Морфологические изменения костей скелета экспериментальных животных после перорального приема гидрозолей наноалмазов Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2018 - V. 25, № 4 - P. 217-221

УДК: 6.11.71:615.032:546.26-162 DOI: 10.24411/1609-2163-2018-16183

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ КОСТЕЙ СКЕЛЕТА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПОСЛЕ ПЕРОРАЛЬНОГО ПРИЕМА ГИДРОЗОЛЕЙ НАНОАЛМАЗОВ

Т.Н. ЧЕКИШЕВА, Е.А. ХАПИЛИНА, Е.Л. ЖУКОВ, Н.Н. МЕДВЕДЕВА

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации, ул. Партизана Железняка, д. 1, г. Красноярск, Красноярский край, 660022, Россия, e-mail: maksi726@mail.ru

Аннотация. Изучено строение диафизов бедренной кости экспериментальных животных после приема гидрозолей наноалмазов. Объектами нашего исследования были лабораторные мыши. Методы исследования: изготовление гистологических препаратов, их окраска по методу Ван Гизон, мор-фометрия, статистическая обработка с использованием непараметрического статистического критерия - [/-критерий Манна-Уитни. При морфометрии препаратов оценивались следующие структуры: площадь остеонного слоя, площадь, диаметр, количество остеонов, гаверсовых каналов, толщина стенки остеонов. Представленные результаты свидетельствуют о повышении процесса остеообразо-вания у родителей и первого поколения потомства в ответ на введение в организм гидрозолей нано-алмазов. Показатели площади, диаметра остеонов и гаверсовых каналов достигают максимальных значений у представителей первого поколения потомства, снижаясь до уровня значений контрольной группы у представителей второго поколения потомства. Количество остеонов максимально у представителей родительского поколения мышей, у первого поколения потомства уменьшается количество остеонов, но площадь их увеличивается, что говорит о большей прочности костей в биохимическом отношении. У второго поколения потомства все показатели приближаются к значениям контрольной группы, что свидетельствует об адаптации организма к введению наноалмазов.

Ключевые слова: наноалмазы, мыши, трубчатые кости, диафизы, костная ткань, остеоны.

Введение. Современные тенденции научно-технического прогресса направляют ученых на путь создания, изучения и использования совершенно новых материалов и их свойств. Одной из областей такого поиска являются на-нотехнологии. Наноалмазные частички обладают как свойствами алмаза - прочность, стабильность, - так и приобретают ряд интересных свойств, а именно: их поверхность, благодаря наличию поверхностных групп, можно модифицировать, то есть «пришивать» к их поверхности различные молекулы, например, лекарственные. Это связано с нахождением большинства атомов на межфазной, внешней поверхности частиц, что в свою очередь обуславливает новые для медиков и биологов квантово-механические закономерности их действия. Иные электромагнитные, спектральные, физико-химические, биологические механизмы проявляются в уникальности мембра-нопроницаемости, антимикробного действия, влияния на регуляторный аппарат живых клеток, в том числе генный, в наличии особой механической прочности наноструктур и т.д. Разработка и усовершенствование методов дос-

тавки позволит уменьшить концентрацию вводимого вещества, увеличить продолжительность времени нахождения лекарства в наивысшей концентрации, стабилизировать некоторые лекарственные молекулы, а также добиться того, что лекарство будет работать только в определенном органе [2].

Цель исследования - выявить закономерности изменчивости формирования и строения костной ткани экспериментальных животных при пероральном введении гидрозолей наноалмазов.

Материалы и методы исследования. Объектами нашего исследования были лабораторные мыши, массой 30-42 г, самцы и самки, в количестве 220 особей. Исходными наноалма-зами были наночастицы, полученные в НПО «Алтай» (г. Бийск), которые модифицировали по запатентованной методике сотрудниками Института биофизики СО РАН (г. Красноярск) д.б.н. В.С. Бондарем и А.П. Пузырем. Для проведения эксперимента золи наноалмазов необходимой концентрации готовили добавлением дистиллированной воды или раствора глюкозы к навеске сухого порошка наночастиц [2]. Сам-

