CC BY
101
Si
(S.
$
£*
a
J
1
с
S
I
1
і
§
s
§.
t
2
S.
2
к
iS
^1
S'
£
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ НОРОК РАЗЛИЧНЫХ ГЕНОТИПОВ
Л.Б.Узенбаева, А.Г.Голубева, В.А.Илюха, Н.Н.Тютюнник, М.Г.Нюппиева
Институт биологии Карельского научного центра РАН, г. Петрозаводск, е-mail: ilyukha@bio.krc.karelia.ru
В условиях клеточного норководства получено большое количество мутантных и комбинативных форм, отличающихся от дикого типа американской норки (Mustela vison Schr.) окрасом меха и рядом физиолого-биохимических параметров. Некоторые мутации приводят к появлению нежелательных признаков, изменению устойчивости к заболеваниям и снижению плодовитости.
В связи с тем, что роль различных факторов в механизмах устойчивости по-прежнему не ясна, нами проведено исследование морфологии и цитохимии лейкоцитов крови у норок трех генотипов: стандартных темно-коричневых (A-P-), мутантных рецессивных серебристо-голубых (p/p) и комбинативных ди-рецессивных сапфировых (a/ap/p). В крови определяли количество лейкоцитов и лейкоцитарную формулу на мазках, окрашенных по Паппенгейму-Крюкову (Справочник..., 1975). Цитохимическими методами в лейкоцитах выявляли активность щелочной фосфа-тазы по Берстону (1965), пероксидазы по Грэхему-Кноллю (Хейхоу, Кваглино, 1983), альфа-нафтилацетат эстеразы по Леффлеру (1961), нафтол-AS-D-хло-рацетатэстразы по Руденс и Буйкису (1971), а также содержание катионных белков по Шубичу (1974) и гликогена с помощью ШИК-реакции (Обозная, Панков, 1989). У сапфировых норок подсчитывали относительное количество аномальных лейкоцитов, содержащих укрупненные гранулы. Морфометрию гранул в эозинофилах и нейтрофилах осуществляли при световой микроскопии с помощью компьютерной системы анализа изображений с цветной цифровой видеокамерой и программным обеспечением «Видеотест». Определяли количество гранул, их длину, ширину, площадь, в том числе суммарную, а также факторы формы круга и эллипса. Обработку цифрового материала проводили общепринятыми методами вариационной статистики.
В результате комплексных цитохимических и морфометрических исследований установлено, что у норок сапфирового окраса различные типы лейкоцитов крови содержат аномально большие гранулы. По-видимому, особенности организации лейкоцитов у сапфировых норок (a/ap/p) в значительной степени определяются именно геном алеутской окраски (а/а), т.к. в лейкоцитах серебристо-голубой норки подобных отклонений обнаружено не было. Нарушение внутриклеточной структуры лейкоцитов сапфировых норок имеет сходство с синдромом Че-диак-Хигаши, обнаруженным у ряда животных и человека.
Таблица 1
Параметры гранул лейкоцитов крови норок сапфирового окраса
Исследуемые параметры Эозинофильные лейкоциты Сегментоядерные лейкоциты
M ± m min max M ± m min max
Всего, шт. 761 379
Количество в клетке, шт. 14,63 ± 1,40 1,00 43,00 2,15 ± 0,09 1,00 6,00
Площадь одной гранулы, мкм2 1,33 ± 0,05 0,04 11,14 0,96 ± 0,03 0,16 5,85
Площадь суммарная, мкм2 19,42 ± 1,05 3,89 36,14 2,06 ± 0,08 0,32 5,85
Длина, мкм 1,44 ± 0,03 0,27 6,55 1,14 ± 0,02 0,46 3,25
Ширина, мкм 1,06 ± 0,02 0,23 3,38 0,94 ± 0,02 0,36 2,62
Фактор формы круга, отн. ед. 0,93 ± 0,00 0,31 1,00 0,99 ± 0,00 0,55 1,00
Фактор формы эллипса, отн. ед. 0,98 ± 0,00 0,01 1,00 0,99 ± 0,00 0,10 1,00
Округлость, отн. ед. 0,71 ± 0,01 0,16 1,00 0,84 ± 0,01 0,29 1,00
Удлиненность, отн. ед. 1,36 ± 0,01 0,62 4,13 1,22 ± 0,01 0,99 3,12
