CC BY
12
ss2
Bulletin of Medical Internet Conferences (ISSN 2224-6150)
2015. Volume 5. Issue 6
ID: 2015-06-1276-A-5291 Оригинальная статья
Бучарская А.Б., Дихт Н.И., Афанасьева Г.А., Терентюк Г.С., Маслякова Г.Н., Наволокин Н.А., Пахомий С.С., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г.*
Морфологические изменения в почках и показатели перекисного окисления липидов сыворотки крови у лабораторных животных с аллоксановым диабетом при внутривенном введении золотых наночастиц
ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России *Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН
Bucharskaya A.B., Dikht N.I., Afanasyeva G.A., Terentyuk G.S., Maslyakova G.N., Navolokin N.A., Pakhomy S.S. Khlebtsov B.N.,
Khlebtsov N.G.*
Morphological changes in the kidney and lipid peroxidation of blood serum in laboratory animals with alloxan
diabetes at intravenous administration of gold nanorods
Saratov State Medical University n.a.V.I.Razumovsky *Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms RAS
Резюме
В эксперименте изучали воздействие золотых наностержней на почки у животных с моделированным аллоксановым диабетом при однократном внутривенном введении. Проводилась оценка активности перекисного окисления липидов и интегративного показателя аутоинтоксикации в сыворотке крови у здоровых животных и животных с моделированным аллоксановым диабетом. Было обнаружено, что однократное внутривенное введение золотых наностержней не вызывает значительных морфологических изменений в почках у крыс с аллоксановым диабетом. Внутривенное введение золотых наностержней у животных с аллоксановым диабетом не сопровождалось изменением уровня продуктов свободнорадикального окисления липидов и интегративного показателя аутоинтоксикации в сыворотке крови, что свидетельствует об отсутствии их токсического эффекта.
Ключевые слова: золотые наночастицы, почки
Введение
Одной из серьезных проблем современного общества является стремительный рост заболеваемости сахарным диабетом. Международная федерация диабета недавно опубликовала обновленные данные, показавшие, что в мире диабетом больны уже 366 миллионов человек, причем около 50 % всех больных диабетом приходится на наиболее активный трудоспособный возраст -40-59 лет. Прогнозы экспертов Международной диабетической федерации показывают, что к 2030 году их количество может достигнуть 552 миллиона человек, то есть 9,9% населения планеты [1].
В момент постановки диагноза сахарного диабета 2-го типа около половины больных имеют поздние осложнения. Имеющиеся на сегодняшний день методы лечения сахарного диабета зачастую оказываются малоэффективными, в связи с этим поиск новых терапевтических средств по предотвращению развития и прогрессирования осложнений диабета продолжает оставаться наиболее актуальной проблемой в диабетологии.
Одним из таких направлений научного поиска является применение нанотехнологий в терапии сахарного диабета. Для биомедицинского применения одними из наиболее перспективных считаются золотые наночастицы. В значительной мере это обусловлено их уникальными свойствами - биосовместимостью, высокой реактивностью поверхности, устойчивостью к окислению и способностью к плазменному резонансу [2].
В настоящее время имеются данные о воздействии золотых наночастиц in vitro и in vivo [3-6], которые могут быть использованы в терапии осложнений сахарного диабета. Установлено, что вследствие гипергликемии и эндогенной интоксикации при данном заболевании наблюдается значительное повышение уровня свободных радикалов, концентрация которых может быть снижена при использовании золотых наночастиц [7]. Следовательно, золотые наночастицы могут стать эффективными терапевтическими агентами в регулировании и контролировании процессов окислительного стресса, что в дальнейшем окажет положительный эффект на качество жизни пациентов с сахарным диабетом. Однако одним из условий применения новых материалов в лечебных целях, в том числе и золотых наностержней, является всестороннее изучение их влияния на организм, в том числе на фоне развивающегося патологического процесса.
Цель исследования - изучить морфологические изменения в почках лабораторных животных с моделированным аллоксановым диабетом при внутривенном введении золотых наностержней.
