CC BY
30
DOI: 10.24411/2074-5036-2019-10010 УДК: 619:616.995.1:59.018:592
Ключевые слова: аномалия, личинка, паразитическая нематода, северный олень Key words: anomaly, larva, parasitic nematode, reindeer
Логинова О. А., Белова Л. М.
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АНОМАЛИИ ЛИЧИНОЧНЫХ СТАДИЙ НЕМАТОД-ПАРАЗИТОВ СЕВЕРНОГО ОЛЕНЯ (RANGIFER TARANDUS, LINNAEUS, 1758)
LARVAL STAGES REINDER'S NEMA TODES-PARASITES MORPHOLOGICAL ANOMALIES
(RANGIFER TARANDUS, LINNAEUS, 1758)
ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» Адрес: 196084, Россия, г. Санкт-Петербург, Черниговская ул., д. 5 Saint-Petersburg State Academy of Veterinary Medicine, Federal State Budget Educational Institution of Higher Professional Edication Address: 196084, Russia, Saint-Petersburg, Chernigovskaya st., 5
Логинова Ольга Александровна, к. в. н., ассистент каф. паразитологии им. В. Л. Якимова. E-mail: loginova_spb@bk.ru. Тел. +7 (950) 029-54-37 Loginova Olga, PhD of Veterinary Science, Assistant of Parasitology Dept. E-mail: loginova_spb@bk.ru. Tel. +7 (950) 029-54-37 Белова Лариса Михайловна, д. б. н., зав. каф. паразитологии им. В. Л. Якимова. E-mail: larissabelova2010@yandex.ru. Тел. +7 (921) 301-35-03 Belova Larisa, Doctor of Biology Science, Head of the Dept. of Parasitology. E-mail: larissabelova2010@yandex.ru. Tel. +7 (921) 301-35-03
Аннотация. Свежевыделенные фекалии северных оленей собирали на ферме в Ленинградской области (60.142183, 30.328020) и исследовали на кафедре паразитологии по методу Вайда и по методу Петрова и Гагарина. Извлечение личинок третьего возраста из субстрата производили по методу Шильникова. Обездвиживание осуществляли по методу Логиновой-Беловой. Использовали световой микроскоп Микмед-6 (ЛОМО). Фотосъёмку осуществляли при помощи фотокамеры 5D Mark II (Canon) и оптико-механического адаптера (ЛОМО). С помощью метода Вайда из фекалий взрослого самца в феврале 2018-го года были получены личинки, идентифицированные как Elaphostrongylus rangiferi. Помимо типичных, были обнаружены и личинки с шаровидным утолщением тела на уровне его середины. Личинки E. rangiferi с аномальной морфологией были в той же степени подвижны, что и нормальные. Соотношение нормальных и аномальных личинок составило 8:1. При микроскопировании инвазионных личинок отряда Strongylida, культивированных из материала, полученного в августе 2018-го года от взрослой самки, была обнаружена подвижная личинка деформированного строения с двумя выпячиваниями на задней половине тела.
Summary. Freshly excreted reindeer feces were sampled at the farm in the Leningrad region (60.142183, 30.328020) and examined at the Department of Parasitology according to the Vajda's method and Petrov-Gagarin's method. The extraction of third-stage larvae from the substrate was carried out according to the Shilnikov's method. Immobilization was carried out by the Loginova-Belova's method. A light microscope Mikmed-6 (LOMO) was used. Photographing was carried out with a camera 5D Mark II (Canon) and an optical-mechanical adapter (LOMO). Larvae identified as Elaphostrongylus rangiferi were obtained from the feces of an adult male using Vajda's method in February 2018. In addition to the typical ones, larvae with a globular thickening of the body at the level of its middle were also found. The E. rangiferi larvae with abnormal morphology were as mobile as normal ones. The ratio of normal and abnormal larvae was 8:1. A motile larva of a deformed structure with two swellings of the posterior part of its body was found when Strongylida invasive larvae cultured from a material obtained from an adult female in August 2018 were researched at microscopy.
Введение
Утверждение академика К. И. Скрябина о том, что «тератология нематод изучена до чрезвычайности слабо» [4] остаётся актуальным и 70 лет спустя. Причин тому несколько.
Во-первых, аномалии среди нематод - это само по себе редкое явление [4, 6, 7].
Во-вторых, нематоды-паразиты растений и животных, полезных человеку (а также паразиты самого человека), нематоды-паразиты насекомых, вредных для человека (то есть нематоды, рассматриваемые как биологическое оружие), свободноживущие нематоды и нематоды-модельные объекты являются
26
предметом интереса разных групп ученых, чем определяется некоторая автономность получаемых ими данных.