Микрофотографии, свидетельствующие о патологии гранулярного аппарата и особенностях локализации различных субстанций в лейкоцитах сапфировых норок, представлены на рис. 1. Дефект цитоплазматических гранул при окраске по Паппенгейму-Крюкову наблюдается во всех эозинофилах, части нейтрофилов, базофилах и редко в моноцитах и лимфоцитах. Видоизмененные, укрупненные гранулы в циркулирующих нейтрофилах у сапфировых норок хорошо выделяются на фоне почти прозрачной цитоплазмы (рис. 1 а). Они отличаются от едва заметной пылевидной зернистости, характерной для нейтрофилов темно-коричневых и серебристо-голубых норок. Обращает на себя внимание существенное изменение у сапфировых норок морфологии эозинофилов, в которых за редким исключением нарушается характер распределения специфических гранул, возможно, обусловленный отклонениями в структуре мембран или микротубулярного аппарата клетки (рис. 1 б). Степень гранулярного расстройства в эозинофилах у отдельных особей и в различных клетках одного животного не одинакова. Лишь единичные из эозинофилов имеют равномерно расположенные, в том числе и достаточно крупные гранулы. По локализации и другим свойствам, в частности, отсутствию видимых в световом микроскопе морфологических признаков слияния гранул такие клетки ближе всего к нормальным.
Морфометрические параметры гранул нейтрофилов и эозинофилов норок сапфирового окраса показывают, что увеличенные гранулы лейкоцитов по размеру, количеству, а иногда и по форме существенно отличаются от таковых не только у стандартных норок, но и от других видов млекопитающих (таб. 1).
Наличие дефекта в лейкоцитах у норок сапфирового окраса подтверждается цитохимическими исследованиями. К числу информативных тестов относится реакция на пероксидазу, занимающая важное место в системе защитных реакций организма. У стандартных и серебристо-голубых норок пе-роксидазопозитивные гранулы равномерно заполняют внутриклеточное пространство в нейтрофилах и содержатся в специфических гранулах эозинофилов. У сапфировых норок активность пероксидазы сосредоточена в очень крупных, варьирующих по величине гранулах нейтрофилов (рис. 1 в) и эозинофилов (рис. 1 г). Подобный дефект в лейкоцитах крови человека приводит к нарушению способности к слиянию гранул с фагоцитарной вакуолью и снижению содержания в ней миелопероксидазы (Weening et al., 19B1). По некоторым данным, использование пероксидазной реакции для определения генетического отклонения у норок нецелесообразно вследствие присутствия фермента и в нормальных клетках (Konrad et al., 1979), однако полученные нами данные показали демонстративность цитохимической реакции на пероксидазу и значительные отличия ее у сапфировых норок от стандартных и серебристо-голубых.
У норок исследованных окрасов положительная реакция на неферментный катионный протеин выявлена в нейтрофилах и эозинофилах. Согласно литературным данным, этот белок локализован в лизосомах, обладает бактерицидными свойствами и играет существенную роль в фагоцитозе (Пигаревс-кий, 197B). Однако установлено, что по мере увеличения степени зрелости нейтрофильного гранулоцита может нарастать внегранулярное расположение катионного протеина (Обозная, Панков, 19B9). В нейтрофилах темно-коричневых и серебристо-голубых норок наблюдается его присутствие в виде мелкой грануляции в цитоплазме, в эозинофилах - в крупных, примерно рав-
ной величины гранулах. В отличие от этих двух окрасов у сапфира катионный протеин в нейтрофилах выявляется в нескольких, но чаще в одной крупной грануле (рис. 1 д), в эозинофилах - в нескольких увеличенных гранулах (рис. 1 е). В эозинофилах сапфировых норок различия по величине гранул, содержащих катионный протеин, по-видимому, выражены меньше, чем в наблюдаемых для пероксидазы.
Активность альфа-нафтилацетат эстеразы - одного из лизосомальных ферментов в нейтрофильных лейкоцитах темно-коричневых и серебристоголубых норок выражена слабо и отсутствует в эозинофилах. У сапфировых норок в нейтрофилах реакция на этот фермент может быть представлена в виде крупных аномальных гранул, равномерного окрашивания цитоплазмы, а также сочетания крупногранулярной и диффузной локализации фермента (рис. 1 ж). В некоторых, особенно аномально больших гранулах эозинофи-лов, в отличие от темно-коричневых и серебристо-голубых норок отмечено присутствие активности альфа-нафти-лацетат эстеразы (рис. 1 з).
