CC BY
29
УДК 612.621.3:616.697-008.6-092
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2018-20-12-14-17
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ГЕНЕРАТИВНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИНТЕРСТИЦИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЯИЧЕК У МУЖЧИН С АЗООСПЕРМИЕЙ
Абаралиев А.К., Чернецова Г.С., Райимбекова Г.К., Колесниченко И.В., Алимов Ч.Б.
МОУВПО «КРСУ Б.Н. Ельцина», г. Бишкек, Кыргызстан Кыргызская государственная медицинская академия им. И.К. Ахунбаева, г. Бишкек, Кыргызстан
Аннотация. Целью исследования явилось изучение морфологической и генеративной характеристики интерстици-альных клеток тестикулярной ткани у мужчин с азооспермией. В настоящее время вопросы мужского бесплодия занимают одно из ключевых вопросов в медицине. Бесплодие у мужчин чаще обусловлено обструктивной и необструк-тивной формами азооспермии. Тяжелые формы олиго-астенотератозооспермии сопровождаются отсутствием оплодотворения in vitro неясного генеза [2, 4]. При нарушении сперматогенеза и блока созревания сперматозоидов на стадиях сперматид, у многих мужчин невозможно получить даже единичные клетки. При синдроме клеток Сертоли, блоке созревания сперматозоидов, евнухоидизме, атрофии канальцев при крипторхизме, синдроме Клайнфельтера шансы обнаружить половые клетки в би-оптате яичка невелики. С внедрением методов вспомогательных репродуктивных технологий стало возможным достижение оплодотворения и беременности с использованием эпидидимальных и тестикулярных сперматозоидов, полученных у мужчин, страдающих обструктивной формой азооспермии, а также при необструктивных формах азооспермии, обусловленной дефектным сперматогенезом [2, 7,10].
В случаях абсолютной азооспермии, подтвержденной несколькими повторными исследованиями центрифугированного эякулята, возможен незначительный локальный сперматогенез в яичках. И даже когда тестикулярная диагностическая биопсия выявляет полное отсутствие сперматогенеза, существует вероятность того, что в некоторых участках могут продуцироваться единичные сперматозоиды или их предшественники. Это говорит о локальном сперматогенезе глубьлежащей тестикулярной ткани. Таким образом, даже при отсутствии сперматогенеза, ин-терстициальные клетки тестикулярной ткани могут обладать значительным стероидогенным потенциалом. Ключевые слова: интерстициальные клетки, азооспермии, тестикулярная ткань, сперматогенез, бесплодие._
THE MORPHOLOGICAL AND GENERATIVE CHARACTERISTIC OF INTERSTICIAL CELLS TESTICLES OF MEN WITH AN AZOOSPERMISM
Abaraliev A.K., Chernetsova G.S., Rayimbekova G.K., Kolesnichenko I. V., Alimov C.B.
Kyrgyz Russian slavic university named after the first president of Russia B.N. Yeltsin, Bishkek, Kyrgyzstan I.K. Akhunbaev Kyrgyz state medical academy, Bishkek, Kyrgyzstan
Annotation. Research objective was to give the morphological and generative characteristic of intersticial cells of testicular tissue of men with an azoosperms. Now male infertility occupies one of key questions in medicine. Infertility of men is more often caused by obstructive and not obstructive forms of an azoo-sperms, severe forms of an oligoastenoteratozoosperms and also lack offertilization of in vitro of not clear genesis [2, 4]. At violation of a spermatogenesis and the block of their maturing at stages of spermatids at some men it is impossible to receive even simple spermatozoon's. At a syndrome only of Sertoli's cells, the maturing block, an eunuchoidism, an atrophy of a canaliculus at a cryptorchism, Klaynfelter's syndrome chances to find spermatozoon's in a biopsy of a testicle are small. With application of methods of auxiliary reproductive technologies achievement of fertilization and pregnancy with use of the epididymidal and testicular spermatozoon's received at the men sufferingfrom an obstructive form of an azoosperms and even at not obstructive forms of the azoosperms caused by the defect spermatogenesis [2, 7,10] became possible.