Материалы и методы
Экспериментальное исследование было выполнено на 48 белых беспородных половозрелых крысах-самцах массой тела 180260г. Эксперименты на животных выполняли в соответствии с международными этическими нормами, отраженными в законе о благополучии животных Конвенции Европейского союза и Европейской конвенции защиты позвоночных животных для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 1986). Животные всех экспериментальных групп находились в одинаковых условиях, получали стандартный рацион питания один раз в день, при свободном доступе к воде. В параллельно исследуемых группах животные имели примерно одинаковый возраст и массу тела.
В экспериментах использовали пегилированные золотые наностержни со средними размерами длины и диаметра стержней равными L=41±8 нм и d=10,2±2 нм соответственно, синтезированные в лаборатории нанобиотехнологии ИБФРМ РАН (г.Саратов). Геометрические параметры наностержней определяли по трансмиссионным электронно-микроскопическим (ТЭМ) изображениям, полученным на электронном микроскопе Libra-120 (CarlZeiss, Germany).
Бюллетень медицинских Интернет-конференций (ISSN 2224-6150) 2015. Том 5. № 6
Лабораторные животные были разделены на 4 экспериментальные группы, в каждой группе по 12 животных. Первая группа -контрольная, интактные животные. Животным второй группы вводили однократно внутривенно раствор золотых наностержней в количестве 2 мл с концентрацией золота 400 мкг/мл. Животным третьей и четвертой групп для моделирования аллоксанового диабета внутрибрюшинно вводили аллоксан моногидрат («Sigma», США) в дозе 100 мг/кг. Принимая во внимании фазную динамику гликемии у лабораторных грызунов после введения аллоксана, выраженность проявления экспериментального сахарного диабета оценивали не ранее чем через 72 ч с момента моделирования этого состояния (10). Для определения уровня глюкозы в крови использовали глюкометр Accu-Chek Performa Roche (Швейцария), тест проводили на 5, 10, 15-е сутки после введения аллоксана. Животным четвертой опытной группы через 15 дней после введения аллоксана вводили однократно внутривенно 2 мл раствора золотых наностержней. Животные выводились из эксперимента путем декапитации через сутки после внутривенного введения золотых наностержней.
При выведении из эксперимента у животных проводили забор крови для исследования в сыворотки активности процессов перекисного окисления липидов по содержанию промежуточных продуктов липопероксидации - МДА и ГПЛ и маркера аутоинтоксикации - МСМ с использованием общепринятых спектрофотометрических методов на спектрофлуориметре RF-5301 PC (Shimadzu Corporation, Япония).
Для морфологического исследования почки фиксировали в 10%-ном растворе формалина, подвергали стандартной спиртовой и ацетоновой проводке, заливали в парафин. После депарафинизации срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином для обзорного гистологического изучения. Для выявления углеводов в ткани использовали реактив Шиффа (ШИК-реакция).
При морфологическом исследовании с использованием полуколичественных показателей, применяли следующие критерии выраженности признака:«-» - признак отсутствует (0%); «+» - слабо выраженный признак (>30%); «++» - умеренно выраженный признак (30%-60%); «+++» - сильно выраженный признак (<60%). Морфометрический анализ гистологических препаратов проводили с использованием системы анализа цифровых изображений Микровизора медицинского |Vizo-101 ЛОМО. Применяли также стандартный метод подсчета клеточных элементов при увеличении 200, 400 с использованием специализированной морфометрической сетки Автандилова.
Для обработки полученных в ходе исследований данных был использован пакет прикладных статистических программ SSPS 13.0. Проверку нормальности распределения значений в выборке проводили с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Рассчитывали среднее арифметическое (М); среднюю ошибку среднего арифметического (m); стандартную ошибку среднего (m). Показатель достоверности различий (Р) определяли с использованием критериев Стьюдента (t).
Результаты
При морфологическом исследовании почек животных при однократном внутривенном введении золотых наностержней значительных морфологических изменений не обнаружено.
