CC BY
76
УДК 612.812.6
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗМА МЫШЕЙ, УПОТРЕБЛЯВШИХ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ КАРТОФЕЛЬ (SOLANUM TUBEROSUM L.) С ГЕНОМ SMAMP-2
© Е.В. Малышева, Ю.В. Мазаева, Н.О. Юрьева, Д.В. Беляев, А.А. Мелешин
Ключевые слова: мыши; морфологические особенности; цитологические особенности; генетически модифицированный картофель (Solanum tuberosum L.); ген SmAMP-2.
Статья посвящена проблеме введения трансгенных продуктов на потребительский рынок. Исследовано влияни е генетически модифицированного картофеля на цитологические и морфологические показатели у мышей. Трансгенные растения картофеля были получены методом агробактериальной трансформации с использованием генетической конструкции 35S-proSmAMP-2 c маркерным геном устойчивости к канамицину nptll. Показано увеличение массы сердца и уменьшение массы селезенки; дистрофия яичников и изменение формы сердца; увеличение размеров печени; увеличение количества слизи в кишечнике у мышей, употреблявших генетически модифицированный картофель (Solanum tuberosum L.) с геном SmAMP-2 в течение шести месяцев.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время активно внедряются в производство трансгенные растения. Они имеют много преимуществ перед сортами, выведенными при помощи классической селекции. Создаются растения, устойчивые к абиотическим стрессам, таким как засуха, высокие температуры, засоленность почвы [1-4]. Одним из направлений является разработка ГМ (генетически модифицированных) растений, устойчивых к болезням и вредителям [5-6]. Другое направление заключается в создании растений с улучшенной потребительской ценностью, например, обогащенных витаминами, минералами, аминокислотами и так далее. Для создания трансгенных растений используются гены разных организмов. В настоящее время преобладает тенденция использовать «растительные гены» для получения трансгенных растений сельскохозяйственных культур. Одним из таких примеров является использование генов антимикробных пептидов, кодирующих устойчивость к фитопатогенам из съедобного растения мокрица, или звездчатка средняя.
Остается практически неизученным, как повлияют чужеродные гены на потребительские качества получаемой продукции, а особенно - на потребителей.
Наиболее известными и значимыми являются исследования А. Пуштая из Университета Абердина (Великобритания) [7-9]. Им было показано, что кормление крыс ГМ-картофелем с геном лектина луковиц подснежника в течение 10 дней приводило к угнетению иммунной системы и нарушению деятельности внутренних органов (разрушалась печень, изменялись зобная железа и селезенка, уменьшался объем мозга) по сравнению с крысами, которые питались обычным картофелем [8]. Исследования А. Пуштая были подтверждены независимой группой 23 ученых из 13 стран мира, возглавляемой профессором Брюссельского университета E. Van Driessche [9]. В другой серии экспе-
риментов при включении в рацион питания крыс ГМ-картофеля были выявлены серьезные изменения в желудочно-кишечном тракте крыс (быстрая пролиферация клеток слизистой оболочки) [7].
Данные о том, что ДНК в пищеварительном тракте разрушается не до конца, приводят и другие исследователи [10-11]. Что касается колечек плазмид, то «кольцевая форма ДНК делает ее более устойчивой к разрушению».
ГМ-вставки были обнаружены в микрофлоре кишечника. При проведении исследований группой британских генетиков во главе с Х. Гилбертом из университета Ньюкасла-на-Тайне выяснилось, что ДНК из клеток генетически модифицированной пищи заимствуются бактериями микрофлоры кишечника людей с удаленной толстой кишкой. Группа Х. Гилберта провела независимый эксперимент, в ходе которого было показано, что плазмиды и ГМ-вставки могут заимствоваться напрямую микрофлорой кишечника одной клеткой из трех тысяч [12]. О захвате генов и ГМ-плазмид микрофлорой кишечника указывается и в работах других исследователей [13].
Трансгенизация оказывает серьезное влияние на окружающую среду, приводя к уменьшению биоразнообразия, нарушению трофических цепочек.
