CC BY
58
УДК 616.72-018.3-001.3:611.018.5.013.8
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ХРЯЩЕ КОЛЕННОГО СУСТАВА ПОД ВЛИЯНИЕМ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ФРАКЦИИ КОРДОВОЙ КРОВИ ПОСЛЕ МЕХАНИЧЕСКОЙ ТРАВМЫ
Исследовали влияние ФКК на особенности морфологического состояния регенирирующего хряща и окружающей ткани на стадиях образования грануляционной ткани и на стадии формирования полноценной клеточной единицы хрящевой ткани - хондроцита. В работе установлено, что у животных, получавших ФКК, по сравнению с контрольной группой, отмечалось существенное ускорение репаративных процессов на 14 сутки после операции и формирование в зоне дефекта суставного хряща хондроидной ткани и волокнистого хряща через 28 суток после моделирования механической травмы. Также инъекции ФКК способствуют восстановлению конгруэнтности хрящевой ткани к 28 суткам, однако, полного восстановления архитектоники хряща не наблюдалось даже к этому сроку наблюдения.
Ключевые слова: механическая травма, низкомолекулярная фракция кордовой крови, хондроцит, остеогенез.
Исследование выполнено в соответствии с планом ИПКиК НАН Украини в отделе биохимии холодовой адаптации по теме №21 «Использование низких температур для выделения биологически активных компонентов (меньше 5 кДа) из кордовой крови животных с целью получения ранозаживляющих препаратов. №ДР 0105U003917».
Ранее нами был выявлен по данным биохимических, рентгенологических и функциональных исследований положительный эффект внутримышечного введения низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови коров (ФКК) как на течение репаративных процессов в суставном хряще, так и на общее состояние организма после механической травмы хряща [2, 4]. Известно, что успешная регенерация хряща после механической травмы зависит не только от накопления необходимых для регенерации биохимических компонентов в хряще, но и от того, способствуют ли эти компоненты образованию нормальной структуры хряща [5, 6]. Вместе с тем, остается неясным, способна ли ФКК не только нормализовать обмен важнейших макромолекул в хряще, но и восстановить его архитектонику.
Целью работы было выяснение влияния ФКК на особенности морфологического состояния регенирирующего хряща и окружающей ткани на стадиях образования грануляционной ткани и на стадии формирования хондроцитов.
Материал и методы исследования. Выделение фракции с компонентами молекулярной массы до 5 кДа из кордовой крови крупного рогатого скота осуществлялось по методу [1]. Исследование выполнено на 28 крысах-самцах линии Vistar массой 290-310 грамм. Контрольными сроками эксперимента были приняты 14-е и 28-е сутки с момента моделирования механического повреждения хряща коленного сустава. Животные были разбиты на 2 группы при численном количестве животных в каждой группе, равном 7: 1) группа животных, не получавших лечения (контроль); 2) группа экспериментальных животных, которым в течение всего срока исследования вводили ФКК в дозе 1,17 мг на 100 грамм веса тела (опыт). Моделирование механического повреждения хряща осуществлялось по методу [2].
Для гистологического исследования выделяли фрагменты бедренной кости с зоной повреждения и фиксировали в растворе 10% нейтрального формалина, проводили декальцинацию в растворе 4% азотной кислоты при температуре 18-22°С, обезвоживали в спиртах возрастающей крепости (50°, 70° спирты и дважды в 96°) и в спирте с эфиром (1:1), заключали в целлоидин. Гистологические срезы изготавливали на санном микротоме Reichert и окрашивали гематоксилином и эозином и по Ван Гизон [7]. Гистологический анализ проводили с помощью светового микроскопа Primo Star (Carl Zeiss) c использованием для фотографирования цифровой фотокамеры Canon Power Short A610 и компьютерной программы AxioVision. Все манипуляции с животными выполнялись согласно
принципам Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 1985).
Результаты исследования и их обсуждение. Морфологическое исследование костно-хрящевых дефектов показало, что через 14 суток после нанесения травматического повреждения у животных обеих групп при макроскопическом исследовании определялась зона дефекта в виде небольшого округлого углубления. При гистологическом анализе четко определялся дефект, проникающий через суставное покрытие в субхондральную кость, однако не задевающий эпифизарного хряща. Ткани регенерата располагались на уровне дефекта субхондральной кости, оставляя область повреждения хряща незаполненной, и были представлены молодой костной, зрелой грануляционной и соединительной тканями.