цы и самки случайным образом были разделены на контрольную и экспериментальную группы. Животным экспериментальной группы вода была заменена на 0,05% гидрозоль нано-алмазов. Первые 30 суток самцы и самки содержались раздельно - родительское поколение (F0). В экспериментальной и контрольной группах у животных еженедельно учитывали массу их тела, ежедневно учитывали объем потребляемой ими жидкости. Через 30 суток после начала эксперимента к самцам подсаживали самок для получения потомства - к 1 самцу подсаживали по 2 самки. У первого родившегося поколения (F1) контролировали сроки появления признаков созревания и выживаемость на 30-е сутки. На 25-е сутки, по достижению экспериментальными животными полной способности к самостоятельной жизни, поколение F1 отсаживали от матерей, одновременно разделяя самцов и самок. По достижении половоз-релости, на 65-67-е сутки после рождения, к самцам поколения F1 подсаживали самок поколения F1 для получения потомства (поколения F2). У второго родившегося поколения (F2) контролировали сроки появления признаков созревания и выживаемость на 30-е сутки. При этом на протяжении всего эксперимента в качестве питья животные всех поколений контрольной группы получали только дистиллированную воду, а животные всех поколений экспериментальной группы - только 0,05% гидрозоль наноалмазов. Для проведения гистологического исследования экспериментальных животных выводили из эксперимента допустимыми методами эвтаназии [2,5].

Органы (бедренные кости), предназначенные для гистологического и морфометрического анализа, предварительно фиксировали в 10% забуференном формалине. Затем проводили повторную вырезку фиксированного материала на станции вырезки гистологического материала, формируя стандартные кусочки размерами не более 2,0*2,0*0,4 см и укладывали их в маркированные гистологические кассеты для дальнейшего гистологического процессинга. Вырезанные кусочки подвергали окончательной фиксации в 10% забуференном формалине не менее 24 часов. Костные фрагменты декальцинировали в «Трилон Б». После фиксации (и декальцинации) гистологические кассеты с костными образцами помещали в автоматизированный гистологический процессор Leica TP 1020, в котором ткани обезвоживались в абсолютизированном изопро-

пиловом спирте, помещались в промежуточную среду О-ксилол чистый для анализа (О-ксилол ч.д.а) и пропитывались парафиновой средой «Histomix». После уплотнения, образцы заливали в блоки парафиновой средой «Histomix» на станции для заливки блоков в парафин Leica EG 1150H с охлаждающим модулем Leica EG 1150С. Из полученных парафиновых блоков изготавливали парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм на роторном микротоме Leica RM 2235. Полученные парафиновые срезы расправляли в водяной бане Leica HI 1210, наклеивали на предметные стекла. После высушивания и оплавления парафина стекла со срезами депарафинизировали в 2-х сменах О-ксилола ч.д.а. и изопропилового спирта. Далее срезы окрашивали по методу Ван Ги-зон. Гистологическое исследование проводилось на микроскопе Olympus BX45 c насадкой для фото-видеодокументации Olympus DP 25 и пакетом программного обеспечения Cel^D. При обзорной микроскопии оценивали общую гистоархитек-тонику костной ткани, выявляли возможные отклонения от нормального строения, которые заносили в протокол, оценивали площадь остеон-ного слоя; площадь, диаметр остеонов и гавер-совых каналов, толщину стенки остеонов, выявляли возможную локализацию видимых конгломератов наночастиц [4]. Морфометрию осуществляли на цифровых микрофотографиях, полученных с помощью программ Cel^D. Цифровые микрофотографии конвертировали в программе JMicroVision 1.2.7, калибровали в зависимости от увеличения объектива и размера снимка, и проводили непосредственные измерения с помощью программных инструментов, встроенных в морфометрическую программу. Оценивали по 45 образцов животных из каждого поколения. Полученные данные представили в виде медианы и процентилей (25-75%). При проведении статистического анализа использовался непараметрический статистический критерий - U-критерий Манна-Уитни с применением пакета прикладных программ «Statistica 6.0 for Windows». Различия между медианами считали статистически значимыми при степени значимости - р^0,05 [1,5].

Результаты и их обсуждение. При исследовании костной ткани диафизов трубчатых костей животных контрольной группы выявлено, что площадь остеонного слоя в стенке диафизов бедренных костей составляет 23248,23 [21227,32; 26383,72] мкм, у родителей, принимавших гидрозоли наноалмазов, пло-

10иКМЛЬ ОБ ОТШ МЕБТСЛЬ ТЕСЫШШС1Е8 - 2018 - V. 25, № 4 - Р. 217-221

щадь остеонного слоя увеличилась до 35694,1 [35452,63; 41399,33] мкм, что статистически достоверно р=0,014. У представителей первого поколения потомства площадь остеонного слоя остается большей, по сравнению с контрольной группой, а у представителей второго поколения потомства значения данного показателя возвращаются к значениям контрольной группы (рис. 1 и 3).