Производители ГМ-растений утверждают, их продукция имеет только положительные качества: она сильно повышает урожайность. При нынешнем размере населения планеты ГМ-растения могут избавить мир от угрозы голода, т. к. при помощи генной модификации можно увеличивать урожайность и качество пищи, добавляя в нее дефицитные и необходимые компоненты (микро- и макроэлементы, витамины и др.) и вещества, необходимые для жизнедеятельности организмов, потребляющих этот продукт.
Целью нашего исследования являлось изучение влияния на морфометрические показатели лабораторных беспородных мышей трансгенных растений кар-
1565
тофеля (Solanum tuberosum L., сорт Юбилей Жукова), экспрессирующих модифицированный ген SmAMP-2 из зведчатки средней Stellaria media.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Из семян растения зведчатки средней (S. media) в Институте биоорганической химии РАН был выделен пептид, обладающий антимикробной активностью. Была идентифицирована последовательность ДНК, кодирующая этот пептид, и создано несколько модификаций нативного гена, конструкцию с одной из которых (proSmAMP-2) мы использовали для получения трансгенных растений картофеля.
Трансгенные растения картофеля были получены методом агробактериальной трансформации с использованием генетической конструкции 35S-proSmAMP-2 c маркерным геном устойчивости к канамицину nptll в Институте физиологии растений РАН. Встройка целевого гена была подтверждена с использованием метода ПЦР. Экспрессия целевого гена - с использованием метода нозерн-гибридизации [14].
В ВНИИ картофельного хозяйства была оценена устойчивость трансгенов к возбудителям альтернарио-за и фитофтороза. Для выделившихся по устойчивости к фитопатогенам линий в условиях теплицы ВНИИКХ был получен клубневой материал, который в дальнейшем использовали для кормления мышей экспериментальной группы.
В эксперименте были исследованы 40 беспородных лабораторных мышей (20 самок и 20 самцов) в возрасте 1 месяца, которых поделили на две группы по 10 самцов и 10 самок. Первая группа получала с кормом
картофель исходного сорта Юбилей Жукова, а вторая -трансгенные растения картофеля сорта Юбилей Жукова, экспрессирующие ген SmAMP-2 из S. media. Подопытных животных содержали в условиях вивария (с естественным режимом освещения, при температуре 22-24 °С и относительной влажности воздуха 40-50 %) с использованием стандартной диеты (ГОСТ Р 5025892). Исследования проводили в соответствии с правилами качественной лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ, а также правилами и Международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1986). Перед постановкой эксперимента животные проходили карантин в течение 14 дней.
Животных взвешивали в утренние часы до кормления через каждые три дня в течение месяца, а затем через месяц. Через шесть месяцев животных вскрыли. Измерили и взвесили сердце, селезенку, почки, печень, яичники/семенники. Для сравнения использовалась относительная масса - масса органа относительно массы тела, выраженная в процентах.
Производилось цитологическое исследование органов методом отпечатков.
Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью программы «Statistica 10.0».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ результатов вскрытия показал, что у мышей экспериментальной группы достоверно выше масса сердца и меньше масса селезенки, чем у мышей контрольной группы (табл. 1).
Таблица 1
Сравнительная характеристика массы органов в группах
Показатель Экспериментальная группа Контрольная группа
M ± а M ± а
Масса тела, г 24,12 ± 2,78 22,59 ± 3,94
Относительная масса сердца, % 0,67 ± 0,12 0,56 ± 0,07*
Относительная масса почки, % 0,68 ± 0,15 0,69 ± 0,13
Относительная масса печени, % 4,48 ± 0,63 4,96 ± 0,73
Относительная масса селезенки, % 0,44 ± 0,09 0,69 ± 0,22*
Относительная масса семенника, % 0,29 ± 0,12 0,27 ± 0,09
Относительная масса яичника, % 0,04 ± 0,004 0,21 ± 0,13*
Примечание: * - достоверность различий при р < 0,05.
