CC BY
22
Экспериментальные и клинические исследования
Морфологическиеизменениясетчатки при воздействии
лазерным излучениемпороговых интенсивностей с длиной волны 450 нм и их коррекция синтетическимдипептидом
Аникина Е.ЮПотаповА.В.1, ВаракутаЕ.Ю.\ Бухтияров И.В.2,
Кисляков Ю.Ю.2, Прокофьев.А.Б.2, КаменковаЕ.А2, Логвинов С.В.1
Morphological changes of a retinaof an eye at influenceby laser radiation of threshold intensitywith wavelenght450nm and theircorrection by synthetic dipeptid
Anikina Ye.Yu,PotapovA. V., VarakutaYe.Yu,BukhtiyarovL V., KislyakovYu.Yu,ProkofyevA.B, Kamenkova Ye.A, LogvinovS.V.
1 Сибирскийгосударственныймедицинскийуниверситет,г. Томск
2 Государатвенны1йнаучноисследовательскийиспыт1ательны1йинститутМиниатератваобороны1РФ, г. Москва
© Аникина Е.Ю., ПотаповАВ., Варакута Е.Ю. и др.
Изучены изменения сетчатой оболочки глаза при воздействиилазерным излучением пороговыхинтенсивностей и возможности их коррекции синтетическимдипептидом. Экспериментпровсдился на 23 кроликах Полученный материал исследовалсяс помошьюмето-дик световой и электронной микроскопии. При лазерном воздействии отмечалось повреждение всех слоев сетчатки. На фоне применения препарата наблюдалось снижение повреждающего влияния, что свидетельствует о наличии у дипептида ретинопротекторных свойств.
Ключевые слова: лазер, сетчатка, синтетическийдипептид.
The analysis of alterations retina of during exposure of threshold l aser i ntensity and opportunities to correct it by synthethic dipeptid. The material and method: 23 rabbits were i nclu ded i n the experiment. Recived matherial was i nvestigated with help of l ight and electron microscopy. All l ayers of retina were damaged during laser exposure. The usage of synthethic dipeptide reduced laser damage. Synthethic dipeptid have ret-inoprotection abilities.
Keywords: laser, retina, synthetic dipeptid.
Введение
В последние годы возрастает интерес к проблемам изменения сетчатки глаза при воздействии лазерным излучением. Лазерная терапия является сегодня одним из ведущих методовлечениядиабетической макулопатии [2, з], ме-ланом хориоидеи [4], ретинопатии недоношенных, диабетического макулярного отека, тромбоза ретинальных вен сетчатки, центральной хориоретинальной дистрофии и других заболеваний. При использовании высокоинтенсивного излучения соседние с коагулированными участками отделы сетчатки подвергаются повреждающему воздействию, что может стать причиной нарушения зрительной функции [ 6, 14,
УДК617.735091.8:615.849.19].001.6
15]. Многие исследователи проявляютинтерес к низкоинтенсивной лазерной терапии как к альтернативному, немедикаментозному, высокоэффективному, безболезненному и удобномудля пациента методу лечебного воздействия [12]. Данный вид излучения применяется при таких патологиях, как прогрессирующая близорукость, врожденная катаракта, центральная хориоретинопатия [8, 9, 13]. Вместе с тем при лечении сложно избежать побочныхэффектов, что связано с трудностями подбора подпороговыхинтенсивностей с учетом индивидуальныхособенностей [1 ].
При коррекции изменений, вызванных лазерным воздействием, назначаются препараты, из группы пептидныхбио-регуляторов, Синтетический дипептид АВ-7 является анало-
АникинаЕ.Ю,Потапов А.В,ВаракутаЕ.Ю.и др.
гом ретиналамина и относится к новому классу пептидных биорегуляторов— синтетическихпептидов (цитогенов) . Они оказывают выраженное ретинопротекторное и ангиопротек торное влияние и используются как самостоятельно, так и в комплексе с другими лекарственными средствами при терапии повреждений сетчатой оболочки глаза [11]. Литературные данные свидетельствуюто том, что препарат обладает нейральной индукционной и пролиферативнойактивно стью, выраженными антиоксидантными свойствами, ан-гиопротекторным и выраженным протекторным действием в отношениисетчатки глаза [ю].
