Морфологические и цитологические особенности организма мышей, употреблявших генетически модифицированный картофель (Solanum tuberosum L. ) с delta-9 ацил-липидной десатуразой

Малышева Елена Владимировна; Якунина Ирина Владимировна; Юрьева Наталия Олеговна; Мелешин Алексей Алексеевич

УДК 612.812.6

DOI: 10.20310/1810-0198-2016-21-5-1884-1888

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗМА МЫШЕЙ, УПОТРЕБЛЯВШИХ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ КАРТОФЕЛЬ (SOLANUM TUBEROSUM L.) С DELTA-9 АЦИЛ-ЛИПИДНОЙ ДЕСАТУРАЗОЙ

1) Тамбовский государственный университет им. Г.Р. Державина 392000, Российская Федерация, г. Тамбов, ул. Интернациональная, 33 E-mail: [email protected] 2) Тамбовский государственный технический университет 392000, Российская Федерация, г. Тамбов, ул. Советская, 106 E-mail: [email protected] 3) Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук 127276, Российская Федерация, г. Москва, ул. Ботаническая, 35 E-mail: [email protected] 4) Всероссийский научно-исследовательский институт картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха 140052, Российская Федерация, Московская обл., Люберецкий р-он., пос. Коренево, ул. Лорха, 23

E-mail: [email protected]

Рассмотрены проблемы введения трансгенных продуктов на потребительский рынок. Исследовано влияние генетически модифицированного картофеля с геном delta-9 ацил-липидной десатуразы на цитологические и морфологические показатели у мышей. Показано увеличение массы тела и массы сердца, уменьшение массы селезенки, дистрофия яичников и изменение формы сердца, нарушение флоры тонкого кишечника, смещение ее в сторону преобладания кокковых форм у мышей, употреблявших генетически модифицированный картофель (Solanum tuberosum L.) с геном delta-9 ацил-липидной десатуразы в течение шести месяцев. Ключевые слова: мыши; морфологические особенности; цитологические особенности; генетически модифицированный картофель (Solanum tuberosum L.); ген delta-9 ацил-липидной десатуразы

ВВЕДЕНИЕ

Картофель клубненосный выращивается во многих странах, широко используется в рационе современного человека. Эта культура, помимо углеводов, содержит ряд витаминов и минералов, белки, богатые аминокислотами, различные органические кислоты.

Однако классические сорта картофеля подвержены действию различных биотических и абиотических стрессоров. Поэтому на современном этапе развития генетики и биотехнологии создаются различные трансгенные линии картофеля, устойчивые к стрессам [1-4]. В то же время остается относительно малоизученным вопрос о влиянии подобной генетически модифицированной продукции на организм млекопитающих. Имеющиеся данные противоречивы, но большинство исследований указывает на негативные последствия кормления млекопитающих клубнями различных трансгенных линий картофеля [5-8].

В связи с этим целью данной работы являлось исследование влияния на состояние внутренних органов у лабораторных беспородных мышей трансгенных растений картофеля (Solanum tuberosum L., сорт Юбилей Жукова), инсерционных мутантов, в которых область Т-ДНК, несущая ген delta-9 ацил-липидной десатуразы

из Synechococcus vulcanus, интегрирована в геном картофеля.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В эксперименте были исследованы 40 беспородных лабораторных мышей (20 самок и 20 самцов) в возрасте 1 месяца, которых поделили на две группы по 10 самцов и 10 самок. Одна группа получала с кормом картофель сорта Юбилей Жукова, вторая - клубни растений этого сорта, инсерционных мутантов, в которых область Т-ДНК, несущая ген delta-9 ацил-липидной десатуразы из Synechococcus vulcanus, интегрирована в геном картофеля. Подопытных животных содержали в условиях вивария (с естественным режимом освещения, при температуре 22-24 °С, относительной влажности воздуха 40-50 %) с использованием стандартной диеты (ГОСТ Р 50258-92). Исследования проводили в соответствии с правилами качественной лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ, а также правилами и Международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1986). Перед постановкой эксперимента животные проходили карантин в течение 14 дней.