Таблица 2
Сравнительная характеристика массы органов у самцов разных групп
Показатель Экспериментальная группа Контрольная группа
M ± а M ± а
Масса тела, г 25,28 ± 3,29 23,08 ± 4,49
Относительная масса сердца, % 0,69 ± 0,09 0,59 ± 0,59
Относительная масса почки, % 0,74 ± 0,17 0,76 ± 0,14
Относительная масса печени, % 4,12 ± 0,27 4,90 ± 0,62*
Относительная масса селезенки, % 0,44 ± 0,09 0,79 ± 0,27*
Относительная масса семенника, % 0,29 ± 0,12 0,27 ± 0,09
Примечание: * - достоверность различий при р < 0,05. 1566
Таблица 3
Сравнительная характеристика массы органов у самок разных групп
Показатель Экспериментальная группа Контрольная группа
M ± а M ± а
Масса тела, г 22,72 ± 1,14 22,09 ± 3,66
Относительная масса сердца, % 0,65 ± 0,15 0,51 ± 0,06
Относительная масса почки, % 0,61 ± 0,10 0,62 ± 0,09
Относительная масса печени, % 4,92 ± 0,68 5,01 ± 0,89
Относительная масса селезенки, % 0,44 ± 0,10 0,59 ± 0,09*
Относительная масса яичника, % 0,04 ± 0,004 0,21 ± 0,13*
Примечание: * - достоверность различий при р < 0,05.
При исследовании особенностей внешнего строения различных органов обращает на себя внимание существенное увеличение размеров печени у самцов экспериментальной группы при ее меньшей массе по сравнению с самцами контрольной группы. Причин увеличения печени может быть несколько: утилизация избытка вредных токсических соединений (компенсаторная функция); сердечно-сосудистая недостаточность (при этой патологии кровь медленнее движется по сосудам, это способствует отеку печени и увеличению ее в размерах); вирусные инфекции и токсины (вызывают воспалительный процесс в печеночных тканях, что приводит сначала к отеку печени, а затем к значительному ее увеличению); гепатомегалия также развивается при жировом гепатозе, когда в печеночных тканях содержится чрезмерное количество жировых клеток.
У самцов экспериментальной группы также увеличены размеры сердца при сходной общей массе тела. В то же время размеры селезенки в экспериментальной группе меньше, чем у самцов контрольной группы.
У самок экспериментальной группы сердце имеет округлую форму, а в норме должно быть овальной (яйцеобразной) формы, как у самок контрольной группы. Сферическая форма сердца свидетельствует о сердечной недостаточности, которая при всем прочем может развиться при лекарственной или иной интоксикации. Почки и селезенка у самок экспериментальной группы несколько меньше, а размеры печени увеличены по сравнению с самками контрольной группы. Кроме того, у самок экспериментальной группы наблюдается существенное уменьшение размеров яичников.
Цитологическое исследование органов у мышей обеих групп не выявило патологий. На отпечатках селезенки обнаружены лимфоидные элементы, на некоторых препаратах - с нитями фибрина.
На препаратах с отпечатками печени обнаружены эритроциты, бесструктурное вещество, голоядерные элементы (предположительно, ядра гепатоцитов).
У мышей контрольной группы в тонком кишечнике наблюдалась скудная смешанная флора, в единичном случае встречаются грибы рода Candida. У мышей экспериментальной группы наряду со скудной смешанной флорой наблюдалось присутствие слизи, также в единичном случае встречаются грибы рода Candida.
Большое количество слизи может вырабатываться при воспалительных процессах в кишечнике. Воспаление в кишечнике может развиваться в результате воздействия множества различных причин:
- инфекции - воспаление вызывают бактерии (кишечная палочка, сальмонеллы, шигеллы), вирусы (ротавирус) или простейшие (амебная дизентерия);
- аутоиммунные процессы - состояние, при котором иммунная система воспринимает клетки слизистой оболочки кишечника как чужеродные и вырабатывает антитела к ним, которые и вызывают воспаление (неспецифический язвенный колит, болезнь Крона);
- недостаточное кровообращение в сосудах стенок кишечника в результате атеросклеротических изменений и сужения артериального русла;
- нарушение нормальной микрофлоры кишечника -преобладание условно-патогенной флоры приводит к воспалительным процессам в слизистой оболочке.