В мозговом слое клубочки были обычного размера 0,0063±0,0004 мм2 (при контрольных значениях -0,0067±0,0003 мм2).Канальцы имели округлую форму, просвет был свободный (незначительно сужен за счет увеличения размеров эпителиальных клеток). Эпителиальные клетки канальцев были несколько увеличены, цитоплазма - в состоянии зернистой дистрофии (рис. 1а). По данным морфометрического исследования высота эпителия извитых канальцев составила 0,014±0,0005 мм (при контроле - 0,017±0,001 мм). Базальные мембраны канальцев не изменены. Строма коркового слоя была представлена рыхлой волокнистой соединительной тканью; отмечалось умеренное полнокровие коркового слоя.
При гистологическом исследовании почек лабораторных животных с моделированным аллоксановым диабетом на 15-е сутки после введения аллоксана отмечались различной степени выраженности морфологические изменения, характерные для диабета.
В крови животных третьей и четвертой групп при введении аллоксана наблюдалось достоверное повышение уровня глюкозы в сыворотки крови. На 15-й день отмечались повышение уровня глюкозы крови до 18,39±3,49 ммоль/л (p<0,05), что значительно превышало значения данного показателя в контрольной группе животных. У данных животных выявляли клинические признаки сахарного диабета - полидипсия, полиурия, на 5-е сутки шерсть животных стала влажной с грязно-коричневым оттенком. Летальность на 5-е сутки составила 8,3%.
В почках морфологические изменения были представлены преимущественно умеренным полнокровием сосудов коры, дистрофическими изменениями эпителия извитых канальцев от незначительной до умеренной степени выраженности. В клубочковом аппарате почек отмечалось неравномерно выраженное полнокровие, в некоторых случаях - утолщение капсулы Шумлянского-Боумена, в мелких артериолах - плазматическое пропитывание. Уротелий чашечно-лоханочной системы находился в состоянии атрофии. При окрашивании с помощью реактива Шиффа в эпителии извитых канальцев и в просвете канальцев были обнаружены ШИК-положительные включения. Результаты морфометрического исследования показали, что высота эпителиоцитов и площадь клубочков составила 0,014 мм и 0,0066 мм2 соответственно, что статистически не отличалось от показателей в контрольной группе.
При исследовании почек лабораторных животных четвертой группы были обнаружены изменения, характерные для аллоксанового диабета (рис. 1). Следует отметить, что у животных данной группы отмечались увеличение клубочков и расширение капсулы Шумлянского-Боумена за счет отека, что подтверждается результатами морфометрического исследования - площадь клубочка увеличилась на 25% и составила 0,0093±0,0004 мм2 (при контрольных значениях - 0,0067±0,0003 мм2).
При однократном внутривенном введении золотых наностержней животным контрольной группы в сыворотке их крови уровни продуктов липопероксидации - МДА, ГПЛ, а также интегративного показателя аутоинтоксикации - МСМ - не изменялись по сравнению с контролем (табл. 1).
При введении аллоксана у крыс наблюдали достоверное повышение уровня глюкозы в сыворотке крови - до 18,39±3,49 ммоль/л на 15-й день после введения (p<0,05), что значительно превышало значения данного показателя в контрольной группе животных (3,78±0,34 ммоль/л). У крыс после введения аллоксана отмечались клинические признаки сахарного диабета -полидипсия, полиурия, на 5-е сутки шерсть животных становилась влажной с грязно-коричневым оттенком. Летальность на 5-е сутки составила 8,3%.
ss4
Bulletin of Medical Internet Conferences (ISSN 2224-6150)
2015. Volume 5. Issue 6
Рис. 1. Ткань почки крысы; а) контрольной группы после введения золотых наночастиц; б) с моделированным диабетом на 15-й день после введения аллоксана. Окр. гематоксилин-эозином. Ув. 246; в) ШИК-положительное содержимое в просвете канальца в почке у крысы с диабетом. Окр. ШИК-реакция. Ув. 246.