Характер распределения другого фермента лизосом - нафтол-АБ-О-хло-рацетат эстеразы у сапфировых норок также отличается от такового у темнокоричневых и серебристо-голубых. По литературным данным, этот фермент с учетом некоторых исключений является маркером лейкоцитов нейтрофиль-ного ряда (Хейхоу, Кваглино, 1983). Наши результаты подтвердили наличие хлорацетатэстеразной активности в нейтрофильных лейкоцитах норок исследованных окрасов и отсутствие в эозинофилах. Обладая протеолитичес-кой активностью, данный фермент участвует в переваривающей функции лейкоцитов. У сапфировых норок так же как и пероксидаза, нафтол-Ав-О-хло-рацетат эстераза выявляется в укрупненных гранулах нейтрофильных лейкоцитов (рис. 1 и).
Известно, что цитохимическими методами в лейкоцитах с большой достоверностью можно определить тип гранул, т.к. они содержат определенный набор ферментов и других биологически активных соединений(Бережная, 1988). Как видно из представленного материала, в дефектных гранулах лейкоцитов сапфировых норок обнаружена активность пероксидазы, неспецифических эстераз и катионный протеин. Вне этих гранул сосредоточены щелочная фосфатаза и шИК-положи-тельный материал. Исходя из этого, по цитохимическим признакам, в частности, присутствию лизосомальных фер-
Рис. 1. Паталогия гранулярного аппарата в лейкоцитах сапфировых норок
ментов, аномальные структуры, наблюдаемые у сапфировых норок, соответствуют азурофильным или, так называемым, первичным гранулам, формирующимся на более ранних стадиях созревания, чем вторичные.
Таким образом, у норок сапфирового окраса установлены морфологические и цитохимические особенности лейкоцитов, свидетельствующие о функциональном дефекте. Для лейкоцитов сапфировых норок по сравнению с темно-коричневыми и серебристо-голубыми характерно увеличение цитоплазматических гранул, содержащих пероксидазу, неспецифические эстеразы и неферментный катионный протеин. Степень нарушения варьирует в отдельных лейкоцитах и неодинакова у отдельных особей. Аномальная внутриклеточная структура, по-видимому, является одной из причин дисфункции лейкоцитов у сапфировых норок, что приводит к снижению антиинфекционной устойчивости.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Бережная Н.М. 1988. Нейтрофилы и иммунологический гомеостаз.- Киев: Наукова думка. 192 с.
Берстон М. 1965. Гистохимия ферментов.- М: Мир. 464 с.
Обозная Э.И., Панков Е.Я. 1989. Цитохимия костного мозга при криоконсервировании. Атлас.-Киев: Наукова думка.С. 34-35.
Пигаревский В.Е. 1978. Зернистые лейкоциты и их свойства. - М: Медицина. 128 с.
Руденс Ю.Ф., Буйкис И.М. 1971. Цитохимическое выявление эстераз в клетках периферической крови и костного мозга // Вопросы лейкозологии. Вып.2. С. 239-255.
Хейхоу Ф.Г., Кваглино Д. 1983. Гематологическая цитохимия.- М: Медицина. С. 211.
Шубич М.Г 1974. Выявление катионного белка в цитоплазме лейкоцитов с помощью бромфенолового синего // Цитология. Т. 16, № 10. С. 1321-1322.
Konrad J., Hanak J., Meuka J., Kouba V. 1979. Das Vorkommen von zytoplasmatischen Granula in neutrophilen Leukozyten bei Nerzen (Lutreola vison) // Kleintierpraxis. № 24. S. 87-94.
L'dffler H. 1961. Cytochemischer Nachweis von unspezifischer Esterase in Ausstrichen // Klin. Wachr. Bd. 39, H. 23. S. 1220-1227.
Weening R.S, Schoorel E.P, Roos D. et al. 1981. Effect of ascorbate on abnormal neutrophil, platelet and lymphocytic function in a patient with the CHS // Blood. Vol. 57. №5. P. 856-865.
Международная научно-практическая конференция