ВЫВОДЫ
1. Клубни трансгенного картофеля сорта Юбилей Жукова с геном SmAMP-2 из Stellaria media в рационе питания вызывают увеличение массы сердца и уменьшение массы селезенки у беспородных мышей.
2. У самок, получающих данный картофель, наблюдается дистрофия яичников и изменение формы сердца.
3. У самцов экспериментальной группы наблюдается существенное увеличение размеров печени при ее меньшей массе по сравнению с самцами контрольной группы.
4. Цитологическое исследование селезенки и печени не показало различий между группами.
5. Трансгенный картофель сорта Юбилей Жукова с геном SmAMP-2 не влияет на флору тонкого кишечника, однако у мышей экспериментальной группы вырабатывается больше слизи, что может свидетельствовать о воспалительных процессах в этом отделе пищеварительной системы.
Наблюдаемые изменения в морфологии тканей и органов изученных мышей могут быть обусловлены влиянием как целевого гена SmAMP-2, так и селективного маркерного гена npt11. Выделить влияние целевого гена в данной работе не представляется возможным, т. к. в эксперименте мы использовали клубни только трансгенных растений, полученных с использованием генетической конструкции, несущей оба гена -SmAMP-2 и npt11.
ЛИТЕРАТУРА
1. Albacete A., Cantero-Navarro E., Balibrea M.E., Grofíkinsky D.K., de
la Cruz González M. et al. Hormonal and metabolic regulation of toma-
1567
to fruit sink activity and yield under salinity // J. Exp. Bot. 2014. V. 65. I. 20. P. 6081-6095.
2. Lubovska Z., Dobra J., Storchova H., Wilhelmova N., Vankova R. Cytokinin oxidase/dehydrogenase overexpression modifies antioxidant defense against heat, drought and their combination in Nicotiana taba-cum plants // J. Plant Physiol. 2014. V. 171. I. 17. P. 1625-1633.
3. Xu H., Wei Y., Zhu Y., Lian L., Xie H. et al. Antisense suppression of LOX3 gene expression in rice endosperm enhances seed longevity // Plant Biotechnol. J. 2015. V. 13. I. 4. P. 526-539.
4. Zhong L., Chen D., Min D., Li W., Xu Z. et al. AtTGA4, a bZIP transcription factor, confers drought resistance by enhancing nitrate transport and assimilation in Arabidopsis thaliana // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2015. V. 457. I. 3. P. 433-439.
5. Cruz D., Eizaguirre M. Do Sesamia nonagrioides (Lepidoptera; Noc-tuidae) gravid females discriminate between Bt or multivitamin corn varieties? Role of olfactory and visual cues // J. Insect. Sci. 2015. V. 15. I. 1. P. 1-5.
6. Klose H., Gunl M., Usadel B., Fischer R., Commandeur U. Cell wall modification in tobacco by differential targeting of recombinant endog-lucanase from Trichoderma reesei // BMC Plant Biol. 2015. V. 15. I. 1. P. 1-11.
7. Pusztai A. Genetically modified foods: are they a risk to human/animal health. Biotechnology: genetically modified organisms. 2001. URL: ActionBioscience.org (accessed: 26.06.2015).
8. Schubbert R., Hohlweg U., Renz D., Doerfler W. On the fate of orally ingested foreign DNA in mice: chromosomal association and placental transmission in the fetus // Molecules, Genes and Genetics. 1998. V. 259. P. 569-576.
9. Schubbert R., Lettmann C., Doerfler W. Ingested foreign (phage M13) DNA survives transiently in the gastrointestinal tract and enters the blood stream of mice // Molecules, Genes and Genetics. 1994. V. 242. P. 495-504.
10. Chen J., Burke J.J. Developing fiber specific promoter-reporter trans-genic lines to study the effect of abiotic stresses on fiber development in cotton // PLoS One. 2015. V. 10. I. 6. P. 1-17.
11. Ricroch A.E., Henard-Damave M.C. Next biotech plants: new traits, crops, developers and technologies for addressing global challenges // Crit. Rev. Biotechnol. 2015. P. 1-16.