In cases of the absolute azoosperms confirmed with several repeated researches of a centrifuges ejaculate the slight local spermatogenesis in testicles is possible. And even when the testicular diagnostic biopsy reveals the total absence of a spermatogene-sis, there is a probability that in some sites simple spermatozoon's or their predecessors can be produced. Thus, even in the absence of a spermatogenesis, interstitial cells of testicular fabric can have the considerable steroids potential.
Key words: intersticial cells, azoospermism, testicular tissue, spermatogenesis, sterility.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
[1] Улумбекова Э.Г., Челышева Ю.А.- Гистология. // М., - ГЭОТАР, 1997.- 960 с.
[2] Ендовицкая И.П., Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К. Динамика сперматогенеза у кроликов // Цитология. М, СПБ, 2005.-Т.47.-С.44-48.
[3] Киселева А.Ф., Житников А.Я., Кейсевич Л.В. Мор-фофункциональные методы исследования в норме и патологии // Здоровье, Киев: 1983.- С.164.
[4] Данилова Л.В. Сперматогенез и его регуляция // М.: Наука, 1983.-С.232.
[5] Салех Дж. М. Абу Жаяб. Коррекция андрогенной функцииу экспериментальных животных путем трансплантации нативных и криоконсервированных органных культур семенников. - Дис. ...канд. мед.наук. - Киев, 2004. - 129 с.
[6] Benton L., Shan L.X., Hardy M.P. Differentiation of adult Leydig cells // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. - 1995. -Vol. 53, N1-6.-P. 61-68.
[7] Chen G.R., Ge R.S., Lin H. et al. Development of a cryo-preservation protocol for Leydig cells // Hum. Reprod. -2007.-Vol. 22, N8. - P. 2160-2168.
[8] Keros V., Rosenlund B., Hultenby K. et al. Optimizing cryopreservation of human testicular tissue: comparison of protocols with glycerol, propanediol and dimethyl-sulphoxide as cryoprotectants // Hum. Reprod. - 2005.-Vol. 20, N6.- P. 1676-1687.
[9] Tai J., Tze W.J., Johnson H.W. Cryopreservation of rat Leydig cells for in vitro and in vivo studies // Horm. Metab. Res.-1994.- Vol. 26, N3.- P. 145-147.
[10] Tchoukalova Y.D., Harteneck D.A., Karwoski R.A. et al. A quick, reliable, and automated method for fat cell sizing // J.Lipid Res.- 2003.- Vol. 44, N9.- P. 1795-1801.
REFERENCES
[1] Ulumbekova E.G., Chelysheva Yu.A. - M. Gistology. GE-OTAR, 1997. - 960 pages.
[2] Endovitskaya I.P., Zinovyeva N.A., Ernst L.K. Dynamics of a spermatogenesis at rabbits / Cytology. - 2005. - T.47. - Page 44-48.
[3] Kiselyova A.F., Zhitnikov A.I., Keysevich of L.V. Mor-phofunctional research techniques is normal of pathology / - Health, Kiev: 1983.-Page 164.
[4] Danilova L.V. spermatogenesis and its regulation/. - M.: Science, 1983. - Page 232.
[5] Saleh J.M. Abu Zhayab. Correction androgenic function of the experimental animals by transplantation of native and cryotinned organ cultures spermaries / dis ... cand. of medicine sciences. - Kiev, 2004. - 129 pages.
[6] Benton L., Shan L.X., Hardy M.P. Differentiation of adult Leydig cells // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. - 1995. -Vol. 53, N1-6.-P. 61-68.
[7] Chen G.R., Ge R.S., Lin H. et al. Development of a cryopreservation protocol for Leydig cells // Hum. Reprod. -2007.-Vol. 22, N8. - P. 2160-2168.
[8] Keros V., Rosenlund B., Hultenby K. et al. Optimizing cryopreservation of human testicular tissue: comparison of protocols with glycerol, propanediol and dimethylsulphox-ide as cryoprotectants // Hum. Reprod. - 2005.- Vol. 20, N6.- P. 1676-1687.