1884

Животных взвешивали в утренние часы до кормления через каждые три дня в течение месяца, а затем через месяц. Через шесть месяцев животных вскрыли. Измерили и взвесили сердце, селезенку, почки, печень, яичники/семенники. Гистологические препараты печени, селезенки, тонкого кишечника были изготовлены в виде отпечатков. Производился разлом данного органа, затем к месту разлома прикладывалось предметное стекло, на которое приклеиваются свободные клетки. После этого препараты фиксировались, окрашивались гематоксилин-эозином и изучались под микроскопом.

Статистическая обработка результатов производилась с помощью программы «Statistica 6.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Масса мышей в начале эксперимента в обеих группах была сопоставима. С третьей недели исследования

Таблица 1

Прирост массы в группах в ходе эксперимента

День Экспериментальная группа Контрольная группа

эксперимента M ± а, г M ± а, г

1 11,63 ± 2,24 12,08 ± 3,08

5 11,63 ± 2,48 12,18 ± 3,32

9 11,85 ± 2,41 12,52 ± 3,33

13 13,61 ± 2,29 13,15 ± 3,82

17 14,18 ± 2,08 13,67 ± 3,97

21 14,76 ± 2,16 14,38 ± 4,15

24 15,6 ± 2,35 14,12 ± 4,11

58 20,44 ± 3,13* 17,66 ± 3,80

По окончании эксперимента 27,04 ± 3,63* 22,59 ± 3,94

Примечание: * - достоверность различий прир < 0,05.

Таблица 2

Сравнительная характеристика массы органов в группах

Показатель Экспериментальная группа Контрольная группа

M ± а M ± а

Масса тела, г 27,04 ± 3,63* 22,59 ± 3,94

Относительная масса сердца, % 0,70 ± 0,15* 0,56 ± 0,07

Относительная масса почки, % 0,69 ± 0,09 0,69 ± 0,13

Относительная масса печени,% 4,65 ± 0,94 4,96 ± 0,73

Относительная масса селезенки, % 0,42 ± 0,17* 0,69 ± 0,22

Относительная масса семенника, % 0,31 ± 0,1 0,27 ± 0,09

Относительная масса яичника, % 0,09 ± 0,06 0,21 ± 0,13

Примечание: * - достоверность различий прир < 0,05.

Таблица 3

Сравнительная характеристика массы органов у самок разных групп

Показатель Экспериментальная группа Контрольная группа

M ± а M ± а

Масса тела, г 27,3 ± 4,13* 22,09 ± 3,66

Относительная масса сердца, % 0,62 ± 0,16 0,51 ± 0,06

Относительная масса почки, % 0,66 ± 0,06 0,62 ± 0,09

Относительная масса печени,% 4,49 ± 1,49 5,01 ± 0,89

Относительная масса селезенки, % 0,52 ± 0,05 0,59 ± 0,09

Относительная масса яичника, % 0,09 ± 0,06* 0,21 ± 0,11

Примечание: * - достоверность различий прир < 0,05.

Таблица 4

Сравнительная характеристика массы органов у самцов разных групп

Показатель Экспериментальная группа Контрольная группа

M ± а M ± а

Масса тела, г 26,92 ± 3,77 23,08 ± 4,49

Относительная масса сердца, % 0,74 ± 0,13* 0,59 ± 0,59

Относительная масса почки, % 0,71 ± 0,11 0,76 ± 0,14

Относительная масса печени,% 4,73 ± 0,72 4,90 ± 0,62

Относительная масса селезенки, % 0,37 ± 0,19* 0,79 ± 0,27

Относительная масса семенника, % 0,31 ± 0,10 0,27 ± 0,09

Примечание: * - достоверность различий прир < 0,05.