В связи с вышесказанным целью настоящего исследо вания стало изучение модифицирующего влияния данного препарата на морфологические изменения сетчатки глаза при воздействии лазерным излучением пороговой интенсивности в сине-зеленомдиапазонедлины волны,
Материал и методы
Экспериментпроводился на 23 половозрелыхкроликах-самцах породы шиншилла с массой тела 900—1 200 г. Жи-вотныхсодержали в стандартныхусловияхвивария при световом режиме 12 ч — день и 12 ч — ночь, с искусственным дневнымосвещениемсредней интенсивности (100 лк).
В первой серии экспериментов 9 животных подвергали воздействию лазерного излучения параметрического генератора света на область сетчатки длительностью 0,1 с, мощностью 0,21 Дж/см и длиной волны 450 нм, что соответ-ствуетголубой области видимогоспектра, Количествокоагупя-тов составило 5—6. Размер коагулята — 200—300 мкм. Критерием достаточности при подборе мощности и продолжительности воздействия стало появление ватообразных коагулятов i степени с нечеткими границами ,
Во второй серии экспериментов 9 кроликам в течение 7 с до облучения лазером и на протяжении всего эксперимента проводили пероральное введение синтетического дипептида АВ-7 в дозе 10 мг на 1 кг массы тела 1 раз в сутки, Суточная доза препарата на одно животнсесоставпялаприблизительно 100 мг. В дальнейшем животные данной серии подвергались лазерному воздействию с аналогичными предыдущей серии параметрами.
Взятие материала производили через 1 и 14 сут после облучения. Всех животных выводили из эксперимента посредством декапитации под эфирным наркозом. Контрольным материалом служили сетчатые оболочки 5 кроликов, которых содержали в идентичных с экспериментальными животными условиях вивария. Проводили исследования
Морфологические изменениясетчатки...
глазного дна животныхиз всех групп с помощьюфундус-ка-меры для определениястепени коагуляции.
Глазные яблоки после энуклеации фиксировали в жидкости Карнуа и заливали в парафин, Готовили отвесные срезы задней стенки глаза толщиной 5—7 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Для изучения ультраструктурных изменений сетчатки глаза заднююстенкуглаза фиксировали в 2,5%-м растворе глютаральдещда на кокадилатном буфере (pH = 7,4). Материал постфиксировали в 2%-м растворе четырехокиси осмия и заливали в эпон. На ультратоме lkb -4 готовили полутонкие и ультратонкие срезы. На полутонких срезах, окрашенных толуидиновым синим, производили подсчет нейросенсорных клеток с пикнозом ядра на 1 тыс. фоторецепторов с каждой сетчатки и определяли количество слоев в наружном ядерном слое. Устанавливали содержание пикноморфньхлиоцитов , нейронов ядерныхслоев и ганглио-нарныхнейроновна 200 клетокс каждойсетчатки в процентах.
Для оценки достоверности различий при сравнении средних величин использовали непараметрический критерий Манна—Уитни. Различия считались статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Через 1 сут после воздействия лазерным излучением в области коагулятов наблюдалась гипертрофия апикальных отростков пиггментоэпителиоцитов, В цитоплазме клеток визуализировалось незначительное количество фагосом. Отдельные клетки были гипертрофированы, На светоопти-ческом уровне в очаге субретинальное пространство содержало неравномерно утолщенные фрагментированные наружные сегменты нейросенсорных клеток. На ультрастру-турном уровне наблюдался разры в и лизис мембран наружных сегментов. Во внутренних сегментах наряду с реактивны ми установлены деструктивныепроцессы, выражавшиеся в появлении резко увеличенных в размерах митохондрий , которые были лишены крист и имели светлый электронно-прозрачный матрикс, а также снижением на расширенных цистернахэндоплазматической сети количества рибосом, В цитоплазме внутренних сегментов отмечено снижение количества полисом, Воздействиелазера вызывалоуменьшение числа рядов ядер нейросенсорных клеток до 2—3 по сравнению с контролем, составляющим 8—10 рядов, а также увеличение содержания пикнотичных ядер нейросенсорных клеток (рис. 1) до (2,92 ± 0,23)% при контрольном значении (0,41 ± 0,01)% р < 0,05). Междунейросенсорными клетками располагались гипертрофированные отростки радиальной глии.
