CC BY
2
Оригинальная статья
\ / п I/с л с лги 1/*"^ /Г\ \ This work is licensed under a
УДКЬ1Ь-иУ1
ll И International License
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ТРАНСПЛАНТАЦИИ
Аутологичных стволовых клеток костного мозга при первичном билиарном циррозе печени
Шаймарданова Г.М., Федотовских Г.В., Рахметова В.С., Аскаров М.Б., Смагулова А.К.
АО « Национальный научный медицинский центр» г.Астана, Казахстан
Абстракт
При морфологическом гистологическом исследовании печени после трансплантации СККМ выявлено снижение степени воспалительной лимфоплазмоцитарной инфильтрации в портальных трактах, уменьшение степени дистрофических процессов в гепатоцитах, увеличение количества моноцитов и активированных макрофагов в просвете синусоидов. Отмечена гиперплазия холангиоцитов и переходных зон между гепатоцитами и клетками ветвящихся желчных протоков. В портальных трактах появлялись многочисленные кровеносные капилляры. Электронномикроскопически отмечены признаки регрессии фиброзной ткани путем фагоцитоза коллагеновых фибрилл синусоидальной поверхностью печени, фибробластами и макрофагами. Трансплантация аутологичных стволовых клеток костного мозга при билиарном циррозе печени снижала степень воспалительной инфильтрации, способствовала регенерации холангиоцитов, обратному развитию склеротических изменений и усилению ангиогенеза в портальных трактах.
Ключевые слова: билиарный цирроз печени, трансплантация стволовых клеток костного мозга, морфология.
Введение
Первичный билиарный цирроз (ПБЦ) - хроническое гранулематозное деструктивное воспалительное заболевание междольковых и септальных желчных протоков аутоиммунной природы, приводящее кразвитию длительного холестаза, а на поздних стадиях к формированию цирроза [1]. Патогенез фиброза печени при ПБЦ связан с поражением билиарного эпителия, содержащего митохондриальные аутоантигены. Начинаясь с перидуктальной локализации и формирования соединительнотканных порто - портальных и портоцентральных септ, фиброзные изменения заканчиваются всеми признаками крупноузлового или смешанного цирроза печени. При этом, основными фиброгенными клетками портальных трактов являются фибробласты и миофибробласты, а в перицентральной области активированные звездчатые клетки.
Учитывая патогенетические особенности заболевания, современная терапия ПБЦ включает лекарственные вещества, обладающие иммуносупрессивными,
антивоспалительными и антифибротическими свойствами. Однако, отсутствие оптимального метода лечения ПБЦ, неизбежнозатрагиваетвопросыэффективногоиспользования и трансплантационной клеточной гепатоцитопластики с механизмами ингибирования аутоиммунного воспаления, активизации процессов репаративной регенерации и ангиогенеза [2,3,4] . Экспериментально показана возможность стимуляции регенерации печени аутогенными стволовыми клетками костного мозга и аллогенными стволовыми клетками пуповинной крови (Какшитаа S et al.,2003;Masson S.,et а1.,2004^ищ Н^ а1.,2002). Отмечена эффективность аутотрансплантации гемопоэтических
стволовых клеток больным хроническими гепатитами в стадии тяжелого фиброза печени (А.П.Киясов и др.,2008). Торможение активации печеночных звездчатых клеток может достигаться как опосредованным уменьшением воспалительной инфильтрации, приводящей к высвобождению ряда факторов активации ПЗК, так и прямым торможением трансформации их в активные миофибробласты. Перспективным направлением в контроле печеночного фиброза представляется применение цитокинов и антагонистов их рецепторов, что обусловлено непосредственным участием ростовых факторов на всех этапах сложного комплекса межклеточных взаимодействий в процессе фиброгенеза. И в этой связи, эффективным терапевтическим методом в лечении ХДЗП может стать клеточная трансплантация, изменяющая профиль продуцируемых цитокинов и участвующая в регуляции состояния иммунной системы.
Учитывая необходимость разработки методов клеточной терапии при ПБЦ нами было проведено морфологическое исследование печени данных больных при трансплантации аутологичных прекультивированных стволовых клеток костного мозга.