наблюдается более интенсивный прирост массы тела мышей экспериментальной группы. Через два месяца разница в весе между группами становится достоверной и сохраняется до конца эксперимента (табл. 1).

Анализ результатов эксперимента показал, что в среднем у мышей экспериментальной группы достоверно выше масса тела, относительная масса сердца и достоверно меньше относительная масса селезенки, чем у мышей контрольной группы (табл. 2).

Однако были обнаружены отличия показателей в половых группах. Так, масса тела в экспериментальной группе была больше за счет веса самок, которые были достоверно крупнее, чем самки контрольной группы (табл. 3). В то же время масса тела самцов отличалась незначительно (табл. 4). Возможно, такие результаты связаны с более высоким содержанием жирных ненасыщенных кислот в клубнях данного картофеля [1].

У самцов экспериментальной группы с высокой степенью достоверности была больше относительная

1885

масса сердца (табл. 4). Кроме того, у них сердце имеет округлую форму, а не яйцеобразную, как должно быть в норме. Эти признаки могут свидетельствовать о сердечной недостаточности [9].

У самок обеих групп форма и размеры сердца существенно не отличались, а яичники самок экспериментальной группы были значительно меньше (табл. 3).

Масса селезенки у самцов экспериментальной группы была вдвое меньше, чем у самцов контрольной группы (табл. 4). Селезенка выполняет разнообразные функции в организме. Она играет роль фильтра, поглощая поврежденные эритроциты, бактерии и другие чужеродные вещества. В числе многих других органов селезенка способствует формированию иммунитета. Установлено участие селезенки и в некоторых этапах обмена веществ: в ней накапливается железо, необходимое для образования гемоглобина. Селезенка служит подсобным резервуаром крови - при необходимости запас крови, находящийся в ней, поступает в общий кровоток.

Таким образом, уменьшение селезенки может привести к недостаточности вышеперечисленных функций.

Цитологическое исследование органов у мышей обеих групп не выявило патологий.

Анализ микрофлоры тонкого кишечника показал наличие скудной смешанной флоры у мышей контрольной группы, в единичном случае у них были отмечены грибы рода Candida. У большинства мышей экспериментальной группы флора скудная с преобладанием кокковой, у нескольких мышей также обнаружены грибы рода Candida и жировые капли.

Нормальная кишечная флора осуществляет в организме защитную функцию, витаминообразующую, ферментную, а также стимулирует иммунологическую резистентность организма. Существуют определенные критерии, нормы количественного и качественного состава микрофлоры. В тонком отделе кишечника в норме микрофлора чрезвычайно скудна. Нормальная микрофлора влияет на структуру слизистой оболочки кишечника и ее адсорбционную способность. Присутствие микрофлоры в два раза ускоряет процесс обновления слизистой оболочки кишечника. Важна роль кишечных микроорганизмов в обмене жирных кислот, метаболизме липидов, желчных кислот, билирубина, водно-солевом обмене и газообмене. Нормальная микрофлора играет важную роль в создании иммунитета у хозяина. Ее отсутствие вызывает ослабление как клеточных, так и гуморальных факторов иммунологической защиты. Нормальная микрофлора, благодаря продуцированию антибиотических соединений и выраженной антагонистической активности, предохраняет организм от внедрения патогенной флоры.

Причины нарушения микробного равновесия могут быть самые различные. Развитие дисбактериоза зависит от токсического и аллергического факторов. Таковым вполне может послужить употребление в пищу трансгенного картофеля. Токсическое повреждение кишечника, а также его сенсибилизация создают благоприятные условия для нарушения эубиотического равновесия в кишечнике. Распространение микробов в проксимальные отделы желудочно-кишечного тракта является одним из факторов, способствующих поддержанию воспалительных процессов слизистой оболочки, нарушению моторной и секреторной функции кишечника, которые отрицательно влияют на процессы пищеварения и вызывают клинические проявления болезни.