Таблица 1. Содержание МДА, ГПЛ и МСМ в сыворотке крови лабораторных животных
Показатели Малоновый диальдегид (pmol / mL) Гидроперекиси липидов (U/ml) Молекулы средней массы (МСМ), (U / ml)
Группы животных М±а Р М±а Р М±а Р
Контрольная 0,506±0,04 - 0,924 ±0,099 - 0,159±0,036 -
Контроль с внутривенным введением золотых наночастиц 0,533±0,03 >0,2 1,296 ±0,151 >0,5 0,278±0,057 >0,2
Аллоксановый диабет 0,844 ±0,19 <0,05 3,870±0,834 <0,01 0,321±0,129 >0,2
Аллоксановый диабет с внутривенным введением золотых наночастиц 0,778±0,07 <0,05 3,503±0,4 <0,05 0,338±0,038 >0,2
Примечание: р - по сравнению с показателями контрольной группы животных.
Результаты, полученные в экспериментах с моделированием аллоксанового сахарного диабета у лабораторных животных, свидетельствовали о значительных системных метаболических сдвигах и накоплении МДА (р<0,05), ГПЛ (р<0,01) в сыворотке крови животных по сравнению с контрольной группой. В сыворотке крови животных с моделированным диабетом отмечали значительное увеличение количества МДА - на 67% (р<0,05) и ГПЛ - более чем в 4 раза (р<0,01) по сравнению с соответствующими показателями контрольной группы (табл. 1).
При введении золотых наностержней животным с моделированным диабетом достоверных изменений уровней МДА, ГЛП и МСМ не было обнаружено по сравнению с соответствующими показателями без введения наностержней.
Выводы
При развитии диабета на фоне введения аллоксана в почках наблюдали полнокровие клубочков, плазматическое пропитывание стенок мелких артериол и углеводную дистрофию эпителия канальцев, связанных с гипергликемией. Одновременно отмечена значительная активация процессов липопероксидации, сопровождающаяся накоплением избытка промежуточных продуктов перекисного окисления липидов.
Введение золотых наностержней не вызывало значительных морфологических и метаболических изменений у крыс с моделированным диабетом; отмечали только увеличение площади клубочков в почках. Отсутствие значительных морфологических изменений в почках в группах с введением золотых наностержней, вероятно, связано с небольшим периодом наблюдения.
Использование золотых наночастиц у животных с аллоксановым диабетом не сопровождалось изменением уровня продуктов свободнорадикального окисления липидов и интегративного показателя аутоинтоксикации, что свидетельствует об отсутствии их токсического эффекта.
Литература
1. International Diabetes Federation. Diabetes Atlas. 5th ed. Brussels, Belgium, International Diabetes Federation, 2011.
2. Glomm W.R. Functionalized gold nanoparticles for application in biotechnology. J Dispers Sci Technol 2005; 26: 389-414.
3. Khlebtsov N.G., Dykman L.A. Biodistribution and toxicity of engineered gold nanoparticles: A review of in vitro and in vivo studies. Chem Soc Rev 2011; 40: 1647-1671.
4. Khlebtsov N., Bogatyrev V., Dykman L., et al. Analytical and theranostic applications of gold nanoparticles and multifunctional nanocomposites. Theranostics 2013; 3: 167-180.
5. Terentyuk G.S., Akchurin G.G., Shantrocha A.V., et al. Circulation and distribution of gold nanoparticles and induced alterations of tissue morphology at intravenous particle delivery. Journal of Biophotonics 2009; 2(5): 292-302.
Бюллетень медицинских Интернет-конференций (ISSN 2224-6150)
2015. Том 5. № 6_885
6. Алипов В.В., Лебедев М.С., Чепелевич Н.В., Алипов Н.В. Особенности парентерального накопления золотых наночастиц и их влияние на некоторые показатели гомеостаза в эксперименте. Бюллетень медицинских интернет-конференций 2011; 1(2): 54-56.
7. Kanth B.M.S., Kalishwaralal K., Sriram M., Ram Kumar Pandian S. Antioxidant effect of gold nanoparticles restrains hyperglycemic conditions in diabetic mice. J Nanobiotechnology 2010; 8: 16.