40000

§ 35000

о зоооо

и 25000

200 00

р £ 15000

Л ЮООО

л = 5000 0

о

1

/ ¿ьь 94,1*

4 г

23243,2 3 2345 5,6***

2 3 4

Гругты животных

-Площадьостеонного слоя

Рис. 1. Площадь остеонного слоя в стенке диафизов бедренных костей мышей контрольной и экспериментальных групп, мкм Примечание: * - контрольная группа и родительская группа (р=0,014), ** - родительская группа и первое поколение потомства (р=0,047), *** - родительская группа и второе поколение потомства (р=0,009)

Наибольшее количество остеонов у представителей родительского поколения мышей -43 [34; 50], по сравнению с контрольной группой - 27 [24,75; 30,25], у представителей первого поколения потомства этот показатель составляет - 32 [25; 34] , снижаясь до 31 [28;34] у представителей второго поколения потомства.

Площадь остеонов у мышей контрольной группы составляет 349,582 [244,291; 479,530] мкм, увеличивается у животных родительского поколения, наибольшего значения достигает у потомства первого поколения - 517,331 мкм [443,179; 598,589], у представителей второго поколения приближается к значениям данного показателя родителей (рис. 2).

Диаметр остеонов практически одинаков у представителей контрольной группы -26,524 [22,014; 37,279] мкм, родительского поколения - 26,289 [22,497; 37,019] мкм и второго поколения потомства - 26,650 [23,406; 31,411] мкм, увеличение значений показателя наблюдается у представителей первого поколения потомства - 32,024 [29,632; 35,029] мкм (рис. 3 и 4). Статистически достоверны показатели между животными первого и второго поколениями (р=0,013), остальные значения статистически не значимы.

„600

\ 500 § 400

| 300

о 200

¡3 100

э „

51 7 ЗЗ!*4"^

34 1,582 9,012 3 83,654**

С О 1 2 3 4 5

Группы животных

♦ Площадь остеонов, мкм

Рис. 2. Площадь остеонов в стенке диафизов бедренных костей мышей контрольной и экспериментальных групп, мкм Примечание: * - контрольная группа и первое

поколение потомства (р=0,006), ** - первое поколение потомства и второе поколение потомства (р=0,001)

Наибольшая толщина стенки остеонов у животных первого поколения потомства - 10,683 [9,399; 11,748] мкм, что не значительно отличается от показателей контрольной группы - 10,448 [6,673; 13,186] мкм. Наименьшее значение показателя наблюдается у родителей - 8,8148 [7,554; 12,765] мкм, вновь увеличивается значение данного показателя у животных второго поколения -9,360 [8,077; 10,526] мкм (рис. 3 и 4). Различия статистически не достоверны, достоверность прослеживается только между первым и вторым поколениями, р=0,014.

Показатели площади и диаметра гаверсого канала остеонов также достигают наивысшего значения у потомства первого поколения -70,604 [52,573; 80,743] мкм, 12,109 [10,771; 13,671] мкм. У родителей показатели ниже -53,442 [42,507; 66,766] мкм, 10,663 [9,078; 12,160] мкм, но выше относительно значений контрольной группы - 38,369 [31,175; 50,075] мкм, 9,795 [8,867; 11,873] мкм и второго поколения потомства - 48,446 [35,918; 62,928] мкм, 10,467 [8,091; 12,169] мкм. Статистически достоверны показатели площади гаверсовых каналов между контрольной группой и родителями (р=0,007), а также с животными первого поколения потомства (р=0,001); представителями первого и второго поколений потомства (р=0,001). Показатели диаметра гаверсовых каналов достоверны между контрольной группой и родительским поколением (р=0,003); родительским поколением и животными первого поколения потомства (р=0,023); представителями первого и второго поколений потомства, р=0,026.

Рис 3. Стенка диафизов бедренной кости мышей. А - контрольная группа; Б - родительское поколение: диаметр остеона (1); толщина стенки остеона (2); толщина остеонного слоя (3). Окраска: по методу

Ван Гизон

Рис. 4. Стенка диафизов бедренной кости мышей. А - первое поколение потомства; Б - второе поколение потомства: диаметр остеона (1); толщина стенки остеона (2); толщина остеонного слоя (3) Окраска: по методу Ван Гизон

Выводы. Таким образом, количество ос-теонов максимально у представителей тельского поколения мышей, практически тигая значений контрольной группы у вителей второго поколения потомства.

Показатели площади остеонов, диаметр га-версовых каналов, диаметр остеонов достигают максимальных значений у представителей

первого поколения потомства, снижаясь до уровня значений контрольной группы у представителей второго поколения потомства.

Толщина стенки ос-теона наибольшая у животных первого поколения, приближается к этим значениям показатель у представителей второго поколения потомства, наименьшая - у родительского поколения.