В-третьих, следует разграничивать нарушения морфологии гельминтов:
1) регистрируемые случайным образом в ходе несвязанного с этим явлением исследования (обнаруженная в рыбе личинка анизаки-са с аберрантным аппендиксом пищевода [7]);
2) предполагаемые (изучение защитных механизмов комаров, препятствующих развитию в них личинок нитчатки Банкрофта или дирофилярии [12, 15]; испытание бактериофага при заражении модельной нематоды сальмонеллами [14]; изучение антагонистического влияния энтомопатогенного гриба на энтомопатогенную нематоду при их совместном применении [8]);
3) индуцируемые преднамеренно (воздействие микроволнового излучения на личинок трихинелл, содержащихся в мясе [13]; воздействие новых антигельминтных препаратов и т. д.).
Находки, относящиеся к первой категории, в свою очередь, могут быть:
1) манифестацией патологического состояния гельминта (бактериальная [9], вирусная, грибковая инфекция или инвазия суперпаразитами [4]);
2) тератологическими изменениями (то есть уродствами, вызванными нарушениями зародышевого развития в диапазоне от незначительных отклонений до полной нежизнеспособности [6, 16]);
3) проявлениями эволюционной тенденции (бивульварность самок как тяготение к монодельфности [6]);
4) атавизмом (увеличение числа половых супплементов самцов [6]);
5) частным случаем внутривидовой вариативности.
Однако даже такие процессы, как эмбриональное развитие, экспрессия генов и появление мутаций, также могут быть подвержены влиянию, в том числе, антропогенному. Следовательно, представляется крайне затруднительным вычленить понятие чистой «тератологии» применительно к морфологическим аномалиям, обнаруживаемым у нематод. Поэтому мы считаем
необходимым дать описание двух случаев отклонений в строении личинок паразитических нематод, зафиксированных в ходе проведения диагностических гельминтологических исследований.
Материалы и методы
Свежевыделенные фекалии северных оленей собирали на частной ферме, расположенной в северной части Ленинградской области (60.142183, 30.328020) и доставляли для исследования в лабораторию по изучению инвазионных болезней на базе кафедры паразитологии им. В. Л. Якимова ФГБОУ ВО СПбГАВМ в период с февраля по август 2018-го года. На наличие личинок нематод первого возраста (L1) из семейства Protostrongylidae материал исследовали по методу Вайда. С целью уточнения родовой принадлежности нематод отряда Strongylida проводили культивирование личинок из яиц с доращиванием личинок до инвазионной стадии по методу Петрова и Гагарина. Целесообразность культивирования предварительно подтверждали обнаружением яиц нематод отряда Strongylida флотационным методом (модификация метода Дарлинга) с применением универсальной флотационной жидкости, разработанной сотрудниками кафедры [1]. Извлечение полученных личинок третьего возраста (L3) из субстрата производили по методу Шильнико-ва. Обездвиживание личинок для фотосъёмки осуществляли по методу Логиновой-Беловой [12]. Для микроскопирования объектов использовали световой микроскоп Микмед-6 (ЛОМО). Фотосъёмку осуществляли при помощи полноматричной зеркальной фотокамеры 5D Mark II (Canon) и оптико-механического адаптера (ЛОМО).
Результаты исследований
С помощью метода Вайда из фекалий взрослого самца (хора) Rangifer tarandus в феврале 2018-го года были получены личинки, идентифицированные по их морфологии и физиологии как L1 Elaphostrongylus rangiferi [2]. Однако помимо типичных личинок элафостронгилюса были обнаружены и личинки с шаровидным утолщением тела на уровне середины его длины (рис. 1 и 2).
27
Личинки E. rangiferi с аномальной морфологией были в той же степени подвижны, что и нормальные L1, находившиеся с ними в одной культуре (рис. 3).
Соотношение нормальных и аномальных личинок составило 8:1. У других обследованных животных личинок с аномальной морфологией обнаружено не было. При дальнейших исследованиях фекалий от того же самца были получены только типичные L1 элафостронгилюса.
При микроскопировании инвазионных личинок отряда Strongylida, культивированных из материала, полученного в августе 2018-го года от взрослой самки (важенки), была обнаружена подвижная личинка деформированного строения с двумя выпячиваниями на задней половине тела (рис. 4 и 5).
