenou M., Tyshko N.V., Shestakova S.I., Sadykova E.O., Zhminchenko V.M., et al. Detrimental effects of 6 months exposure to very low doses of a mixture of six pesticides associated with chronic vitamin deficiency on rats. Food Chem Toxicol. 2021; 152: 17. 112188. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fct.2021.112188
5. Tyshko N.V., Sadykova E.O., Shestakova S.I., Nikitin N.S., Trebukh M.D., et al. The use of the adaptation potential reduction model for reproductive toxicity research in vivo // J. Toxicol. 2020. Vol. 2020. Article ID 8834630. DOI: https://doi.org/10.1155/2020/8834630 18.
6. Tyshko N.V., Nikitin N.S., Shestakova S.I., Sadykova E.O., Tre-bukh M.D., Guseva G.V. System biomarkers and liver morphology of rats during chronic low doses toxicants administration on the background
of vitamin deficiency. Byulleten' eksperimental'noi biologii i meditsiny 19. [Bulletin of Experimental Biology and Medicine]. 2022; 174 (9): 356-60. DOI: https://doi.org/10.47056/0365-9615-2022-174-9-356-360 (in Russian)
7. Tyshko N.V., Shestakova S.I. Model of vitamin and mineral defi- 20. ciency for toxicological research: apoptosis activity under conditions
of CCL4 intoxication. Toxicol Rep. 2018; 6: 151-4. DOI: https://doi. 21. org/10.1016/j.toxrep.2018.12.005
8. Nikitin N.S., Kuznetsov S.L., Tyshko N.V. Rats' liver morphology under the conditions of CCL4 administration on the background of 22. vitamin-mineral deficiency. Morfologiya [Morphology]. 2019; 155 (3): 42-7. (in Russian)
9. Korzhevsky D.E. Morphological diagnostics. Preparation of material for histological examination and electron microscopy. Saint Petersburg: SpetsLit, 2013: 128 p. ISBN 978-5-299-00569-1. (in Russian) 23.
10. Bhadoria P., Nagar M., Bahrioke V., Bhadoria A. S. Effect of ethephon on the liver in albino rats: a histomorphometric study. Biomed J. 2015;
38 (5): 421-7. DOI: https://doi.org/10.4103/2319-4170.155589 24.
11. Yanko R.V., Chaka E.G., Zinchenko A.S., Safonov S.L., Levashov M.I. Features of modeling fatty liver disease in rats of different ages based on a high-calorie diet. Ozhirenie i metabolizm [Obesity and 25. Metabolism]. 2021; 18 (4): 387-97. DOI: https://doi.org/10.14341/ omet12789(in Russian)
12. Rosioru C., Talu S., Talu M., Giovanzana S., Craciun C. Morphometric assessments for the healthy rat hepatocytes. Ann RSCB. 2012; 17 (1): 26. 74-9.
Prawitasari S., Saraswati T.R., Tana S. Liver histological structure of rats (Rattus norvegicus) in the lactation period after supplemented with organic quail eggs. J Phys Conf Ser. 2019; 1217: 012154. DOI: https://doi.org/10.1088/1742-6596/1217/V012154 Yanko R.V., Chaka E.G., Litovka I.G., Levashov M.I. Zhurnal Belo-russkogo gosudarstvennovo universiteta. Biologiya [Journal of the Belarusian State University. Biology]. 2019; (3): 40-8. DOI: https://doi. org/10.33581/2521-1722-2019-3-40-48 (in Russian) Yanko R., Chaka E., Levashov M. Morphofunctional changes in the rat's liver of different ages after L-methionine administration. J Educ Health Sport. 2022; 12 (1): 125-37. DOI: https://doi.org/10.12775/ JEHS.2022.12.01.010
Lebedeva E.I., Myadelets O.D., Prudnikov V.S. Morphofunctional characteristics of the white rats' liver in norm. Uchenye zapiski UO VGAVM [Scientific Notes of the Educational Establishment «Vitebsk the Order of "the Badge of Honor"» State Academy of Veterinary Medicine]. 2015; 51 (1): 80-3. (in Russian)
El'chaninov A.V., Bol'shakova G.B. Size of hepatocytes and their nuclei in regenerating fetal rats' liver. Rossiyskiy mediko-biologicheskiy vestnik imeni akademika I.P. Pavlova [Russian Medical and Biological Bulletin named after academician I.P. Pavlov]. 2011; 19 (2): 1-4. (in Russian)
Dzhadranov E.S., Ergazina M.Zh., Dzhangel'dina Z.N., Kras-noshtanov A.V., Krasnoshtanov V.K. Age-related structural features of liver and thyroid gland of laboratory rats. Vestnik KazNMU [Bulletin of KazNMU]. 2015; (3): 220-2. (in Russian).
Andreeva S.D. Cytokine status and destructive lesions of the liver in experimental acute pancreatitis. Ippologiya i veterinariya [Hippology and Veterinary]. 2020; (3): 69-73 (in Russian)
Conlon I., Raff M. Size control in animal development. Cell. 1999; 96 (2): 235-44. DOI: https://doi.org/10.1016/s0092-8674(00)80563-2 Sasaki K., Sonoda Y. Histometrical and three-dimensional analyses of liver hematopoiesis in the mouse embryo. Arch Histol Cytol. 2000; 63 (2): 137-46. DOI: https://doi.org/10.1679/aohc.63.137 Guo Y., Zhang X., Huang J., Zeng Y., Liu W., Geng C., et al. Relationships between hematopoiesis and hepatogenesis in the midtrimester fetal liver characterized by dynamic transcriptomic and proteomic profiles. PLoS One. 2009; 4 (10): e7641. DOI: https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0007641
Babaeva A.G. Regeneration: facts and perspectives. Moscow: RAMS Publishing House, 2009: 336 p. ISBN 978-5-7901-0085-7. (in Russian)
Timchenko N.A. Aging and liver regeneration. Trends Endo-crinol Metab. 2009; 20 (4): 171-6. DOI: https://doi.org/10.1016/j. tem.2009.01.005
Baygil'din S.S., Karimov D.O., Khusnutdinova N.Yu., Smolyan-kin D.A., Repina E.F. Rat liver morphology after 72 hours of exposure to carbon. Meditsina truda i promyshlennaya ekologiya [Occupational Medicine and Industrial Ecology]. 2018; (4); 143-9. (in Russian) Rui L. Energy metabolism in the liver. Comp Physiol. 2014; 4 (1): 177-97. DOI: https://doi.org/10.1002/cphy.c130024