12. Mercer D.K., Scott K.P., Bruce-Johnson W.A., Glover L.A., Flint H.J. Fate of free DNA and transformation of oral bacterium Streptococcus gordonii DL1 plasmid DNA in human saliva // Applied and Environmental Microbiology. 1999. 65. P. 6-10.
13. Peer review vindicates scientist let go for «improper» warning about genetically modified food. URL: http://naturalscience. com/ns/cover/cover8.html (accessed: 16.05.2015).
14. Alwine J.C., Kemp D.J., Stark G.R. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes // PNAS. 1977. V. 74. P. 5350-5354.
Поступила в редакцию 26 сентября 2015 г.
Malysheva E.V., Mazaeva Y.V., Yuryeva N.O., Belya-ev D.V., Meleshin A.A. MORPHOLOGIC AND CYTOLOGI-CAL FEATURES OF ORGANISM OF MICE, WHO CONSUMED GENETICALLY MODIFIED POTATO (SOLANUM TUBEROSUM L.) WITH GENE SMAMP-2
The article is devoted to the introduction of transgenic products into the consumer market. The impact of the genetically modified potatoes on the cytological and morphological parameters of mice was investigated. Transgenic potato plants were produced by agrobacterium-mediated transformation using genetic constructions 35S-proSmAMP with marker gene nptll of the resistance to the kanamycin. An increase in hearts mass and a decrease in spleens mass, degeneration of the ovaries and changing of the heart' shape, the increase in liver size, increase of the amount of mucus in the intestine in mice consumed genetically modified potato (Solanum tuberosum L.) with the gene SmAMP-2 for six months are shown.
Key words: mice; morphological features; cytological features; genetically modified potato (Solanum tuberosum L.); a gene SmAMP-2.
Малышева Елена Владимировна, Тамбовский государственный университет им. Г.Р. Державина, г. Тамбов, Российская Федерация, кандидат биологических наук, доцент кафедры природопользования и землеустройства, e-mail: biracovatgu@mail.ru
Malysheva Elena Vladimirovna, Tambov State University named after G.R. Derzhavin, Tambov, Russian Federation, Candidate of Biology, Associate Professor of Nature Management and Land Utilization Department, e-mail: birucovat-gu@mail.ru
Мазаева Юлия Владимировна, Тамбовский государственный университет им. Г.Р. Державина, г. Тамбов, Российская Федерация, магистр биологии, зав. лабораториями кафедры природопользования и землеустройства, e-mail: raduga.nazemle@yandex.ru
Mazaeva Yuliya Vladimirovna, Tambov State University named after G.R. Derzhavin, Tambov, Russian Federation, Master of Biology, Head of Laboratories of Nature Management and Land Utilization Department, e-mail: raduga.nazemle@yandex.ru
Юрьева Наталия Олеговна, Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва, Российская Федерация, кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник отдела биологии клетки и биотехнологии, e-mail: yuorieva@mail.ru
Yuryeva Nataliya Olegovna, Timiryazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation, Candidate of Agriculture, Senior Scientific Worker of Cell Biology and Biotechnology Department, e-mail: yuorieva@mail.ru
Беляев Денис Вадимович, Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва, Российская Федерация, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации, e-mail: bdv@ippras.ru
Belyaev Denis Vadimovich, Timiryazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation, Candidate of Biology, Senior Scientific Worker of Laboratory of Physiological and Molecular Mechanisms of Adaptation, e-mail: bdv@ippras.ru
Мелешин Алексей Алексеевич, Всероссийский институт картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха, п. Коренево, Московская область, Российская Федерация, кандидат сельскохозяйственных наук, зав. отделом генетики и селекции, e-mail: aleksej-meleshin@yandex.ru
Meleshin Aleksey Alekseevich, All-Russian Institute of Potato Farming named after A.G. Lorh, settlement Korenevo, Moscow region, Russian Federation, Candidate of Agriculture, Head of Genetics and Selection Department, e-mail: aleksej-meleshin@yandex.ru
1568