Цель исследования: провести комплексное морфологическое исследование печени больных первичным билиарным циррозом до и после трансплантации аутологичных стволовых клеток костного мозга.
Материалы и методы
Материалом для морфологического исследования послужил биопсийный материал печени 5 больных с билиарным циррозом печени, взятый до и после 2-3
трансплантации гемопоэтических стволовых клеток костного мозга. Аспирация костного мозга из гребня подвздошной кости в количестве 400 мл проводилась после полного клинико-лабораторного обследования. Биотехнологическим методом была выделена гемопоэтическая фракция стволовых клеток с последующим трансплантацией культивированием их в течение 72 часов. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток проводилась системно внутривенно в среднем в количестве до 140x106 клеток.
Парафиновые срезы ткани печени окрашивались гематоксилином, эозином и по Массон-трихром. Для электронно-микроскопического исследования кусочки ткани печени фиксированы в 2,5% растворе глютаральдегида с постфиксацией в 1% растворе четырехокиси осмия. Материал проведен по общепринятой методике и заключен в эпон. Полутонкие и ультратонкие срезы изготавливались на ультрамикротоме Leica. Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим, азуром-2 и основным фуксином. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу. Срезы изучали и фотографировали в электронном микроскопе Libra 120 (Carl Zeiss).
методике. С парафиновых блоков изготавливались срезы толщиной 3-5 мкм, которые окрашивались гематоксилином и эозином, Массон - трихромом, Конго -рот, PAS и серебром. Иммунофлюоресцентные исследования проводились по общепринятой методике и окрашивались антителами FITC. Микроскопия осуществлялась на светооптических системах «Axiostar» и «Axioskop-40» фирмы «С. Zeiss». Для электронномикроскопического исследования биопсийные кусочки ткани почек фиксировали в 2,5 % растворе глютаральдегида с постфиксацией в 1% растворе четырехокиси осмия, проводились по общепринятой методике и заключались в эпон. Полутонкие и ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме Leica. Полутонкие срезы окрашивались метиленовым синим, азуром 2 и основным фуксином (C. Humphrey, F. Pittman, 1974). Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу, исследовали и сохраняли в электронном микроскопе Libra 120 (C. Zeiss).
Результаты
При гистологическом светооптическом исследовании биопсийного материала печени до трансплантации СККМ структурные изменения характеризовались наличием, как правило, активного монолобулярного цирроза с выраженным разрастанием соединительной ткани и плотным инфильтратом из лимфоцитов, плазматических клеток, полиморфно - ядерных лейкоцитов и макрофагов в портальных и перипортальных трактах печени (рисунок 1). Формировались порто-портальные и порто-центральные септы с образованием ложных долек. В портальных трактах воспалительная инфильтрация выходила за пределы пограничной пластинки, определялись холангиолы, распространяющиеся в перипортальные отделы. В большей части протоков пролиферация снижается. Вокруг желчных протоков перидуктальный фиброз. В паренхиме определялось большое количество печеночных клеток в состоянии гидропической и очаговой баллонной дистрофии. В гепатоцитах скопление желчного пигмента, формирование псевдодуктул. Холестаз перипортально и центролобулярно.
Воспалительная инфильтрация в паренхиме долек. На полутонких срезах портальные и перипортальные поля были склерозированы. Явления фиброза были отмечены как в перипортальной ткани, так и внутри долек в результате врастания в дольку соединительнотканных септ. Междольковая соединительная ткань и соединительнотканные прослойки характеризовались различной степенью макрофагально-плазмоцитарной инфильтрации и большим количеством пролиферирующих фибробластов. В перисинусоидальном пространстве увеличивалось количество коллагеновых волокон, наблюдалась выраженная капилляризация синусоидов с формированием тонкой соединительнотканной мембраны (рисунок 2). Довольно часто встречались признаки жировой, реже вакуольной дистрофии гепатоцитов. Содержание гликогена было неравномерным и сниженным.