При изучении морфологической картины изменения дефекта материнской кости следует отметить, что костные трабекулы, прилежащие к зоне дефекта, также характеризовались деструктивными изменениями - отмечалось неравномерное окрашивание матрикса, микротрещины, участки без остеоцитов, выражены базофильные цементные линии. Следует отметить, что в большей части дефектов у животных опытной группы обнаруживалась активная перестройка материнской кости на границе с зоной повреждения. Поверхность такой кости была неровной за счет расположенных в резорбционных лакунах функционально активных остеокластов с 6-12 ядрами и развитой вакуолизированной цитоплазмой, что свидетельствует о резорбции поврежденной кости (рис.1). При анализе уровня заполнения костной тканью дефекта материнской кости следует отметить, что на 14 сутки у животных опытной группы наблюдался активный остеогенез: по периметру дефекта со стороны материнской кости отмечалось формирование грубоволокнистой костной ткани, представленной сетью молодых костных трабекул. Они характеризовались высокой плотностью крупных остеоцитов, содержащих крупные, равномерно окрашенные базофильные ядра (рис.2). По наружной поверхности большинства из трабекул располагались в виде «частокола» остеобласты, содержащие крупные, эксцентрично расположенные, ядра и обильную базофильную цитоплазму, что свидетельствует о функциональной активности клеток, направленной на биосинтез компонентов матрикса. В межтрабекулярных пространствах располагалась ретикуло-фиброзная ткань и участки формирующегося красного костного мозга.
У животных контрольной группы костная ткань, прилежащая к зоне дефекта оставалась инертной, что в дальнейшем может привести к нарушению формирования плотного контакта «материнская кость - регенерат». У животных контрольной группы, в отличие от опытной, ширина слоя новообразованной кости была незначительной. Молодые костные трабекулы располагались одиночно, вдоль материнской кости, что свидетельствует о замедленном течении репаративного остеогенеза по сравнению с опытной группой.
Анализируя морфологическую картину изменения дефекта в самой хрящевой ткани, следует отметить, что формирование хрящевой ткани в области дна дефекта у животных контрольной группы было более медленным по сравнению с животными опытной группы. Следует отметить, что в центральных отделах дефектов хрящевой ткани животных опытной группы располагалась грануляционная ткань разной степени зрелости. Плотность клеток в ней была высокой, коллагеновые волокна располагались хаотично, отмечались капилляры разного калибра, сосудистые полости, в просветах которых находились эритроциты. Местами в грануляционной ткани обнаруживались костные фрагменты в стадии реорганизации, о чем свидетельствуют прикрепленные к их поверхности функционально активные остеокласты (рис.3). На поверхности дефекта хряща, граничащей с суставной полостью, отмечалось формирование плотной соединительной ткани. В ней, среди мощных пучков коллагеновых волокон располагались веретеновидные фибробласты с плотными ядрами. Их длинная ось была ориентирована вдоль суставной поверхности (рис. 4). В суставном хряще вблизи зоны повреждения у животных обеих групп обнаруживались деструктивные изменения, связанные с истончением суставного покрытия, формированием участков без клеток, наличием клеток-теней. Базофильная линия характеризовалась неравномерностью и прерывистостью на участках. Репаративная реакция хряща проявлялась появлением вблизи участков без клеток изогенных групп клеток с увеличенным количеством хондроцитов (4-6) (рис. 5). Поверхность суставного хряща на расстоянии от дефекта была ровной, сохранялась зональная структура и толщина хряща. Через 28 суток после операции у животных опытной группы часть дефекта, расположенная в суставном хряще, была заполнена
хондроидом и волокнистым хрящом, которые плотно соединялись с краями прилежащего суставного хряща (рис 6).
Рис. 1. Деструктивные изменения костной и хрящевой тканей, прилежащих к дефекту. Активная перестройка кости при участаи остеокластов (Ос). 14 сут. после операции. Опыт. Г.-е.
Рис.2. Молодые костные трабекулы с высокой плотность остеобластов по поверхности. 14 сут. после операции. Г.-э.
Рис.3. Костные фрагменты в стадии реорганизации в толще Рис.4. Плотная соединительная ткань на поверхности дефекта, грануляционной ткани. 14 сут. после операции. Опыт. Г.-э. обращенной в полость сустава. 14 сут. Контроль. Г.-э.
Рис.5. Суставной хрящ вблизи дефекта. Территории без клеток Рис. 6. Регенерат в зоне костно-хрящевого дефекта. 28 суток.
Опыт. Г.-э.
Изогенные грутьИ^утпосп^пераци^Опыт
іртКА'Н?** ДОЯВ
-»/ Л • і' А;і' %•
Г.-э.