Обсуждение результатов
В описании морфологии L1 E. rangiferi, представленном автором вида - В. Ю. Мицкевич [2], а также У. Форейтом [5] и Р. КаАе [10], как и в описаниях L1 представителей семейства Protostrongylidae, данных П. А. Поляковым [3], нет упоминаний о шаровидном утолщении в центральной части личинки. Наши наблюдения также свидетельствуют о том, что тело личинки обычно равномерно удлинненое, гладкое (на уровне световой микроскопии). Таким образом, обнаруженное строение можно считать аномалией. У нас не было возможности судить о причине такого явления. Поскольку размер личинок составляет порядка 0,350 мм в длину и 0,015 мм в ширину (0,018мм в месте утолщения), крайне затруднительно изготовить гистологический препарат так, чтобы плоскость среза прошла строго саггитально. Для проведения генетических исследований имевшегося количества личинок также было недостаточно. Кроме того, определение природы их тератологии не входило в задачи проводившегося исследования.
Несмотря на то, что за период наблюдения над L1 E. rangiferi никаких локомоторных нарушений с их стороны отмечено не было, делать вывод о том, что их измененная морфология не сказалась негативно на их жизнеспособности, мы не в праве, поскольку для этого необходимо
было отслеживать дальнейшее развитие обнаруженных личинок в организме промежуточных хозяев - моллюсков, что также не входило в наши задачи, ограниченные изучением гель-минтофауны северных оленей.
Массовый характер морфологической аномалии позволяет предполагать некоторую системность, в частности, что это может быть потомство одной и той же самки.
Что касается деформированной личинки представителей отряда Strongylida, то характер деформаций больше напоминает клинические проявления бактериального поражения. Похожие деформации описаны J. A. Hodgkin с коллегами. Фенотип Dar (деформированный анальный регион), характеризующийся отличительным утолщением на хвостовом конце нематоды, был впервые обнаружен в культуре Caenorhabditis elegans в 1986-м году. Первоначально изоляты Dar были сочтены морфологическими мутантами, но J. A. Hodgkin с соавторами показали, что два независимых изолята несут необычную бактериальную инфекцию, отличную от ранее описанных, которая и явилась причиной фенотипа Dar. Инфекционный агент -это новый виды коринеформной бактерии, названной Microbacterium nematophilum [9].
К. И. Скрябин со ссылкой на Любинского (1931) сообщает о дермомиозите свиной аскариды, в этиологии которой основное значение имеют травматизация покровов нематоды с последующим её инфицированием [4].
Несмотря на изначальную подвижность, деформированная личинка к концу периода наблюдения демонстрировала апатичность, что можно расценить как косвенное подтверждение ее патологического состояния. Кроме того, ее аномальная морфология стала препятствием к идентификации ее родовой принадлежности.
Заключение
Таким образом, описаны две разновидности морфологических аномалий личинок нематод, обнаруженные в ходе стандартных диагностических процедур по выявлению паразитов северного оленя: 1) шарообразное утолщение в средней части личинки первого возраста E. rangiferi, носящее массовый
28
\ <2 Рис. 2
Рис. 3
хкл
Рис. 5
Рис. 4
Рис. 1. Личинка первого возраста Elaphostrongylus rangiferi из фекалий северного оленя в типичном неподвижном положении (головной конец обращен влево). А - личинка с аномальным шаровидным утолщением (стрелочка); Б - личинка нормального строения. Световая микроскопия методом светлого поля, ув. х20, деление шкалы равно 0,015 мм.
Рис. 2. Личинка первого возраста Elaphostrongylus rangiferi из фекалий северного оленя в распрямленном состоянии (головной конец обращен наверх). А - личинка нормального строения; Б - личинка с аномальным шаровидным утолщением (стрелочка); В - увеличенный фрагмент аномального расширения (стрелочка). Световая микроскопия методом светлого поля, А и Б - ув. х20, деление шкалы равно 0,015 мм; В - ув. х100, деление шкалы равно 0,0075 мм.
Рис. 3. Личинка первого возраста Elaphostrongylus rangiferi из фекалий северного оленя в естественном движении (головной конец обращен в левый верхний угол снимка). А - снимок, сделанный в 14:32:09; Б - снимок, сделанный в 14:32:11. Световая микроскопия методом светлого поля, ув.*20, деление шкалы равно 0,015 мм.
Рис. 4. Личинка третьего возраста отряда Strongylida из фекалий северного оленя в естественном движении (головной конец обращен вверх). А - снимок, сделанный в 16:29:27; Б - снимок, сделанный в 16:29:30; В - снимок, сделанный в 16:29:34. Световая микроскопия методом светлого поля, ув.*20, деление шкалы равно 0,035 мм. Рис. 5. Личинка третьего возраста отряда Strongylida из фекалий северного оленя (головной конец обращен вверх). РК - ротовая капсула; КП - клапан пищевода; ПК - просвет кишечника; АО - анальное отверстие; ХКЧ - хвостовой конец чехлика; ХКЛ - хвостовой конец личинки. Стрелочками указаны аномальные утолщения. Световая микроскопия методом светлого поля, А - ув.*20, деление шкалы равно 0,035 мм; Б - ув.*40, деление шкалы равно 0,010 мм. Фотографии Логинова О.А.