Рисунок 1 - Морфология печени до трансплантации СККМ. Цирроз печени монолобулярного типа. Окраска гематоксилином и эозином. Х 100
Рисунок 2 -
Морфология печени до трансплантации СККМ. Коллагеновые волокна в перисинусоидальном пространстве. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим, азуром 2 и основным фуксином. Х 1000
Электронномикроскопически, гепатоциты содержали крупные ядра с ровными контурами ядерной оболочки. Конденсированный хроматин распределялся узкой полоской примаргинально. Перинуклеарное пространство узкое. Многочисленные митохондрии характеризовались зернистой дезорганизацией крист, набуханием матрикса и деструкцией. Канальцы гранулярного эндоплазматического ретикулума располагались беспорядочно,
мембраносвязанные рибосомы были десквамированы, узкие просветы заполнены хлопьевидным материалом средней электронной плотности. В цитоплазме были отмечены мелкие, частично разрушенные везикулы агранулярного эндоплазматического ретикулума и плотные включения желчных пигментов. Жировые капли полиморфны по величине и гомогенны по плотности. Синусоидальная поверхность гепатоцитов на отдельных участках была сглажена. Вдоль нее располагалась четкая, хорошо выраженная базальная мембрана, свидетельствующая о капилляризации синусоидов. В перисинусоидальном пространстве Диссе располагались хлопьевидные массы, тонкие фибриллы и и пучки зрелых коллагеновых фибрилл с характерной поперечной исчерченностью. Тонкие эндотелиальные клетки синусоидов печени находились в состоянии отека с резким просветлением гиалоплазмы и исчезновением органелл. Отдельные эндотелиоциты
были разрушены. В пространстве Диссе были отмечены клетки Ито (рисунок 3), миофибробласты и фибробласты с резко расширенными канальцами гранулярного эндоплазматического ретикулума, что отражало активную коллагенпродуцирующую функцию данных клеточных элементов. Часть макрофагов находилась в состоянии некроза. К особенностям первичного билиарного цирроза печени, как аутоиммунного заболевания были отнесены тесные контакты лимфоцитов с клетками желчных протоков, расположенными в портальном тракте (рисунок 4).
Рисунок 3 - Морфология печени до трансплантации СККМ. Коллагеновые волокна в.перисинусоидальном пространстве. Клетка Ито. Электроннограмма
Рисунок 4 - Морфология печени до трансплантации СККМ. Тесный контакт лимфоцита с клеткой желчного протока. Электроннограмма
На фоне трансплантации аутологичных стволовых клеток наблюдалось клиническое улучшение состояния больных, нивелирование асцита, купирование кожного зуда, уменьшение холестаза, цитолиза, вторичной коагулопатии, переход функционального класса С в класс В по Чайлд-Пью.
Морфологическое исследование печени после трансплантации СККМ показало снижение степени воспалительной лимфоплазмоцитарной инфильтрации в портальных трактах. Сохранялись умеренно выраженные дистрофические изменения гепатоцитов и наличие грубой волокнистой соединительной ткани в портальных трактах (рисунок 5). Увеличивалось количество моноцитов и активированных макрофагов в просвете синусоидов. Отмечена гиперплазия холангиоцитов и переходных зон между гепатоцитами и клетками ветвящихся желчных протоков (рисунок 6). В портальных трактах появлялись многочисленные кровеносные капилляры с тонкой эндотелиальной выстилкой.