Представленные результаты говорят о повышении процесса остеооб-разования у представителей родительского и первого поколения потомства в ответ на введение в организм гидрозолей нано-алмазов. При этом у первого поколения потомства уменьшается количество остеонов, а их площадь увеличивается, что является свидетельством большей прочности костей в биохимическом отношении [3]. Показатели костной ткани у второго поколения потомства, которые приближаются к значениям контрольной группы, свидетель -ствуют о том, что произошла адаптация организма к введению данных веществ.

MORPHOLOGICAL CHANGES IN THE BONES OF THE SKELETON IN EXPERIMENTAL ANIMALS OBTAINED AS A RESULT OF THE ORAL INTAKE OF HYDROSOLS OF NANODIAMONDS

T.N. CHEKISHEVA, E.A. HAPILLINA, E.L. ZHUKOV, N.N. MEDVEDEVA

Federal state budgetary educational institution of higher professional education "Krasnoyarsk state medical University named after Professor V. F. Voyno-Yasenetsky" of Ministry of health of the Russian Federation, Partizan Zheleznyak St., 1, Krasnoyarsk, Krasnoyarsk Region, 660022, Russia, e-mail: maksi726@mail.ru

Abstract. The structure of the diaphysis of the femur of experimental animals has been examined after oral administration of hydrosols of nanodiamonds. The objects of our research were laboratory mice. Research methods: preparation of histological slices, staining of histological sections by the Van Gison method, morphometry, statistical processing using a nonparametric statistical criterion - the Mann-Whitney U test. The following parameters as morphometry results were identified and investigated: area of the osteon layer, are and diameter of osteons, number of osteons and Havers channels, thickness of the wall of osteons. The obtained results indicate an increase in the osteogenesis process in parents and the first genera-

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2018 - V. 25, № 4 - P. 217-221

tion progeny as a response to the introduction into the body of hydrosols of nanodiamonds. The parameters of the area and diameter of the osteons and Havers channels reach the maximum values in representatives of the first generation progeny, decreasing to the level of the control group in representatives of the second generation progeny. The number of osteons is the maximum for representatives of the parent generation of mice, in the first generation progeny the number of osteons decreases, but their area increases, which indicates a greater strength of bones in biochemical terms. In the second generation of offspring, all the indicators approach the values of the control group, which indicates the adaptation of the organism to the introduction of nanodiamonds.

Key words: nanodiamonds, mice, tubular bones, diaphysis, bone tissue, osteones.

Литература

1. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. М.: Практика, 1998. 459 с.

2. Каркищенко Н.Н., Грачев С.В. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях. М.: Профиль, 2010. 358 с.

References

1. Glane S. Mediko-biologicheskaya statistika. Per. s angl [Medical and biological statistics. Translation from English]. Moscow: Praktika; 1998. Russian.

2. Karkishchenko NN, Grachev SV. Rukovodstvo po laboratornym zhivotnym i al'ternativnym modelyam v biomedicinskih tekhnologiyah [Guidance on laboratory animals and alternative models in biomedical technologies]. Moscow: Profil'; 2010. Russian.

3. Медведева Н.Н. Длинные трубчатые кости населения города Красноярска // Сибирское медицинское обозрение. 2004. №1(30). С. 51-54.

3. Medvedeva NN. Dlinnye trubchatye kosti nasele-niya goroda Krasnoyarska [The long bones of the population of the city of Krasnoyarsk]. Sibirskoe medicinskoe obozrenie. 2004;1(30):51-4. Russian.

4. Погорелая М.С. Влияние экстракта из эмбриональных тканей птиц на морфологию бедренной кости мышей при радиационной иммунодепрес-сии // Научные ведомости. 2015. №9 (206). С. 7379.

4. Pogorelaya MS. Vliyanie ehkstrakta iz ehmbrion-al'nyh tkanej ptic na morfologiyu bedrennoj kosti myshej pri radiacionnoj immunodepressii [Effect of the extract from embryonic tissues of birds on the morphology of the femur of mice in radiation immunodepression]. Nauchnye vedomosti. 2015;9(206):73-9. Russian.

5. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: МедиаСфера, 2003. 312 с.

5. Rebrova OYU. Statisticheskij analiz medicinskih dannyh. Primenenie paketa prikladnyh programm STATISTICA [Statistical analysis of medical data. Application of software package STATISTICA]. Moscow: MediaSfera; 2003. Russian.

Библиографическая ссылка:

Чекишева Т.Н., Хапилина Е.А., Жуков Е.Л., Медведева Н.Н. Морфологические изменения костей скелета экпнри-ментальных животных после перорального приема гидрозолей наноалмазов // Вестник новых медицинских технологий. 2018. №4. С. 217-221. БОТ: 10.24411/1609-2163-2018-16183