29
характер; 2) деформация тела личинки третьего возраста нематоды отряда Strongylida с выпячиваниями на задней половине тела -единичное проявление. Данные аномалии тем более редки, что не относятся к типичным морфологическим отклонениям, регистрируемым у нематод (изменениям в структуре половой системы самцов или самок, укорочению длины хвоста и увеличению числа амфидов) [6].
Список литературы
1. Белова Л.М. Новая универсальная флотационная жидкость для комплексных лабораторных исследований / Л.М Белова, Н.А. Гаврилова, Д.Н. Пудовкин [и др.] // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. 2012. № 4/1. С. 15-17.
2. Мицкевич В.Ю. Гельминты северного оленя и вызываемые ими заболевания. Л.: Колос, 1967. 308 с.
3. Поляков П.А. Прижизненная дифференциальная диагностика стронгилятозов пищеварительного тракта жвачных по инвазионным личинкам : дис. ... канд. вет. наук. Москва, 1953.
4. Скрябин К.И., Шульц Р.-Эд. С. Основы общей гельминтологии. М.: Сельхозгиз, 1940. 724 с.
5. Форейт У. Ветеринарная паразитология : справочное руководство. М.: Аквариум Принт, 2012. С. 185.
6. Цалолихин С.Я. К тератологии свободноживущих нематод / Отчётная научная сессия, посв. 185-летию Зоологического ин-та РАН : сб. мат. // С.-Пб.: ЗИН РАН, 2017. С. 206-209.
7. Berland B. An anisakid nematode larva with aberrant appendix // Sarsia. 1980. № 4. Р. 317-318.
8. Darissa O.M., Iraki N.M. Antagonistic interactions between the biocontrol agents Beauveria bassiana and
Heterorhabditis indica // Russian Journal of Nematology. 2014. № 1. P. 23-29.
9. Hodgkin J.A., Kuwabara P.E., Corneliussen B. Novel bacterial pathogen, Microbacterium nematophilum, induces morphological change in the nematode C. elegans // Current Biology. 2000. № 24. P. 1615-1618.
10. Kafle P. Morphological keys to advance the understanding of protostrongylid biodiversity in caribou (Rangifer spp.) at high latitudes / P. Kafle, L.-M. Leclerc, M. Anderson [et al.] // Parasites and Wildlife. 2017. № 6. P. 331-339.
11. Loginova O.A., Belova L.M., Gavrilova N.A. New method for larvae and small nematodes immobilization // Bulgarian Journal of Veterinary Medicine. 2017. № 20. P. 366-369.
12. Magalhaes T. Expression of defensin, cecropin, and transferrin in Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) infected with Wuchereria bancrofti (Spirurida: Onchocercidae), and the abnormal development of nematodes in the mosquito / T. Magalhaes, I. F. Oliveira, M. A.V. Melo-Santos [et al.] // Experimental Parasitology. 2008. № 120. P. 364-371.
13. Pelgunov A.N. The influence of microwave radiation on the juvenile stages of Tricinella / A. N. Pelgunov, I. M. Odoyevskaya, A. V. Khrustalev [et al.] // Russian Journal of Nematology. 2016. № 2. P. 131-133.
14. Santander J., Robeson J. Bacteriophage prophylaxis against Salmonella enteritidis and Salmonella pullorum using Caenorhabditis elegans as an assay system // Journal of Biotechnology. 2004. № 2. P. 295-297.
15. Solgi R. Susceptibility of Anopheles stephensi (Diptera: Culicidae) to Dirifilaria immitis (Spirurida: Onchocercidae) / R. Solgi, S.M. Sadjjadi, M. Mohebali [et al.] // Russian Journal of Nematology. 2017. № 2. P. 121-127.
16. Wright K.A., Richter S. Teratological Development in the Cephalic Anatomy of the Nematode Romanomermis culicivorax // Journal ofNematology. 1982. № 14. P. 232-237.
ЧОУДПО«ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ БИОЛОГИИ» г. Санкт-Петербург
Курсы повышения квалификации
Ветеринарная кардиология - 4 ступени Л абораторная диагностика Ветеринарная офтальмология Ветеринарная рентгенология - 2 ступени [Ветеринарная ультразвуковая диагностика -4 ступени
Ветеринарная фармация
Предварительная регистрация обязательна! Справки по тел. (812) 612-13-334 или (812) 232-55-92 доб. 208 График проведения и информация на сайте: www.invetbio.spb.ru/seminars.html
Лицензия Комитета по образованию Санкт-Петербурга на осуществление образовательной деятельности по образовательным программам дополнительного профессионального образования № 1093 от 04.08.2014 г.