При дисбактериозе страдает не только полостное пищеварение, но и пристеночное. При воспалительном процессе слизистой оболочки снижается интенсивность регенерации эпителия, это ведет к прогрессирующей атрофии слизистой, снижению адсорбционной способности эпителиальных клеток, нарушается пристеночное пищеварение, что, в свою очередь, ведет к накоплению в просвете кишки не полностью гидроли-зованных продуктов [10]. Возможно, с этим связано нахождение капель жира в тонком кишечнике у мышей экспериментальной группы.

ВЫВОДЫ

1. Самки мышей, употреблявшие генетически модифицированный картофель (Solanum tuberosum L.) с delta-9 ацил-липидной десатуразой, имеют достоверно большую массу тела по сравнению с самками контрольной группы. Самцы экспериментальной и контрольной группы по массе тела существенно не отличаются.

2. У самцов мышей, употреблявших генетически модифицированный картофель (Solanum tuberosum L.) с delta-9 ацил-липидной десатуразой, отмечается уменьшение селезенки и увеличение массы и размеров сердца по сравнению с самцами контрольной группы.

3. У самок обеих групп относительная масса и размеры сердца и селезенки сопоставимы, но отмечается дистрофия яичников.

4. Употребление данной линии трансгенного картофеля вызывает нарушение флоры тонкого кишечника, смещение ее в сторону преобладания кокковых форм.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Маали Амири Р., Голденкова-Павлова И.В., Юрьева Н.А. и др. Жирнокислотный состав липидов растений картофеля, трансформированных геном Д12-десатуразы цианобактерии // Физиология растений. 2007. Т. 54. № 5. С. 678-685.

2. Kasuga M., Liu Q., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor // Nature Biotechnology. 1999. V. 17. P. 287-291.

3. Murakami Y., Tsuyuma M., Kobayashi Y., Kodama H., Iba K. Trienoic fatty acids and plant tolerance of high temperature // Science. 2000. V. 287. P. 476-479.

4. Shin J.S., Kim K.-M., Lee D.J., Lee S.B., Burgos N.R., Kuk Y.I.' Resistance levels and fitness of glufosinate-resistant transgenic sweet potato in field experiments // Field Crops Research. 2011. V. 121. I. 3. P. 324332.

5. Малышева Е.В., Мазаева Ю.В., Юрьева Н.О., Беляев Д.В., Меле-шин А.А. Морфологические и цитологические особенности организма мышей, употреблявших генетически модифицированный картофель (Solanum tuberosum L.) с геном SmAMP-2 // Вестник Тамбовского университета. Серия Естественные и технические науки. Тамбов, 2015. Т. 20. Вып. 6. С. 1565-1569.

6. Pusztai A. Genetically modified foods: are they a risk to human / animal health // Biotechnology: genetically modified organisms. 2001.

7. Schubbert R., Hohlweg U., Renz D., Doerfler W. On the fate of orally ingested foreign DNA in mice: chromosomal association and placental transmission in the fetus // Molecules, Genes and Genetics. 1998. V. 259. P. 569-576.

8. Schubbert R., Lettmann C., Doerfler W. Ingested foreign (phage M13) DNA survives transiently in the gastrointestinal tract and enters the blood stream of mice // Molecules, Genes and Genetics. 1994. V. 242. P. 495-504.

9. Heart and Stroke Statistical Update. Dallas: AHA, 2000.

10. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание // Микрофлора человека и животных и ее функции. М.: ГРАНТЬ, 1998. Т. 1. 288 с.

Поступила в редакцию 24 мая 2016 г.