I
А-
хтші
Рис. 7. Разрастание хрящевой ткани. Неравномерная Рис. 8. Вытянутые клетки на поверхности регенерата, плотность клеток. 28 суток. Опыт. Г.-э. округлые - в глубоких слоях. 28 суток. Опыт. Г.-э.
Рис. 9. Регенерат в зоне костно-хрящевого дефекта представлен костной и соединительной тканями. Деструктивные изменения в окружающих дефект кости и хряще. 28 суток. Контроль. Г.-э.
Толщина сформированной хрящевой ткани варьировала у разных животных, при этом во всех случаях поверхность регенерата была равномерной, и сохранялась конгруэнтность суставных поверхностей (рис.6, 7). Плотность клеток в сформированном хряще была неравномерной. Его наружный слой формировали клетки, имеющие продолговатую форму и располагающиеся длинной осью вдоль суставной поверхности. В более глубоких слоях новообразованного хряща обнаруживались округлые клетки хрящевого фенотипа с крупными базофильными ядрами, отмечалась тенденция к формированию изогенных групп клеток, что особенно четко прослеживалось в случаях обильного хрящевого регенерата (рис. 7,8). Однако, зонального строения, характерного для суставного хряща в регенерате не установлено. Дефект в области субхондральной кости опытных животных был заполнен костной тканью пластинчатой структуры. В межтрабекулярных пространствах располагался красный костный мозг. Вблизи зоны дефекта в суставном хряще определялись явления деструкции (рис. 6). На расстоянии от зоны дефекта сохранялась цитоархитектоника суставного хряща. Можно предположить, что формирование хондроцитов в зоне дефекта может быть связано с дополнительным воздействием на пораженную область, опосредованно через кровеносную систему, а впоследствии через синовиальную оболочку и «материнскую кость», стимулирующего регенерацию биологически активного компонента, в данном случае ФКК. В то же время у животных контрольной группы морфологическая картина строения регенерата существенно отличается. Формирование костного регенерата, на поверхности которого располагался слой соединительной ткани неоднородной структуры с неравномерной плотностью клеток (рис. 9), что приводит, в отличие от опытной группы, к «проседанию» области регенерата, в которой формировалась хрящевая ткань.
Поверхность регенерата была неравномерной, а конгруэнтность суставных поверхностей нарушена. Регенерат плотно контактировал с прилежащей костью и хрящом, иногда покрывая последний снаружи. Очаги деструкции распространялись на окружающий дефект суставной хрящ и субхондральную кость. Даже на расстоянии от дефекта отмечалось истончение хрящевого покрытия, узурирование его поверхности, появление очагов без клеток. Следует отметить, что визуально площадь новообразованной ткани в области регенерате на все сроки наблюдения в контрольной группе была значительно меньше, чем в опытной группе. В то же время, неполная регенерация ткани приводила к нарушению структурно -функциональных соотношений в поврежденном сегменте. Это проявлялось тем, что структурные изменения хрящевой ткани начинались с деструкции хондроцитов поверхностной и промежуточной зон. Также визуально наблюдалось разрушение матрикса, которое сопровождалось утратой гликозаминогликанов. Суставная поверхность при этом была в значительной мере повреждена и на некоторых участках была видна оголенная «материнская кость» с тяжами неструктурированной вновь образованной соединительной ткани.
Проведенное морфологическое исследование выявило однонаправленность процесса в обеих экспериментальных группах животных. Процесс регенерации начинался в области дефекта субхондральной кости, приводя к формированию костной и хондроидной тканей и волокнистого хряща в разных соотношениях. У животных, получавших ФКК, по сравнению с контрольной группой, отмечалось ускорение репаративного остеогенеза на 14 сутки после операции и формирование в зоне дефекта суставного хряща хондроидной ткани и волокнистого хряща через
28 суток после моделирования механической травмы. При этом сформированный регенерат плотно контактировал с окружающим его хрящом, чего не отмечалось в контроле. Следует отметить, что инъекции ФКК способствуют восстановлению конгруэнтности хрящевой ткани к 28 суткам, однако, полного восстановления архитектоники хряща не наблюдалось даже к этому сроку наблюдения. Важную роль в этих процессах, по-видимому, играют изменения в окружении хряща, в частности - остеогенной ткани. Очевидно, что на поверхности регенерата, обращенной в полость сустава образовывалась соединительная ткань, механические свойства которой не отвечают требованиям функционирования коленного сустава. Полного восстановления суставной поверхности с образованием гиалинового хряща (т.е. полной регенерации) не наблюдалось.