[9] Tai J., Tze W.J., Johnson H.W. Cryopreservation of rat Leydig cells for in vitro and in vivo studies // Horm. Metab. Res.-1994.- Vol. 26, N3.- P. 145-147.
[10] Tchoukalova Y.D., Harteneck D.A., Karwoski R.A. et al. A quick, reliable, and automated method for fat cell sizing // J.Lipid Res.- 2003.- Vol. 44, N9.- P. 1795-1801.
Материал и методы исследования. Материалом исследования служит биоптатный материал, полученный у мужчин с азооспермией. При положительной диагностике на наличие сперматозоидов, проводили их дальнейшую криоконсервацию. Остальной биоп-татный материал был исследован на наличие ранних форм сперматозоидов и на получение интерстициаль-ных клеток (клеток Сертоли и Лейдига).
Исследованы биоптаты у 17 мужчин с азооспермией, обратившихся в Национальный Госпиталь МЗ КР по поводу бесплодия на протяжении нескольких лет. После проведения комплекса исследований пациенты были направлены на госпитализацию для проведения интраоперационных методов диагностики и извлечения сперматозоидов методами TESE, MESA.
Первичный биоптат тестикулярной ткани был исследован методом суправитальной микроскопии на наличие сперматозоидов. Микроскопия проводилась в микропланшетах в культуральной среде (Sperm Preparation Medium ORIGIO MediCult). Суспензию клеток интерстиция половых гонад получали после ферментативной обработки ткани и разделения
суспензии клеток в ступенчатом градиенте плотности с использованием сахарозы по методу флотации [2]. После чего была получена фракция клеток плотностью 1,127-1,176 г/см3. Для дальнейшего использования в экспериментах клетки отмывали средой 199 с 20 мМ HEPES (рН 7,4). Культивирование интерстициальных клеток осуществляли в пластиковых чашках NUNC диаметром 2,5 см. Культивирование осуществляли на среде 199 с добавлением 0,1% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотиков (пенициллин - 100 ед/мл и канамицин - 75 мкг/мл) и 20 мМ HEPES (рН 7,2-7,4) при температурном режиме 32-34°C в тече-ние7 суток. Замену питательной среды проводили через сутки.
Изучали сохранность стероидогенных свойств (продукция тестостерона, 3р-гидроксистероиддегид-рогеназная активность, наличие липидных включений). Для гистохимического окрашивания на выявление активности 3р-гидроксистероиддегидрогеназы(3р-ГСД), 2-4*106 клеток инкубировались в 2,5 мл забуфе-ренного физиологического раствора (рН 7,4) и содержащего 0,2 мг/мл нитросинеготетразолия, 1 мг/мл
НАД и 0,12 мг/мл дегидроэпиандростерона в течение 90 мин при 32-34°С. Позитивно окрашенные клетки (ГСД(+) клетки) имели фиолетовую окраску восстановленного тетразолия.
Сохранность клеток контролировали методом су-правитального окрашивания трипановым синим. Ба-зальную и стимулированную секрецию тестостерона исследовали путем инкубации спермальных клеток ин-терстиция в среде 199 с 20 мМ HEPES в течение часа при32-34°С. Как стимулятор стероидогенеза использовали хорионический гонадотропин (ХГ) в концентрации 1 МЕ/мл. Содержание тестостерона измеряли в инкубационной среде радиоиммунологическим методом при помощи наборов «РИА СТ-тестостерон» и рассчитывали на количество клеток в образцах до культивирования.
Для гистологических исследований биоптаты фиксировали в 10% нейтральном формалине. Дегидратацию проводили в спиртах восходящей концентрации. После уплотнений срезов парафином готовили срезы
толщиной 6-7 мкм на санном микротоме. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином и просматривались светооптическим микроскопом под увеличением Х=480.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента и с помощью пакета программ Excel.