1886

Малышева Елена Владимировна, Тамбовский государственный университет им. Г.Р. Державина, г. Тамбов, Российская Федерация, кандидат биологических наук, доцент кафедры природопользования и землеустройства, e-mail: [email protected]

Якунина Ирина Владимировна, Тамбовский государственный технический университет, г. Тамбов, Российская Федерация, кандидат химических наук, доцент кафедры природопользования и защиты окружающей среды, e-mail: [email protected]

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Юрьева Наталия Олеговна, Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г. Москва, Российская Федерация, кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник отдела биологии клетки и биотехнологии, e-mail: [email protected]

Мелешин Алексей Алексеевич, Всероссийский научно-исследовательский институт картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха, пос. Коренево, Московская область, Российская Федерация, кандидат сельскохозяйственных наук, зав. отделом генетики и селекции, e-mail: [email protected]

UDC 612.812.6

DOI: 10.20310/1810-0198-2016-21-5-1884-1888

MORPHOLOGICAL AND CYTOLOGICAL FEATURES OF ORGANISM OF MICE, WHO CONSUMED GENETICALLY MODIFIED POTATO (SOLANUM TUBEROSUM L.) WITH GENE FOR ACYL-LIPID A9-DESATURASE

1)1 Tambov State University named after G.R. Derzhavin 33 Internatsionalnaya St., Tambov, Russian Federation, 392000 E-mail: [email protected] 2) Tambov State Technical University 106 Sovetskaya St., Tambov, Russian Federation, 392000 E-mail: [email protected] 3) Plant Physiology Institute by K.A. Timiriazev, Russian Academy of Sciences 35 Botanicheskaya St., Moscow, Russian Federation, 127276 E-mail: [email protected] 4) Russian Potato Research Institute by A.G. Lorkh 23 Lorkha St., settl. Korenevo, Lyuberetsky District, Moscow Region, Russian Federation, 140052

E-mail: [email protected]

The problems of the introduction of transgenic products into the consumer market were examined. The impact of the genetically modified potatoes on the cytological and morphological parameters in mice was investigated. An increase in body mass and in hearts mass and a decrease in spleens mass, degeneration of the ovaries and changing of the heart' shape, change of intestinal flora in mice consumed genetically modified potato (Solanum tuberosum L.) with the gene for acyl-lipid A9-desaturase for six months were show. Key words: mice; morphological features; cytological features; genetically modified potato (Solanum tuberosum L.); a gene for acyl-lipid A9-desaturase from the thermophilic cyanobacterium Synechococcus vulcanus

REFERENCES

1. Maali Amiri R., Goldenkova-Pavlova I.V., Yur'eva N.A., Pchelkin V.P., Tsydendambaev V.D., Vereshchagin A.G., Deryabin A.N., Trunova T.I., Los' D.A., Nosov A.M. Zhirnokislotnyy sostav lipidov rasteniy kar-tofelya, transformirovannykh genom A12-desaturazy tsianobakterii [Lipid fatty acid composition of potato plants transformed with the A12-desaturase gene from cyanobacterium]. Fiziolo-giya rasteniy - Russian Journal of Plant Physiology, 2007, vol. 54, no. 5, pp. 678-685. (In Russian).

2. Kasuga M., Liu Q., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor. Nature Biotechnology, 1999, vol. 17, pp. 287-291.

3. Murakami Y., Tsuyuma M., Kobayashi Y., Kodama H., Iba K. Trienoic fatty acids and plant tolerance of high tempera-ture. Science, 2000, vol. 287, pp. 476-479.

4. Shin J.S., Kim K.-M., Lee D.J., Lee S.B., Burgos N.R., Kuk Y.I., Resistance levels and fitness of glufosinate-resistant transgenic sweet potato in field experiments. Field Crops Research, 2011, vol. 121, no. 3, pp. 324-332.

5. Malysheva E.V., Mazaeva Yu.V., Yur'eva N.O., Belyaev D.V., Meleshin A.A. Morfologicheskie i tsitologicheskie osobennosti or-ganizma myshey, upotreblyavshikh geneticheski modifitsirovannyy kartofel' (Solanum tuberosum L.) s genom SmAMP-2 [Morphologic and cytological features of organism of mice, who consumed genetically modified potato (Solanum tuberosum L.) with gene SmAMP-

1887

2]. Vestnik Tambovskogo universiteta. Seriya Estestvennye i tekhnicheskie nauki — Tambov University Reports. Series: Natural and Technical Sciences, Tambov, 2015, vol. 20, no. 6, pp. 1565-1569. (In Russian).