Экспериментальные и клиническиеисследования
Рис. 1. Пикноз ядер нейросенсорных клеток через i сут после воздействия лазерным излучением. Полутонкий срез, окраска толуцци-новым синим. Ув. 900
Изменения внутреннего ядерного слоя носили очаговый характер. Расположение очагов соответствовало местам повреждений в наружном ядерном слое. Биполярные и ама-кринные нейроны i наиболее подверглись деструкции. Через i сут после воздействия отмечались изменения нейронов в виде отека перикарионов и вакуолизации цитоплазмы. На ультраструктурном уровне наблюдали набухание митохондрий и расширение цистерн эндоплазматической сети. Количество пикноморфных клеток составляло (4,47 ± 0,09)% (контроль (1,81 ± 0,06)%, р < 0,05). Изменения мультиполяр-ных нейронов ганглионарного слоя сетчатки после воздействия в области коагулятов характеризовались снижением и перераспределением хроматофильного вещества в перика-рионах нейроцитов . Об этом свидетельствовалоувеличение количества клеток с явлениями очагового и тотального хроматолиза. Через i сут после воздействия лазером количество пикноморфных ганглионарных нейронов увеличивалось в 1,8 раза по сравнению с контролем ((3,14 ± 0,11) %, р < 0,05). Количество нейронов с явлениями очагового хроматолиза составило (52,01 ± 2,93)% (контроль (16,32 ± 0,95)%, р < 0,05). Также наблюцалсxсьувеличение числа нейроцитов с явлениями тотального хроматолиза до (20,47 ± ± 0,83)% по сравнению с контролем ((8,21 ± 0,51)%,
р < 0,05).
При введении синтетического дипептида АВ- 7 в те же сроки наблкдшсьусиление гипертрофии пигментоэпителио цитов. Также отмечались изменения фтооэнсорного слоя в виде снижения плотности распределения наружныхсегментов нейросенсорных клеток. Встречались дискомплектация мембранных дисков и расширение межмембранных пространств в дистальных отделах некоторых наружных сегментов. Изменения вну-
тренних сегментов характеризовались набуханием митохондрий, просветлением их матрикса и незначительной деструкцией крист. Цистерны I эндоплазматической сети расширены , Увеличилось количество рядов ядер нейросенсорныхклеток до 3—5 и произошло значимое снижение числа нейронов с явлениями кариопикноза по сравнениюс данными показателями в первой серии экспериментов (рис. 2),
■^Контроль ЧСиний
ЧСиний и препарат
#
1
I г-
1 1 4
Время после воздействия, сут Рис. 2. Содержание пикношчныхядер нейросенсорных клеток при воздействии лазерным излучением длиной волны 450 нм и на фоне применения синтетического дипептида АВ-7. Здесь и на рис. з значимые различия р < 0,05): # — при сравнении с контролем , * — между группами с коррекцией и без коррекции, & — между группами с применениемсинтетическогоди-пептида и без него в разные сроки эксперимента
На фоне введения синтетического дипептида АВ- 7 количество пикноморфных нейронов внутреннего ядерного слоя значимо снизилось в 1,5 раза по сравнению с их числом при лазерном воздействии без использования препарата (рис. з),
Введение препарата вызвало уменьшение числа пикноморфных мультиполярных нейронов до (4,12 ± ± 0,31)% по сравнению со значениями, полученными в первой серии (р < 0,05). Количество нейронов с тотальным хроматолизом составило (16,29 ± 0,92)% (р < 0,05). Наблюдалось снижение числа нейронов с явлениями очагового хроматолиза в 1,3 раза по сравнению с таковыми в первой серии экспериментов,
#
5
4
3
2
0
АникинаЕ.Ю.,Потапов А.В.,ВаракутаЕ.Ю.и др.
Морфологические изменениясетчатки..
^Контроль с^Синий
- |=Синий и препарат
_^Г^_
**
т!