Перспективы дальнейших исследований в данном направлении. Полученные в данной работе результаты открывают дальнейшие перспективы исследования биологической активности ФКК относительно репаративных процессов на поздних сроках регенерации (через 2, 3 и 6 месяцев). Также важным является проведение биохимического анализа регенерирующей после повреждения хрящевой ткани после курса инъекций ФКК. Перспективным является поиск новых моделей патологии тканей и органов для изучения биологической активности ФКК относительно их регенерации.
1. Гулевский О.К. Властивості і перспективи викорастання кордової крові в клінічній практиці / О.К. Гулевский, В.І. Г рищенко, Н.М. Моісєєва // Укр. жур. гематології та трансфузіології. - 2005. - №4. - С. 5-14.
2. Пат. 42133 Україна, МПК G 09 В 23/00. Спосіб моделювання механічного міжвиросткового дефекту суглобного хряща / Гулевський О.К., Іванов Г.В., Іванов Є.Г.; заявник ї власник патенту Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. - № u 2009 00367; заявл. 19. 01. 2009; опубл. 25. 06. 2009, Бюл. №12.
3. Иванов Е.Г. Репаративная регенерация хрящевой ткани после криовоздействия сочетанного с механической травмой под влиянием низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови / Е.Г. Иванов, Гулевский А.К. // Тезисы докладов конференции молодых ученых ["Холод в биологии и медицине"]. - Харьков, 2009. - C. 22.
4. Иванов Е.Г. Стимуляция метаболизма в хрящевой ткани мосле механической травмы под влиянием низкомолекулярной фракции (до 5 кДа) кордовой крови / Е.Г. Иванов, А.К. Гулевский // Тезисы докладов ежегодной конференции молодых ученых ["Актуальні проблеми біохімії та біотехнології"]. - Київ, 2009. - C. 15.
5. Павлова В.Н. Хрящ / Павлова В.Н., Копьева Т.Н., Слуцкий Л.И., Павлов Г.Г. — М.: Медицина, 1988. - 320 с.
6. Слуцкий Л.И. Биохимия нормальной и патологически измененной соединительной ткани. - Л.: Медицина, 1969. - 376с.
7. Саркисов Д.С., Микроскопическая техника / Саркисов Д.С., Перова Ю.Л. - М.: Медицина, 1996. - 542с.
МОРФОЛОГІЧНІ ЗМІНИ В ХРЯЩІ КОЛІННОГО СУГЛОБА ПІД ВПЛИВОМ НИЗЬКОМОЛЕКУЛЯРНОЇ ФРАКЦІЇ КОРДОВОЇ КРОВІ ПІСЛЯ МЕХАНІЧНОЇ ТРАВМИ Гулевський О.К., Іванов Е.Г.
Досліджували вплив ФКК на особливості морфологічного стану регенеруючого хряща та навколишньої тканини на стадіях утворення грануляційної тканини та на стадії формування повноцінної клітинної одиниці хрящової тканини -хондроцита. У роботі встановлено, що у тварин, що одержували ФКК, у порівнянні з контрольною групою, відзначалося істотне прискорення репаративных процесів на 14 добу після операції й формування в зоні дефекту суглобного хряща хондроїдної тканини й волокнистого хряща на 28 добу після моделювання механічної травми. Також ін'єкції ФКК сприяють відновленню конгру-ентності хрящової тканини на 28 доби, однак, повного відновлення архітектоніки хряща не спостерігалося навіть на цей термін дослідження.
Ключові слова: механічна травма, низькомолекулярна фракція кордової крові, остеогенез.
MORPHOLOGICAL CHANGES IN KNEE JOINT’S CARTILAGE UNDER THE INFLUENCE OF LOW-MOLECULAR FRACTION OF CORD BLOOD AFTER THE MECHANICAL TRAUMA Gulevskij A.K., Ivanov Ye.G.
Investigated influence FCB on features of morphological condition of the regenerating of cartilage and a surrounding tissue at stages of formation granulation tissue and at a stage of formation of high-grade cellular unit cartilage tissue - chondrocyte . In work it is established, that at the animals receiving FCB, in comparison with control group, essential acceleration reparative processes for 14 day after operation and formation in a zone’s defect of an articulate cartilage of chondroid tissue and a fibrous cartilage in 28 day after modelling a mechanical trauma was marked. Also injections FCB promote restoration congruence cartilage to a tissue by 28 day, however, full restoration architectonics a cartilage was not observed even to this term of supervision.
Key words: a mechanical trauma, low-molecular fraction of cord blood, osteogenesis.