6. Pusztai A. Genetically modified foods: are they a risk to human/animal health. Biotechnology: genetically modified organisms, 2001.

7. Schubbert R., Hohlweg U., Renz D., Doerfler W. On the fate of orally ingested foreign DNA in mice: chromosomal association and placental transmission in the fetus. Molecules, Genes and Genetics, 1998, vol. 259, pp. 569-576.

8. Schubbert R., Lettmann C., Doerfler W. Ingested foreign (phage M13) DNA survives transiently in the gastrointestinal tract and enters the blood stream of mice. Molecules, Genes and Genetics, 1994, vol. 242, pp. 495-504.

9. Heart and Stroke Statistical Update. Dallas, AHA, 2000.

10. Shenderov B.A. Meditsinskaya mikrobnaya ekologiya i funktsional'noe pitanie [Medical microbe ecology and functional nutrition]. Mikroflora cheloveka i zhivotnykh i ee funktsii [Human and animals florula and its functions ]. Moscow, GRANT Publ., 1998, vol. 1. 288 p. (In Russian).

Received 24 May 2016

Malysheva Elena Vladimirovna, Tambov State University named after G.R. Derzhavin, Tambov, Russian Federation, Candidate of Biology, Associate Professor of Wildlife Management and Land Management Department, e-mail: [email protected]

Yakunina Irina Vladimirovna, Tambov State Technical University, Tambov, Russian Federation, Candidate of Chemistry, Associate Professor of Wildlife Management and Protect of Environment Department, e-mail: [email protected]

Yureva Nataliya Olegovna, Plant Physiology Institute by K.A. Timiriazev of Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation, Candidate of Agriculture, Senior Research Worker of Cell Biology and Biotechnology Department, e-mail: [email protected]

Meleshin Aleksey Alekseevich, Russian Potato Research Institute by A.G. Lorkh, Korenevo, Moscow region, Russian Federation, Candidate of Agriculture, Head of Genetics and Selection Department, e-mail: [email protected]

Информация для цитирования:

Малышева Е.В., Якунина И.В., Юрьева Н.О., Мелешин А.А. Морфологические и цитологические особенности организма мышей, употреблявших генетически модифицированный картофель (Solanum tuberosum L.) с delta-9 ацил-липидной десатуразой // Вестник Тамбовского университета. Серия Естественные и технические науки. Тамбов, 2016. Т. 21. Вып. 5. С. 1884-1888. DOI: 10.20310/1810-0198-2016-21-5-1884-1888.

Malysheva E.V., Yakunina I.V., Yureva N.O., Meleshin A.A. Morfologicheskie i tsitologicheskie osobennosti organizma myshey, upotreblyavshikh geneticheski modifitsirovannyy kartofel' (Solanum tuberosum L.) s delta-9 atsil-lipidnoy desaturazoy [Morphological and cytological features of organism of mice, who consumed genetically modified potato (Solanum tuberosum L.) with gene for acyl-lipid Д9-desaturase]. Vestnik Tambovskogo universiteta. Seriya Estestvennye i tekhnicheskie nauki — Tambov University Review. Series: Natural and Technical Sciences, 2016, vol. 21, no. 5, pp. 1884-1888. DOI: 10.20310/1810-0198-2016-21-5-1884-1888. (In Russian).

1888

MORPHOLOGICAL AND CYTOLOGICAL FEATURES OF ORGANISM OF MICE, WHO CONSUMED GENETICALLY MODIFIED POTATO (Solanum tuberosum L.) WITH GENE FOR ACYL-LIPID ∆9-DESATURASE