Время после воздействия, сут Рис. з. Содержание пикноморфных нейронов внутреннего ядерного слоя при воздействии лазерным излучением длиной волны 450 нм и на фоне применениясинтетическогодипептидаАВ- 7
Через н сут после облучениялазером отмечалосьуве-личение числа гипертрофированных пигментоэпителиоци тов и количества фагосом в их цитоплазме. В субретинальном пространстве встречались частично фрагментированные наружные сегменты нейросенсорных клеток и единичные мелкие вакуоли. Сохранные наружные сегменты имели извитую форму за счет неравномерного расширения межмембранных пространств . При сравнении с контролем наблюдалось снижение плотности распределения внутренних сегментов нейросенсорных клеток и увеличение количества пикноморфных нейронов внутреннего ядерного слоя до (7,07 ± 0,61)% р < 0,05) (рис. 4). По сравнению со значениями через 1 сут после лазерного воздействия отмечапосьувепичение числа нейросенсорных клеток с явлениями кариопикноза до (5,88 ± 0,43)% р < 0,05). Помимо этого возросло количество ганглионарных нейроновс очаговымхроматолизомна 31%.
При использовании синтетического дипептида через 14 сут большинство наружных сегментов восстановили нормальное строение. Встречались наружные сегменты извитой формы с неравномерно расширенными межмембранными пространствами. При сравнении с группой без введения препарата отмечалось уменьшение количества пикнотичных нейросенорных клеток на 38 %. Меньшее число клеток внутреннего ядерного слоя характеризовалось наличием отека перикариона. Количество ганглионарныхнейронов с явлениями пикноза и очагового хроматолиза достоверно не отличалось от контроля. Число нейроновс тотальнымхроматопизом по сравнению с наблюдаемым в группе с лазерным воздействием без введения препарата снижалось и составило
(19,44 ± 0,87)% р < 0,05).
Рис. 4. Отек перикариона и деструкция органелл нейрона внутреннего ядерного слоя через 14 сут после воздействия лазерным излучением. Ув. 4 500
Заключение
Лазерное воздействие вызывало деструктивные процессы во всехслояхсетчатки глаза. Наиболее ранними и существенными были повреждения мембранных дисков наружных сегментов и нарушение их взаимоотношения с пиг-ментоэпителиоцитами. Отмечалось увеличение количества клеток с признаками кариопикноза как в наружном, так и во внутреннем ядерных слоях. Во внутреннем ядерном слое наиболее чувствительными являлись амакринные и биполярные нейроны. При воздействии лазерным излучением в них наблюдаются выраженные деструктивные изменения, которые со временем приводят к гибели клеток. Структурные нарушения мультиполярныхнейронов выражалисьсни-жением и перераотределениемхроматофильного вещества в цитоплазме. а также увеличениемчисла клеток с явлениями кариопикноза.
Применение в эксперименте пороговых интенсивностей излучения вызывает повреждения сетчатки, связанные преимущественно с фотохимическими процессами. приводящими к активации свободноэадикатьного окисления клеточных структур [7]. Именно поэтомув качестве коррекции применялся препарат из группы биорегуляторных пептидов, обладающих способностью активировать процессы антиоксидантной защиты и улучшать межклеточные взаимодействия [5, 11]. При изучении биологических свойств выделенных пептидных комплексов было установлено. что они принимают непосредственное участие в процессах тканеспецифической регуляции экспрессии генов и биосинтеза. В результате пептидной регуляции в клетках понижается скорость накопления патологическихизменений и повышается активность ре-паративных процессов, направленных на восстановление
—#. &
4
3
2
0
14
Экспериментальными клиническиеисследования
клеточного гомеостаза [10]. На фоне введения синтетического дипептцдаАВ-17 отмечалосьснижение повреждающе го влияния лазерного излучения, что проявлялось преобладанием реактивных процессов в клетках над деструктивными и, соответственно, большей сохранностью компонентов сетчатки, Все это свидетельствуетв пользуналичияу синтетического дипептида ретинопротекторных свойств при воз-действиилазернымизлучениемпороговой интенсивности.
Литература
1. БотабековаТ.К, Воздействие лазеров на парах металлов на ткани глаза //Рус. мед. журн, 2003. Т. 4. № 1. С. 25.
2. ИзмайловА.С, БалашевичЛ.И, Критерии достаточности пан-ретинальной лазеркоагуляции при диабетической ретинопатии //Офтальмохирургия, 2003. № 4. С. 33—37.
3. КачалинаГ. Ф., ПавловаЕ. С. Субпорогговая аргоновая коагуляция сетчатки в лечении очаговой диабетической макулопатии // Офтальмохирургия, 2004. № 3. С. 43—46.