Результаты исследования. При морфологическом исследовании отмечалось, что в тестикулярной ткани у мужчин с азооспермией определялись деструктивные изменения сперматогенного эпителия, которые выражались в запустевании извитых семенных канальцев. Адлюминальное пространство содержало набухшие сперматоциты первого и второго порядков. Поддерживающие клетки Сертоли плохо определяются. Наблюдался отек паренхимы яичек. Между извитыми семенными канальцами наблюдали единичные интер-стициальные клетки (гландулоциты) с пикнотичными ядрами (рис. 1. а, б).
а) б)
Рис. 1. а) б) морфологическая картина биоптата. Тестикулярная ткань у мужчин с азооспермией. Наблюдаются
деструктивные изменения базального сперматогенного эпителия. Интерстициальные клетки представлены в незначительном количестве и с пикнотичекими ядрами. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение Х 480.
Данные изменения показали, что при тяжелых формах бесплодия, обусловленном обструктивной и необ-структивной формами азооспермии, наблюдалась атрофия сперматогенного эпителия яичек. При этом, деструктивным изменениям подвергались, в первую очередь, наиболее дифференцированные ярусы спер-матогенного эпителия - формирующиеся сперматозоиды и сперматиды, которые, набухая, сливались в характерные округлые тела, плавающие в просвете канальца. Однако, поскольку нижние слои сперматоген-ного эпителия (сперматогонии и сперматоциты первого порядка) сохраняются более длительно, то восстановление сперматогенеза после прекращения действия повреждающего агента или неблагоприятного фактора вполне возможно.
После ферментативной обработки коллагеназой и центрифугирования в градиенте плотности сахарозы получена первичная культура интерстициальных и спермальных стволовых клеток яичек мужчин. При исследовании тестостерона в среде инкубации установлено его значительное содержание на 3-и сутки культивирования (15,35 нмоль/л) и низкое на 7-е (0,3 нмоль/л), что, по-видимому, связано со снижением уровня холестерина в клетках, который является субстратом для синтеза тестостерона. В состав полученной культуры, кроме стероидогенных клеток, входили клетки других типов. Морфологическое исследование фиксированных на покровных стеклах клеток при культивировании в препаратах показало значительное
4P
количество клеток округлой формы, расположенных по одиночке или группами (рисунок 2 а, б).
4 ш. Г
* Л и •
• - V *
■V %
и
а) б)
Рис. 2. а) морфологическая картина материала после 1 суток культивирования. Субстрат представлен единичными ингерстициальными клетками. Суправитальная окраска трипановым синим. Ув х 320. б) морфологическая картина материала на 7 сутки культивирования. Клетки интерстиция группируются в извитые тяжи. Наблюдаются клетки в состоянии митоза. Суправитальная окраска трипановым синим. Ув х 320.
При исследовании обнаружились небольшие клетки с плотным ядром, окруженным незначительным количеством цитоплазмы, а также крупные овальные клетки с зернистой цитоплазмой и несколькими ядрышками, которые образовывали колонии клеток (рисунок, 2 а). На 7-е сутки формировались длинные извитые тяжи, состоящие из плотноупакованных клеток (рисунок 2 б), и определялись клетки в состоянии митоза. Таким образом, полученные данные в ходе культивирования свидетельствуют о значительном стероидогенном и пролиферативном потенциале ин-терстициальных клеток.
Содержание тестостерона в среде инкубации после стимуляции секреции ХГ составляло 4,5±5,0 нмо ль/1012 клеток, что было также в 2 раза ниже
уровня, установленного до замораживания (5,7±6,0 нмоль/1012 клеток). Это свидетельствует о сохранности клеток, обладающих активностью 3Р-ГСД, которая является одним из маркеров клеток Лейдига.
Выводы. Полученные результаты в ходе исследования тестикулярной ткани у мужчин с азооспермией, свидетельствуют о значительном стероидогенном и пролиферативном потенциале интерстициальных клеток, который может использоваться для сохранения и восстановления мужской фертильности. Пролифера-тивная способность суспензии клеток интерстиция делает предпочтительным использование данного биологического материала в качестве источника андрогенов при культивировании и трансплантации.