Рисунок 5 - Монолобулярный цирроз печени после трансплантации СККМ В портальном тракте умеренная
лимфоплазмацитарная инфильтрация. Выраженный портальный фиброз, порто-портальные септы с лимфогистиоцитарной инфильтрацией. Окраска гематоксилином и эозином. Х 400
Рисунок 6 - Монолобулярный цирроз печени после трансплантации СККМ. Гиперплазия холангиоцитов и переходных зон между гепатоцитами и клетками желчных протоков. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим, азуром 2 и основным фуксином. Х 1000
При электронномикроскопическом исследовании гепатоциты содержали крупные ядра круглой формы с диффузным распределением гетеро- и эухроматина. Перинуклеарное пространство слегка расширено. В цитоплазме располагались многочисленные
крупные митохондрии с зернисто дезорганизованным матриксом умеренной степени электронной плотности и четкими кристами. Отмечена гиперплазия канальцев гранулярного эндоплазматического ретикулума, в основном обвивавших наружные мембраны митохондрий или принимавших упорядоченное расположение. Часть канальцев гранулярного эндоплазматического ретикулума преобразовывалась в вакуоли агранулярного эндоплазматического ретикулума, между которыми располагались многочисленные электронноплотные розетки гранул гликогена. Синусоидальная поверхность была снабжена многочисленными длинными и тонкими микроворсинками и цитоплазматическими выростами, которые погружались в разрыхленные, фрагментированные, лизированные массы коллагеновых фибрилл, разделяя их на фрагменты и втягивая внутрь цитоплазмы. Вдоль синусоидальной поверхности в цитоплазме гепатоцитов были видны многочисленные крупные пузырьки с фрагментами разрыхленного аморфного коллагена. Здесь же располагались электронноплотные первичные лизосомы и расположенные в тесный ряд гипертрофированные митохондрии удлиненной и лопастной формы с плотным матриксом и четкими кристами (рисунок 7). Фагоцитарные вакуоли с коллагеновыми фибриллами были обнаружены в цитоплазме фибробластов и активированных макрофагов (рисунок 8). Последние имели гиалоплазму с мелкими плотными лизосомами и многочисленными вакуолями с хлопьевидным содержимым. Также нами были отмечены многочисленные клетки Ито с характерными липидными каплями.
Рисунок 7 - Морфология
печени после трансплантации СККМ. Гипертрофированные митохондрии вдоль синусоидальной поверхности плазматической мембраны. Электроннограмма
Обсуждение
Трансплантация клеток костного мозга
Рисунок 8 - Морфология
печени после трансплантации СККМ. Коллагеновые волокна в цитоплазме фиброкласта. Электроннограмма
аутологичных стволовых при билиарном циррозе
печени способствовала положительной динамике ее морфологической структуры. Весьма важным было снижение воспалительной инфильтрации, являющейся
опосредованным путем регресса фиброзной ткани. Отмечена регенерация холангиоцитов и усиление ангиогенеза в портальных трактах. И хотя гистологически фибротические изменения печеночной ткани обладали более медленной динамикой регресса по сравнению с воспалительными реакциями, электронномикроскопические данные показали тенденцию к обратному развитию склеротических изменений.
Выводы
Таким образом, трансплантация аутологичных стволовых клеток костного мозга при билиарном циррозе печени снижала степень воспалительной инфильтрации и дистрофических процессов, способствовала регенерации холангиоцитов, обратному развитию склеротических изменений и усилению ангиогенеза в портальных трактах.
Литература:
1. Подымова С.Д.Болезни печени.3 издание. Руководство для врачей М.Медицина.-1998-703 с.
2. Гарбузенко Д.В.Механизмы компенсации структуры и функции печени при ее повреждении и их практическое значение. Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии.2008.-Т.6.-С.14-21
3. Черных Е.Р., Пальцев А.И., Старостина Н.М. и др. Аутологичные клетки костного мозга в комплексном лечении пациентов с хроническими гепатитами и циррозом печени. Гепатология.-2005.-Т1.
4. Gordon M.Y.,Levicar N.,Pai M. et al.Characterization and clinical application of human CD 34+ stem/progenitor cell populations mobilized into the blood by granulocyte colony-stimulating factor.Stem Cells.2006.-24(7).-1822-30
5. Masson S.,Harrison D.J.Plevris J.N. et al.Potential of hematopoietic stem cellstherapy in hepatology:a critical review.Stem Cells .-2004.-22(6)-897-907
6. Fujii H.,Hirose T.,Oe S.et al.Contribution of bone marrow cells to liver regeneration after partial hepatectomy in mice.J.Hepa tol.2002/-36(5)/-653-9
7. Киясов А.П., Одинцова А.Х., Гумерова А.А и др. Трансплантация аутогенных гемопоэтических стволовых клеток больным хроническими гепатитами. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.-2009.-Т3(1).-с.70-75.