4. ЛинникЛ.Ф., МагарамовД.А., ЯровойА.А, БулгаковаЕ.С. Диод-лазерная транспупиллярная термотерапия в лечении ма-лыхувеальныхмеланом // Новое в офтальмологии, 2003. № 3.
С. 23—33.
5.
6. НероевВ.В,ТрофимоваС.В,ХавинсонВ.Х. Результаты и перспективы применения пептидныхбиорегуляторов в офтальмологии // Материалы i всерос. конф. «Достижения в научно-прак-тическомздравоохранении», 2002. С. 43—44.
7. ОгневБ.В., ВишневскийА.А, ТроицкийР.А, ТимохинаН.И. Изучение изменений головного мозга и глаз под влиянием лучей лазера//БюЛ| эксперим! биологии и медицинЫ| 1972. Т. 73.
№ 2. С. 103—105.
8. ОстровскийМ.А., ФедоровичИ.Б. Ретиналь как сенсибилизатор фотоповреждения ретинальсодержащих белков сетчатки глаза // Биофизика! Т. 39. № 1. С. 13—1 5.
9. СотниковаЕ.В, ИсманкуловА.О. Опыт использованиянаправ-ленного стимулирующего лазерного воздействия на сохранную область сетчатки у больных с центральной хориоретинальной дистрофией//Офтальмохирургия! 2002. №4. С. 14—16.
10. СтрижковаА.В. Применение различныыхвидов лазерной энергии в лечении возрастной макулярной дегенерации // Клинич i офтальмология! 2005. Т. 6. № 1.
11. ХавинсонВ.Х., ТрофимоваС.В. Пептидные биорегуляторы! в офтальмологии i СПб.: С ПбИКФ« Фолиант », 2000.
12. ХаринцеваС.В, ГармаеваА.Ш., ГолубЛ.А, ЛогуновН.А. Современные методы лечения макулярной дегенерации // Бюл! СО РАМН i 2004. № 1. С. 80—82.
13. ЧирковВ.Д., ЯхонтовН.Е, ЩелоковА.Н. Лазерыы и их применение в биологии и медицине! Горький, 1978.
14. ШиловаО.Г, ФетисовА.А, ЕкимовЛ.С, НазаренкоК.А. Эф фективностьщадящейлазерокоагуляции в лечениидиабетиче ской ретинопатии //Актуальные вопросы! офтальмологии ! 2004. № 1. С. 43.
15. L'esperanceF.A. The ocular histop athologic effect of krypton and argon laser radiation // Amer. Journ. Ophthalmol. 19 69. № 2. P. 263 — 273.
16. ZhangH.., LiX., Li B., Da J. Comparsion of diode and argon l aser lesions i n rabbit retina // Yan Ke Xue BaO. 2004. № 3. Р. 194 — 201.
Поступилав редакциюп.03.2009 г.
Утвержденак печати 19.03.2009 г.
Сведенияоб авторах
Е.Ю.Аникина- аспирант кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии СибГМУ(г. Томск).
А.В.Потапов- д-р мед. наук, профессор СибГМУ (г. Томск).
Е.Ю. Варакута— д-р мед. наук, старший преподаватепькафедры гистологии, эмбриологии и цитологии СибГМУ(г. Томск).
И.В. Бухтияров— д-р мед. наук, профессор, зам. начальникапо научной работе Государственногонаучноисспедрватепьскогоиспытатепьного института Ми-нистерстваобороныы РФ ( г. Москва)
Ю.Ю. Кисляков- канд. биол. наук, зам. начальникаотдела Грсу,царственнргрнаучнр-исспедрватегьс<ргриспытатепьногринсrитута Министерстваоборрны. РФ ( г. Москва).
А.Б. Прокофьев— канд. биол. наук, начальникотдела. старший научныйсотрудник Грсуцарственногрнаучнрисслецрватепьс<ргриспытательнргринституrа Министерстваоборрны. РФ ( г. Москва).
Е.А. Каменкова- научныйсотрудникГосуцарственногонаучнрисслецоватепьс<ргоиспытательногоинституrа Министерстваобороны. РФ ( г. Москва).
С.В. Логвинов— д-р мед. наук, профессор. зав. кафедрой гистологии. эмбриологии и цитологии СибГМУ(г. Томск).
Для корреспонденции
АникинаЕленаЮрьевна 634034, г. Томск, Московскийтракт, 2, СибГМУ, [email protected]
